快速检测乙型流感病毒病原体的试剂盒及其应用

文献发布时间：2023-06-19 19:28:50

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及一种快速检测乙型流感病毒病原体的试剂盒及其应用。

背景技术

乙型流感病毒与甲型流感病毒的亲缘关系很近，都属于正粘病毒属，通过基质蛋白(M蛋白)和核蛋白(NP蛋白)的不同来区分。乙型流感病毒不分亚型，根据血凝素的抗原性和基因特征分为2个谱系，即B/Victoria/2/1987谱系和B/Yamagata/16/1988谱系。这两个谱系在上世纪90年代开始共同循环，起初是B/Yamagata系占优势，到了21世纪，B/Victoria逐渐成为优势毒株，在人际间引起多次暴发流行。B/Victoria和B/Yamagata2个谱系间的HA的抗原性有明显差异，两者的抗体交叉保护率低。乙型流感病毒两个谱系间的遗传距离一般在10％左右。但两个谱系间的遗传距离随着时间的推移逐渐增大，提示可能随着时间的推移乙型流感病毒由2个谱系进化为不同的亚型。乙型流感病毒自1940年首次发现以来，一直是单一来源的，几乎只感染人类。虽然在海豹和猪中发现有散在感染，人仍然是乙型流感病毒的主要感染宿主，并持续在人类中存在。

检测乙型流感病毒的方法主要有免疫学检测和核酸检测。免疫学检测主要包括传统免疫学检测和快速免疫学检测，其中传统免疫学检测包括红细胞凝集及凝集抑制试验(HI)、补体结合试验、琼脂免疫扩散试验(AGP)、流感病毒神经氨酸酶活性及其活性抑制试验等。其中HI试验是诊断人类流感病毒感染的血清学常用方法，试验结果较为准确，且无需太多的辅助设备。而快速免疫学检测主要包括胶体金免疫层析(GICA)、酶联免疫吸附(ELISA)、免疫荧光技术(IFA)等，其中疫金标记技术是以胶体金作为示踪标志物，基于抗原抗体反应原理而产生的一种新型免疫标记技术，具有检测速度快、操作简便等特点。

目前，核酸检测的时效性和特异性相对于免疫学检测更好，应用得更为广泛，核酸检测主要包括RT-PCR、实时定量RT-PCR(Real-timePCR)、PCR-RELP、依赖核酸序列的扩增法(NASBA)技术、环介导等温扩增(LAMP)等。其中RT-PCR技术主要为将流感病毒的RNA逆转录为DNA，选定特定引物对特定片段进行扩增，根据目的片段特异度来鉴别流感病毒；实时定量RT-PCR(Real-timePCR)是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测特异度产物的量，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，由于整个检测过程都在封闭管中进行，能有效防止扩增产物的交叉污染，同时确保样本不污染环境，确保实验的准确；PCR-RELP需要先设计合成引物，然后扩增基因，接着利用限制内切酶对扩增出的核酸产物进行切割，由于位点具有严格的特异度，导致核苷酸片段数目和长短不同，在琼脂糖凝胶上形成不同分布来鉴定流感病毒；依赖核酸序列的扩增法(NASBA)技术是一项以RNA为模板的快速等温扩增技术，这项技术特别适用于RNA分子的检测；环介导等温扩增(LAMP)是一种新型核酸扩增技术，其原理是在具有链置换活性的DNA聚合酶作用下，利用能识别目的基因上6个独立区段的4条引物，在60～65℃恒温条件下高效特异地扩增目的基因，在扩增的过程中会产生大量焦磷酸根离子，其与金属离子形成不可溶的盐，生成白色焦磷酸盐沉淀，可直观观察扩增结果。

市面上检测乙型流感的主要方法是RT-PCR，Real-time-PCR等核酸检测技术，采用qPCR技术可以直接检测临床样本，相对于传统的检测手段，即红细胞凝集及凝集抑制试验和琼脂免疫扩散试验、胶体金免疫层析、酶联免疫吸附等，其时效性与特异度较好，但是目前市面上qPCR的检测方法基本上需要1～1.5h左右，导致患者不能及时得到检测，延长患者在医院里的等待时间。

另外，传统免疫学检测仅对已发现的病毒有效，且试验条件繁琐，对实验技术的要求也较为苛刻；快速免疫学检测特异性相对较低，假阳性率也较高；RT-PCR等核酸检测技术特异性较好，但需要其他昂贵的设备进行辅助。

发明内容

本发明旨在提供一种快速检测乙型流感病毒病原体的试剂盒及其应用，以缩短乙型流感病毒病原体的检测时间。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种检测乙型流感病毒病原体核酸的试剂盒。该试剂盒包含乙型流感病原体正向引物SEQ ID NO：1和乙型流感病原体反向引物SEQ ID NO：2。

进一步地，试剂盒还包括乙型流感病原体寡核苷酸探针SEQ ID NO：3；优选的，乙型流感病原体寡核苷酸探针的5’端标记有FAM通道的荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团和/或MGB。

进一步地，荧光报告基团选自FAM、NEX、ROX、TET、TAMRA、JOE、VIC、CY3、CY5或TexasRed。

进一步地，荧光淬灭基团选自BHQ、TAMRA、Eclipse、Dabcyl、Lowa BlackTM RQ或Lowa BlackTM FQ。

进一步地，试剂盒还包含PCR反应液及酶混合液。

进一步地，PCR反应液包括dATPs、dUTPs、dGTPs、dCTPs和dTTPs五种核苷酸、10XBSA、含有镁离子的缓冲液。

进一步地，乙型流感病原体正向引物SEQ ID NO：1、乙型流感病原体反向引物SEQID NO：2和乙型流感病原体寡核苷酸探针SEQ ID NO：3包含在PCR反应液中。

进一步地，酶混合液包括TAQ酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂与热敏UDG酶。

根据本发明的再一方面，提供了一种检测乙型流感病毒病原体核酸的系统。该系统包括：核酸提取装置，设置为用于提取样本核酸；检测装置，包括实时荧光定量PCR分析仪和上述检测乙型流感病毒病原体核酸的试剂盒；数据分析装置，设置为对实时荧光定量PCR分析仪的数据文件进行分析并输出结果。

进一步地，实时荧光定量PCR分析仪为快速实时荧光定量PCR分析仪，设置为45s以内完成每个循环；优选的，实时荧光定量PCR分析仪为超快速实时荧光定量PCR分析仪，设置为23s以内完成每个循环。应用本发明的技术方案，使用本发明的试剂盒及检测方法，可以实现10min完成40个循环的超快速PCR扩增检测，并且检测灵敏度与常规荧光定量PCR技术相当，乙型流感病毒病原体的最低检出限可以达到200copies/mL。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了引物探针筛选实验数据图；

图2示出了引物探针筛选实验数据图；

图3示出了实时荧光定量PCR分析仪P810平台检测灵敏度实验数据；

图4示出了实时荧光定量PCR分析仪P810平台检测灵敏度实验数据；

图5示出了实时荧光定量PCR分析仪P810平台检测特异性检测实验扩增曲线数据；

图6示出了实时荧光定量PCR分析仪P810平台检测精密度实验数据；

图7示出了本申请试剂与圣湘试剂在实时荧光定量PCR分析仪P810平台检测临床样本扩增曲线数据。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

本公司(广东润鹏生物技术有限公司)的超快速实时荧光定量PCR分析仪(型号：P810)，通过该技术可以实现PCR扩增试剂的快速升降温，可在15min内完成40个扩增循环，同时通过实时荧光定量PCR分析仪完成荧光PCR步骤，实现靶标的荧光PCR检测。

本申请的乙型流感病毒病原体核酸检测试剂主要是针对于实时荧光定量PCR分析仪(型号：P810)平台的创新型检测试剂，该平台对于检测靶标的引物探针的设计提出了更高的要求，常规的TaqMan探针设计原理设计出来的引物探针基本上不适合这种实时荧光定量PCR分析仪(型号：P810)平台。针对搭配P810仪器设计引物探针和普通qPCR仪引物探针设计方面主要区别有以下几点：1.引物探针的长度比普通的短3-4bp；2.上下游引物5’端之间的距离-即扩增子总长度，要求比普通的短30-50bp；3.引物和探针之间的距离要求比普通的短0-80bp；4.探针使用MGB标记，普通TaqMan探针不适合，保证扩增的效率，同时保证序列的保守性，无简并位置。本申请针对乙型流感病毒两个谱系——Victoria和Yamagata，设计了特异性引物探针，适配于实时荧光定量PCR分析仪(型号：P810)，可以在保证检测的特异性和灵敏度的基础上实现快速检测出结果。

根据本发明一种优选的实施方式，提供一种检测乙型流感病毒病原体核酸的试剂盒，包括乙型流感病原体正向引物SEQ ID NO：1和乙型流感病原体反向引物SEQ ID NO：2。

其中，检测乙型流感病原体的正向、反向引物和荧光探针序列分别是：

乙型流感病原体正向引物(SEQ ID NO：1)：5'-GAAAGAAAAAGAAGATTCATCACAG-3'；

乙型流感病原体反向引物(SEQ ID NO：2)：5'-AGCYAGAATCAGGCCYTTCTT-3'，Y代表C/T(包含4种反向引物，其比例为1:1:1:1)；

优选的，试剂盒还包括乙型流感病原体寡核苷酸探针1(SEQ ID NO：3)：5'-TATCAGGAATGGGAACAACARCAACA-3'，R代表A/G(2种探针，终浓度比例为1:1)；

在本申请中，针对乙型流感病毒Victoria谱系和Yamagata谱系两种谱系所设计引物探针为通用型。探针的5’端标记有FAM通道的荧光报告基团，例如，3’端标记有MGB和/或荧光淬灭基团。其中，荧光报告基团可以选自FAM、NEX、ROX、TET、TAMRA、JOE、VIC、CY3、CY5或Texas Red；荧光淬灭基团可以选自BHQ、TAMRA、Eclipse、Dabcyl、Lowa BlackTM RQ或LowaBlackTM FQ。也就是说，探针可以采用MGB(Minor GrooveBinder)修饰基团对探针进行进一步改良。探针3’端连接有MGB修饰基团，可以将探针的Tm值提高10℃左右，从而可以加大的加强定量PCR反应过程中的特异性。

为了进一步提高检测的准确性，该试剂盒中还包含阳性质控品和阴性质控品，其中阳性质控品为分别含乙型流感病毒Victoria谱系和Yamagata谱系的特异性保守序列的盔甲RNA、以及人源ACTB基因盔甲RNA混合物。其中阳性质控品提取后产物的浓度约为1.0×10

优选的，阳性质控品含有的乙型流感病毒Victoria谱系特异性保守序列为(SEQID NO：10)：

CTGCTTTTTAAAACCCAAAGACCAGGAAAGAAAAAGAAGATTCATCACAGAGCCCCTATCAGGAATGGGAACAACAGCAACAAAAAAGAAGGGCCTGATTCTAGCTGAGAGAAAAATGAGAAAATGTGTGAGCTTCCATGAAGCATTTGAAATAGCAGAAGGCCATGAAAGCTCAGCGTTACTGTATTGTCTCATGGTCATGTACCTGAATCCTGGAAATTATTCAATGCAAGTAAAACTAGGAACGCTCTGTGCTTTGTGCGAGAAACAAGCATCACATTCACACAGGGCTCATAGCAGAGCAGCGAGATCTTCAGTGCCCGGAGTGAGACGAGAAATGCAGATGGTCTCAGCTATGAACACAGCAAAAACAATGAATGGAATGGGAAAAGGAGAAGACGTCCAAAAACTGGCAGAAGAACTGCAAAGCAACATTGGAGTATTGAGATCTCTGGGGGCAAGCCAAAAGAATGAAGAAGGAATTGCAAAGGATGTAA

阳性质控品含有的乙型流感病毒Yamagata谱系特异性保守序列为(SEQ ID NO：11)：

CTGCTTTTTAAAACCCAAAGACCAGGAAAGAAAAAGAAGATTCATCACAGAGCCCTTATCAGGAATGGGAACAACAGCAACAAAAAAGAAAGGCCTGATTCTGGCTGAGAGAAAAATGAGAAGATGTGTGAGCTTTCATGAAGCATTTGAAATAGCAGAAGGCCATGAAAGCTCAGCGCTACTATACTGTCTCATGGTCATGTACCTGAATCCTGGAAATTATTCAATGCAAGTAAAACTAGGAACGCTCTGTGCTTTGTGCGAGAAACAAGCATCACATTCACACAGGGCTCATAGCAGAGCAGCGAGATCTTCAGTGCCTGGAGTGAGACGAGAAATGCAGATGGTCTCAGCTATGAACACAGCAAAAACAATGAATGGAATGGGAAAAGGAGAAGACGTCCAAAAGCTGGCAGAAGAGCTGCAAAGCAACATTGGAGTGCTGAGATCTCTTGGGGCAAGTCAAAAGAATGGGGAAGGAATTGCAAAGGATGTAA

其中阴性质控品为无菌TE缓冲液，该缓冲液采用分子级水配制，无菌TE缓冲液包括10mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH值8.0。

在本发明一种典型的实施例中，该试剂盒主要包含PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品、酶混合液等4个组分。其中PCR反应液主要包括dATPs、dUTPs、dGTPs、dCTPs、dTTPs等五种核苷酸(浓度比例1：1：1：1：1，终浓度20mM)、用于检测乙型流感病原体的引物(10μM)和荧光探针(10μM)、10X BSA(0.14mg/mL)、含有镁离子的缓冲液(100mM)。酶混合液主要包括TAQ酶(5U/μL)、逆转录酶(200U/μL)、RNA酶抑制剂(40U/μL)与热敏UDG酶(1U/μL)。阳性质控品为分别含乙型流感病毒Victoria谱系和Yamagata谱系的特异性保守序列的盔甲RNA、以及人源ACTB基因盔甲RNA混合物。阴性质控品为无菌TE缓冲液，该缓冲液采用分子级水配制。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种上述检测乙型流感病毒病原体核酸的试剂盒在实时荧光定量PCR分析仪上应用。

优选的，实时荧光定量PCR分析仪为实时荧光定量PCR分析仪P810；更优选的，实时荧光定量PCR分析仪的程序设置如下：

在上述条件下，能够更加准确检测乙型流感病毒病原体核酸。

根据本发明的一典型的实施方式，提供一种检测乙型流感病毒病原体核酸的系统。该系统包括：核酸提取装置，设置为用于提取样本核酸；检测装置，包括实时荧光定量PCR分析仪和上述检测乙型流感病毒病原体核酸的试剂盒；数据分析装置，设置为对实时荧光定量PCR分析仪的数据文件进行分析并输出结果。

优选的，实时荧光定量PCR分析仪为实时荧光定量PCR分析仪P810；更优选的，实时荧光定量PCR分析仪的程序设置如下：

数据分析装置包括质量控制单元和结果判读单元，其中，质量控制单元设置为：以下两个要求在同一次实验中同时满足，否则，输出本次实验无效：

阴性对照：FAM通道，Ct值显示为0，且无明显S型扩增曲线；CY5通道，Ct值显示为0，且无明显S型扩增曲线；

阳性对照：FAM通道，有Ct值且Ct≤35，有明显S型扩增曲线；CY5通道，有Ct值且Ct≤35，有明显S型扩增曲线；

其中，阳性质控品为分别含乙型流感病毒Victoria谱系和Yamagata谱系的特异性保守序列的盔甲RNA、以及人源ACTB基因盔甲RNA混合物。其中阳性质控品提取后产物的浓度约为1.0×10

所述结果判读单元设置为：

当FAM通道有扩增曲线，且Ct值均≤35时判定乙型流感病毒病原体核酸阳性；

当FAM通道无扩增曲线，且Ct值显示为0，CY5通道有扩增曲线且Ct值均≤35时判定乙型流感病毒病原体核酸阴性；

当FAM通道有扩增曲线，35＜Ct值≤40，CY5通道有扩增曲线，且Ct值均≤35时建议重复一次实验，如果结果同上，判定为乙型流感病毒病原体阳性，如果无扩增，判定为乙型流感病毒病原体阴性；

当FAM通道和CY5通道均无扩增曲线，且Ct值显示为0，实验无效、建议更换一批试剂重新实验。

在本申请一具体实施例中，提供一种检测乙型流感病毒病原体核酸的荧光PCR方法，包括：

(1)核酸提取：采用病毒DNA/RNA快速提取试剂(磁珠法)(货号：RK1002)提取样本核酸，提取产物将用于后续的核酸检测；

(2)体系配制：将PCR反应液和酶混合液试剂取出-20℃冰箱，室温融化，涡旋震荡10s，低速离心10s。按比例(8μL PCR反应液/人份+2μL酶混合液/人份)取相应量的PCR反应液和酶混合液，充分混匀，低速离心10s备用；

(3)然后按照10μL每反应进行分装，然后加入5μL上述提取产物，混匀，并按照下列程序进行扩增检测。

实时荧光定量PCR分析仪P810上扩增程序设置见下表：

采用该程序9分钟内可以完成全部扩增。

常规qPCR仪ABI7500上扩增程序设置见下表：

采用该程序90分钟内可以完成全部扩增。

(4)结果分析：

4.1实验结束后保存检测数据文件。

4.2分析条件设置：根据分析后图像调节基线(Baseline)的Start值、End值以及阈值(Threshold)的Value值(用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3-15、End值可以在5-20，调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线)，使仪器给出正确的结果。

(5)质量控制

5.1阴性对照：FAM通道，Ct值显示为0，且无明显S型扩增曲线；CY5通道，Ct值显示为0，且无明显S型扩增曲线；

5.2阳性对照：FAM通道，有Ct值且Ct≤35，有明显S型扩增曲线；CY5通道，有Ct值且Ct≤35，有明显S型扩增曲线；

以上两个要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需要重新进行实验。

(6)结果判读

6.1当FAM通道有扩增曲线，且Ct值均≤35时可判定乙型流感病毒病原体核酸阳性；

6.2当FAM通道无扩增曲线，且Ct值显示为0，CY5通道有扩增曲线且Ct值均≤35时可判定乙型流感病毒病原体核酸阴性；

6.3当FAM通道有扩增曲线，35＜Ct值≤40，CY5通道有扩增曲线，且Ct值均≤35时建议重复一次实验，如果结果同上，可判定为乙型流感病毒病原体阳性，如果无扩增，可判定为乙型流感病毒病原体阴性；

6.4当FAM通道和CY5通道均无扩增曲线，且Ct值显示为0，实验无效、建议更换一批试剂重新实验。

Ct值(cycle threshold，Ct)的定义为：每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。阈值的设定一般是将其设定为恰好可以覆盖住阴性对照和空白对照的荧光值处，因此可以很好的去除反应管荧光值即背景对测试结果的影响。

下面结合具体实施例，进一步详细陈述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1

引物探针的设计

乙型流感病毒基因组由8个单独的单链RNA片段组成，分析这些基因的保守区域，最终决定在编码基质蛋白的M1基因上进行引物探针的设计，设计多组特异性引物探针序列。

在上述引物和探针的设计过程中，尽量选取发卡结构、引物内部二聚体、引物间二聚体以及错配的形成等情况较少的引物探针片段。然后将所设计的引物探针序列在NCBIBlast在线数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上进行比对分析，避免与其他致病菌或人类基因发生非特异结合和扩增。

在常规实时荧光定量PCR仪上进行多轮筛选和优化后，再通过实时荧光定量PCR分析仪进行性能对比确认，最终确定一套灵敏度和特异性最优的引物和探针组合。

表1乙型流感病毒病原体特异性引物和探针序列

为了筛选扩增效率最佳的靶标引物探针组合，本发明合成了以下两个乙型流感病毒谱系的靶基因的目标片段，并将这些序列插入克隆载体，通过单克隆筛选出纯化的含有阳性片段的质粒。再采用盔甲RNA制备技术制作出相应项目的盔甲RNA，使样本更接近真实样本的状态。

其中乙型流感病毒Influenza B virus(Victoria)matrix protein 1(M1)(CY201762.1)，命名为IBV-V(SEQ ID NO：10)：

其中乙型流感病毒Influenza B virus(Yamagata)matrix protein 1(M1)(CY175106.1)，命名为IBV-Y(SEQ ID NO：11)：

采用下列扩增体系配制三组引物探针组合，对比这三组引物探针组合的扩增效率，其中配置表中的5×PCR buffer(货号：MD013)、逆转录酶(货号：MD301)、TAQ酶(货号：MD099)为菲鹏生物研发的自产原料，配制表中的引物探针皆是生工生物进行合成。

表2引物探针组合单重扩增体系表

模板采用上述构建的2种谱系的乙型流感病毒的盔甲RNA的提取产物，将提取后的核酸产物用分子级纯化水分别稀释到原液的1/10

扩增程序采用下表3所示。

表3常规荧光定量PCR仪-ABI7500扩增程序

扩增结果如下表4、表5和表6所示，扩增曲线图如图1、图2所示：

表4三组引物探针组合在ABI7500扩增IBV-V的数据

表5三组引物探针组合在ABI7500扩增IBV-Y的数据

表6三组引物探针组合在ABI7500扩增分子级纯化水的数据

从以上的数据结果分析，组合1的靶标引物探针扩增效果最佳。本发明的后续实施例中采用组合1的靶标引物探针进行。

实施例2

检验方法以及检测体系优化-实时荧光定量PCR分析仪平台P810

为了确定引物探针的检测体系，分别尝试了不同浓度的引物探针对荧光PCR反应的影响。将合成的引物探针干粉按说明稀释成浓度为50μM的工作液，在15μL体系中，引物分别梯度添加0.08μL、0.12μL、0.16μL，探针分别梯度添加0.04μL、0.06μL、0.08μL，作正交实验，以IBV-V的盔甲RNA提取物作为模板，并采用实时荧光定量PCR分析仪P810平台进行验证。

体系配制如下表7：

表7用量调试通用扩增体系表

表8靶标引物探针组合用量调试扩增体系表及用量编号

注：编号1-9为引物3种用量和探针3种用量正交排列组合的9个用量编号。

扩增程序如下：

实时荧光定量PCR分析仪P810上扩增程序设置如下：

扩增结果如下表：

表9引物探针用量调试扩增数据

结果显示，表7扩增体系在搭配使用表8中用量编号2时，扩增效率最好，通过换算，15μL扩增体系中，靶标引物终浓度为400.00nM，探针的终浓度为133.33nM。

实施例3

最低检出限检测-实时荧光定量PCR分析仪平台P810

采用盔甲RNA制备技术制作出相应项目的盔甲RNA，然后使用病毒DNA/RNA快速提取试剂(磁珠法)(货号：RK1002)进行提取，提取产物使用Digital PCR技术(即数字PCR)进行定量，得到相应项目提取产物的浓度。根据已知的浓度将相应的提取产物稀释到合适的浓度后再进行2倍倍比稀释，浓度分别为400copies/mL、200copies/mL、100copies/mL。采用上述确定的检测体系、产品形式以及循环参数对上述提取产物进行检测，扩增结果如表10、表11，扩增曲线图如图3，分别针对合成的2个谱系的浓度为200copies/mL盔甲RNA提取产物进行确认，扩增结果如表12、表13，扩增曲线图如图4。结果表明，本发明的检测方法具有较高灵敏度，灵敏度能够达到200copies/mL。

表10检测体系测试梯度浓度IBV-V盔甲RNA的扩增数据表

表11检测体系测试梯度浓度IBV-Y盔甲RNA的扩增数据表

表12检测体系测试最低检出限浓度IBV-V盔甲RNA的扩增数据表

表13检测体系测试最低检出限浓度IBV-Y盔甲RNA的扩增数据表

实施例4

特异性检测-实时荧光定量PCR分析仪平台P810

本发明采用将甲型流感病毒株(型别：H1N1)、甲型流感病毒株(型别：H3N2)、甲型流感病毒株(型别：H7N9)、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、呼吸道腺病毒(3型)、呼吸道腺病毒(7型)、呼吸道合胞病毒株(B型)与健康人的唾液混合后的样本等作为特异性样本进行检测。

检测结果如图5所示，甲型流感病毒株(型别：H1N1)、甲型流感病毒株(型别：H3N2)、甲型流感病毒株(型别：H7N9)、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、呼吸道腺病毒(3型)、呼吸道腺病毒(7型)、呼吸道合胞病毒株(B型)等检测特异性质控品的检测结果均为阴性，表明本发明的试剂盒能够扩增，且特异性良好。

实施例5

重复性检测-实时荧光定量PCR分析仪平台P810

本发明选取浓度为1×10

检测结果如下表14所示，扩增曲线图如图6所示，经过统计分析，CV值％都小于5％，结果表明本发明的试剂盒和检测方法重复性较好。

表14检测体系测试质粒重复性的扩增数据表

实施例6

真实样本检测

为测试普通设计的引物探针能否适配实时荧光定量PCR分析仪平台P810，采用乙型流感病毒的8例临床样本作为样本，都使用病毒DNA/RNA快速提取试剂(磁珠法)(货号：RK1002)进行提取。将圣湘生物的六项呼吸道病原体核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)(国械注准20213400256)与本申请试剂在同一仪器上进行对比测试，本申请试剂采用上述的乙型流感病毒检测体系进行检测，圣湘生物的六项呼吸道病原体核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)按照其说明书进行试剂配制的操作，两者都采用荧光定量PCR分析仪P810以及P810扩增程序进行扩增，扩增结果如下表15所示，扩增曲线如图7。数据表明，本申请试剂在上P810的扩增效率比圣湘生物的六项呼吸道病原体核检测试试剂盒(PCR-荧光探针法)在P810上的扩增效率更好，说明本发明提供的乙型流感病毒引物探针比普通设计的引物探针更适配实时荧光定量PCR分析仪P810。

表15两种试剂在P810上测试临床样本的扩增数据表

实施例7

本实施例中提供一种具体的试剂盒，包括：PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品、酶混合液等4个组分。PCR反应液主要包括dATPs、dUTPs、dGTPs、dCTPs、dTTPs等五种核苷酸(浓度比例1：1：1：1：1，终浓度20mM)、用于检测乙型流感病原体的引物(10μM)和荧光探针(10μM)、10X BSA(0.14mg/mL)、含有镁离子的缓冲液(100mM)。酶混合液主要包括TAQ酶(5U/μL)、逆转录酶(200U/μL)、RNA酶抑制剂(40U/μL)与热敏UDG酶(1U/μL)。阳性质控品为分别含乙型流感病毒Victoria谱系和Yamagata谱系的特异性保守序列的盔甲RNA、以及人源ACTB基因盔甲RNA混合物。

乙型流感病原体正向引物(SEQ ID NO：1)：5'-GAAAGAAAAAGAAGATTCATCACAG-3'；乙型流感病原体反向引物(SEQ ID NO：2)：5'-AGCYAGAATCAGGCCYTTCTT-3'，Y代表C/T(包含4种反向引物，其比例为1:1:1:1)；乙型流感病原体寡核苷酸探针1(SEQ ID NO：3)：5'-TATCAGGAATGGGAACAACARCAACA-3'，R代表A/G(2种探针，终浓度比例为1:1)；阳性质控品含有的乙型流感病毒Victoria谱系特异性保守序列为(SEQ ID NO：10)：CTGCTTTTTAAAACCCAAAGACCAGGAAAGAAAAAGAAGATTCATCACAGAGCCCCTATCAGGAATGGGAACAACAGCAACAAAAAAGAAGGGCCTGATTCTAGCTGAGAGAAAAATGAGAAAATGTGTGAGCTTCCATGAAGCATTTGAAATAGCAGAAGGCCATGAAAGCTCAGCGTTACTGTATTGTCTCATGGTCATGTACCTGAATCCTGGAAATTATTCAATGCAAGTAAAACTAGGAACGCTCTGTGCTTTGTGCGAGAAACAAGCATCACATTCACACAGGGCTCATAGCAGAGCAGCGAGATCTTCAGTGCCCGGAGTGAGACGAGAAATGCAGATGGTCTCAGCTATGAACACAGCAAAAACAATGAATGGAATGGGAAAAGGAGAAGACGTCCAAAAACTGGCAGAAGAACTGCAAAGCAACATTGGAGTATTGAGATCTCTGGGGGCAAGCCAAAAGAATGAAGAAGGAATTGCAAAGGATGTAA；阳性质控品含有的乙型流感病毒Yamagata谱系特异性保守序列为(SEQ ID NO：11)：CTGCTTTTTAAAACCCAAAGACCAGGAAAGAAAAAGAAGATTCATCACAGAGCCCTTATCAGGAATGGGAACAACAGCAACAAAAAAGAAAGGCCTGATTCTGGCTGAGAGAAAAATGAGAAGATGTGTGAGCTTTCATGAAGCATTTGAAATAGCAGAAGGCCATGAAAGCTCAGCGCTACTATACTGTCTCATGGTCATGTACCTGAATCCTGGAAATTATTCAATGCAAGTAAAACTAGGAACGCTCTGTGCTTTGTGCGAGAAACAAGCATCACATTCACACAGGGCTCATAGCAGAGCAGCGAGATCTTCAGTGCCTGGAGTGAGACGAGAAATGCAGATGGTCTCAGCTATGAACACAGCAAAAACAATGAATGGAATGGGAAAAGGAGAAGACGTCCAAAAGCTGGCAGAAGAGCTGCAAAGCAACATTGGAGTGCTGAGATCTCTTGGGGCAAGTCAAAAGAATGGGGAAGGAATTGCAAAGGATGTAA；阴性质控品为无菌TE缓冲液，该缓冲液采用分子级水配制，无菌TE缓冲液包括10mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH值8.0；

实施例8

本实施例中提供一种检测乙型流感病毒病原体核酸的系统。该系统包括：核酸提取装置，设置为用于提取样本核酸；检测装置，包括实时荧光定量PCR分析仪和上述检测乙型流感病毒病原体核酸的试剂盒；数据分析装置，设置为对实时荧光定量PCR分析仪的数据文件进行分析并输出结果。

实时荧光定量PCR分析仪为实时荧光定量PCR分析仪P810；实时荧光定量PCR分析仪的程序设置如下：