一种双酶偶联产N-乙酰神经氨酸的高通量筛选方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种双酶偶联产N-乙酰神经氨酸的高通量筛选方法。

背景技术

N-乙酰葡萄糖胺异构酶是催化N-乙酰葡萄糖胺生成N-乙酰甘露糖胺的酶，N-乙酰甘露糖胺是生产N-乙酰神经氨酸的中间体。利用N-乙酰葡萄糖胺异构酶催化合成N-乙酰神经氨酸，反应条件温和，绿色环保且无污染物生成，在生物催化和生物医药领域都有广泛的应用。

新型酶的发现可以通过自然突变的方法筛选得到，但是这种方法效率低、目标性较差，需建立快速高效的新方法。利用分子技术，筛选获得新型的N-乙酰葡萄糖胺异构酶。用分子改造的方法对现有的酶进行突变时，通常会形成数量巨大的文库，从而高通量检测方法成为筛选时的关键方法。目前使用较普遍的筛选方法为高效液相色谱(HPLC)，液相检测结果准确，但对于高通量筛选而言，其耗时较长，不利于筛选。

因此，开发一种双酶偶联产N-乙酰神经氨酸的高通量筛选方法对N-乙酰葡萄糖胺异构酶的定向进化具有指导意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种双酶偶联产N-乙酰神经氨酸的高通量筛选方法，具体的是利用N-乙酰葡萄糖胺与N-乙酰葡萄糖胺异构酶生成中间体N-乙酰甘露糖胺，再将N-乙酰甘露糖胺和丙氨酸通过N-乙酰神经氨酸裂合酶生成的N-乙酰神经氨酸的96孔板检测筛选方法。

本发明的原理是利用间苯二酚显色反应是酮糖特有的反应。单糖能够与浓的硫酸、盐酸作用，脱水，从而形成糠醛或者糠醛的衍生物，在一定条件下糠醛及其衍生物能够与酚类，蒽酮类等缩合，生成各种有颜色的物质。通过间苯二酚与N-乙酰神经氨酸在特定条件下结合生成络合物，然后通过酶标仪在特定波长580nm条件下检测其吸光，颜色由无色变为紫色，将其运用于高通量筛选。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种双酶偶联产N-乙酰神经氨酸的高通量筛选方法，包括如下步骤：

(1)分别构建表达N-乙酰葡萄糖胺异构酶和N-乙酰神经氨酸裂合酶的基因工程菌，并通过体外诱导表达分别收集N-乙酰葡萄糖胺异构酶和N-乙酰神经氨酸裂合酶的菌体；

(2)在离心管中分别加入底物N-乙酰葡萄糖胺、丙酮酸钠、步骤(1)得到的N-乙酰神经氨酸裂合酶和tritonx-100，然后再加入步骤(1)得到的N-乙酰葡萄糖胺异构酶混合均匀；

(3)将步骤(2)混合均匀的离心管置于高通量摇床中反应，离心收集上清液，即为含有N-乙酰神经氨酸的反应液，将反应液进行液相检测；

(4)将步骤(3)获得的反应液稀释，再加入显色剂在96深孔板中水浴反应后，转入酶标板中测定580nm吸光度，并根据吸光度数值及N-乙酰神经氨酸标准曲线检测N-乙酰神经氨酸的产量。

其中，步骤(1)中，所述的构建表达N-乙酰葡萄糖胺异构酶的基因工程菌，序列来自于Anabaena sp.CH1中的anAGE基因。

其中，步骤(1)中，所述的构建表达N-乙酰神经氨酸裂合酶的基因工程菌，序列来自于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的N-acetylneuraminic acid lyase，即CgNal基因。

其中，步骤(1)中，所述的N-乙酰葡萄糖胺异构酶为anAGE基因经密码子优化后所得，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

其中，步骤(1)中，所述的N-乙酰神经氨酸裂合酶为CgNal基因经密码子优化后所得，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

其中，步骤(1)中，所述的N-乙酰葡萄糖胺异构酶和N-乙酰神经氨酸裂合酶的基因工程菌，是以pET28a为载体，大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)为表达宿主的。

其中，步骤(1)中，所述的体外诱导表达是将N-乙酰葡萄糖胺异构酶或N-乙酰神经氨酸裂合酶的基因工程菌接入50mL离心管中，其中每管添加20μL含终浓度50mg/L卡纳霉素与30mg/L氯霉素的LB培养基，于25-40℃过夜培养10-20h后，再转接至250mL摇瓶添加250μL含终浓度50g/L卡纳霉素与30mg/L氯霉素的TB培养基，当OD

其中，步骤(2)中，所述的底物，其添加量为：80-160g/L N-乙酰葡萄糖胺、30-100g/L丙酮酸钠、30-60g/L N-乙酰神经氨酸裂和酶和1-10‰tritonx-100；所述的N-乙酰葡萄糖胺异构酶，其添加量为30-60g/L。

优选的，步骤(2)中，所述的底物，其添加量为：120g/L N-乙酰葡萄糖胺、70g/L丙酮酸钠、50g/L N-乙酰神经氨酸裂和酶和1‰tritonx-100；所述的N-乙酰葡萄糖胺异构酶，其添加量为50g/L。

其中，步骤(3)中，所述的置于高通量摇床中反应，其反应条件为：20-50℃，200-500rpm条件下反应1-18h；所述的离心，其条件为：4-20℃，3000-4000rpm离心5-20min。

优选的，步骤(3)中，所述的置于高通量摇床中反应，其反应条件为：20-50℃，200-500rpm条件下反应18h；所述的离心，其条件为：4℃，3600rpm离心10min。

其中，步骤(4)中，所述的稀释，其稀释浓度是根据反应液液相检测结果和N-乙酰神经氨酸标准曲线溶液浓度进行估算的。

具体的，步骤(4)中，所述的稀释，稀释至终浓度0-0.5mM；优选的稀释浓度为0.355mM(0.11mg/mL的N-乙酰神经氨酸标准曲线溶液浓度与0.355mM的N-乙酰神经氨酸反应液浓度基本一致)，即在进行N-乙酰神经氨酸检测时，只需将反应液稀释至0.355mM左右就可对突变菌高通量快速进行筛选，专一性和准确性高。

其中，步骤(4)中，所述的水浴反应，其条件为：95℃条件下反应0-40min；优选的条件为95℃水浴25min。

其中，步骤(4)中，所述的显色剂包括间苯二酚、浓盐酸，硫酸铜，其制备方法为：间苯二酚0.1g，溶解在5mL水中,并加入40mL浓盐酸，0.125mL 0.1mol/L的硫酸铜，用水定容到50mL，棕色瓶配置。

其中，步骤(5)中，所述的水浴反应结束，冷却后加入有机相震荡2-15min，再转入酶标板检测。

优选的，冷却后加入有机相震荡10min。

具体的，所述的有机相为丁酸丁酯和正丁醇的混合液，其体积比为17：3。

有益效果：与现有技术相比，本发明公开了一种双酶偶联产N-乙酰神经氨酸的高通量筛选方法，本方法利用显色液将酶催化反应生成的N-乙酰神经氨酸，由无色快速转变为紫色，且于580nm处产生吸光值的变化这一特点。通过高通量筛选发现，在进行N-乙酰神经氨酸检测时，只需将反应液稀释至0.355mM左右就可对突变菌高通量快速进行筛选，具有操作简单、成本低廉、检测准确等特点，同时专一性和准确性高，且不加有机相更加简单、绿色，降低了成本，适合N-乙酰葡萄糖胺异构酶定向进化的大规模高通量筛选工作。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1为N-乙酰神经氨酸标准曲线图。

图2为N-乙酰神经氨酸(去有机相)标准曲线图。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中，所述的显色剂，其制备方法为：间苯二酚0.1g，溶解在5mL水中,并加入40mL浓盐酸，0.125mL 0.1mol/L的硫酸铜，用水定容到50mL，棕色瓶配置。

下述实施例中，所述的液相检测N-乙酰神经氨酸，其方法为：流动相5mM H2SO4；洗脱液5mM H2SO4；流速0.4mL/min；色谱柱温度55℃；检测时间30min；进样量20μl；紫外检测器(VWD)；色谱柱为Bio-Rad Aminex HPX-87H(300×7.8mm)。

实施例1N-乙酰葡萄糖胺异构酶的诱导表达

(1)构建表达N-乙酰葡萄糖胺异构酶的基因工程菌：根据Anabaena sp.CH1中的anAGE基因序列，运用软件Gene Designer 2.0，根据宿主细胞的密码子偏好性将该DNA序列优化。

全基因合成上述DNA序列，获得质粒Top10-anAGE，以质粒Top10-anAGE为模板，利用引物对anAGE-T1和anAGE-B1进行PCR，扩增得到1167bp产物，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

其中，所述的引物anAGE-T1，其核苷酸序列为(SEQ ID No.3)：TCGACAAGCTTGCGGCCGCATGGGAAAAAACTTGCAGG；所述的引物anAGE-B1，其核苷酸序列为(SEQ ID No.4)：TGGTGGTGGTGCTCGAGTTAGGACAAGGCTTCAAATTGTTGCC。

其中，PCR反应条件为：300ng质粒Top10-anAGE，60ng引物(anAGE-T1+anAGE-B1)，5μL 10x缓冲液，4μl 2.5mM dNTP，1μL PrimerStar聚合酶(TaKaRa公司)，用无菌水调反应体积至50μL。

其中，PCR反应扩增程序为：95℃5分钟，30个循环：94℃30秒、55℃30秒和72℃1.5分钟，最后72℃10分钟。

扩增反应得到N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因，通过1％(1g琼脂糖置于100mL 1×TBE，微波炉加热至沸腾加入10μL GelRed染料，凝固后制得凝胶)琼脂糖电泳，利用DNA凝胶回收试剂盒(TaKaRa公司)提纯PCR产物，分离纯化大小为1167bp的片段，经XhoI和NotI(TaKaRa公司)酶切后以T4DNA连接酶(TaKaRa公司)连接至pET28a载体(TaKaRa公司)，获得重组质粒pET28a-anAGE。将该重组质粒用热传法转化入大肠杆菌表达宿主E.coli Rosetta(DE3)，在含34mg/L氯霉素和20mg/L卡那霉素的LB平板上37℃培养，得到N-乙酰葡萄糖胺异构酶的表达菌株pET28a-anAGE-E.coli Rosetta(DE3)。

(2)体外诱导表达：将N-乙酰葡萄糖胺异构酶的表达菌株pET28a-anAGE-E.coliRosetta(DE3)接入50mL离心管中，其中每管添加20μL含终浓度50mg/L卡纳霉素与30mg/L氯霉素的LB培养基，于25-40℃过夜培养10-20h后，再转接至250mL摇瓶添加250μL含终浓度50g/L卡纳霉素与30mg/L氯霉素的TB培养基，当OD

实施例2：N-乙酰神经氨酸裂合酶的诱导表达

(1)构建表达N-乙酰神经氨酸裂合酶的基因工程菌：根据谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的N-acetylneuraminic acid lyase(CgNal)，运用软件Gene Designer 2.0，根据宿主细胞的密码子偏好性将该DNA序列优化。

全基因合成上述DNA序列，获得质粒Top10-CgNal，以质粒Top10-CgNal为模板，利用引物对CgNal-T1和CgNal-B1进行PCR，扩增得到939bp产物，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

其中，所述的引物CgNal-T1，其核苷酸序列为(SEQ ID No.5)：TCGACAAGCTTGCGGCCGCATGGCTTCCGCAACTT；所述的引物CgNal-B1，其核苷酸序列为(SEQ ID No.6)：TGGTGGTGGTGCTCGAGTTAAGCGGTGTACAGGAATTC。

其中，PCR反应条件为：300ng质粒Top10-CgNal，60ng引物(CgNal-T1+CgNal-B1)，5μL 10x缓冲液，4μl 2.5mM dNTP，1μL PrimerStar聚合酶(TaKaRa公司)，用无菌水调反应体积至50μL。

其中，PCR反应扩增程序为：95℃5分钟，30个循环：94℃30秒、55℃30秒和72℃1.5分钟，最后72℃10分钟。

扩增反应得到N-乙酰神经氨酸裂合酶基因，通过1％(1g琼脂糖置于100mL 1×TBE，微波炉加热至沸腾加入10μL GelRed染料，凝固后制得凝胶)琼脂糖电泳，利用DNA凝胶回收试剂盒(TaKaRa公司)提纯PCR产物，分离纯化大小为939bp的片段，经XhoI和NotI(TaKaRa公司)酶切后以T4DNA连接酶(TaKaRa公司)连接至pET28a载体，获得重组质粒pET28a-CgNal。将该重组质粒用热传法转化入大肠杆菌表达宿主Rosetta(DE3)，在含34mg/L氯霉素和20mg/L卡那霉素的LB平板上37℃培养，得到N-乙酰神经氨酸裂合酶的表达菌株pET28a-CgNal-E.coli Rosetta(DE3)。

(2)体外诱导表达：将N-乙酰神经氨酸裂合酶的表达菌株pET28a-CgNal-E.coliRosetta(DE3)接入50mL离心管中，其中每管添加20μL含终浓度50mg/L卡纳霉素与30mg/L氯霉素的LB培养基，于25-40℃过夜培养10-20h后，再转接至250mL摇瓶添加250μL含终浓度50g/L卡纳霉素与30mg/L氯霉素的TB培养基，当OD

实施例3：10mL离心管中制作N-乙酰神经氨酸标准曲线

(1)分别吸取0.11mg/mL N-乙酰神经氨酸标准溶液0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL于试管中，加水到2mL；

(2)再分别吸取0.7mg/mL N-乙酰葡萄糖胺、0.391mg/mL丙酮酸钠和0.7mg/mL N-乙酰甘露糖胺溶液1mL于试管中，加水到2mL；

(3)分别向步骤(1)和步骤(2)的试管中加入2mL显色剂，95℃水浴25min；

(4)流水冷却后再分别加入4mL丁酸丁酯和正丁醇的混合液(丁酸丁酯和正丁醇体积比17：3)，剧烈震荡；

(5)冰水冷却10min，1000rpm离心5min，将有机相转入1cm比色杯中；

(6)以未加入样品显色剂的为对照，在580nm处测吸光度。

实验结果如下表1和表2所示，即N-乙酰神经氨酸标准曲线如图1所示。

表1N-乙酰神经氨酸标准溶液加样量及对应吸光度

表2N-乙酰葡萄糖胺、丙酮酸钠和N-乙酰甘露糖胺加样量及对应吸光度

从结果中可以看出，间苯二酚显色法检N-乙酰神经氨酸标准曲线呈线性，且N-乙酰葡萄糖胺、丙酮酸钠、N-乙酰甘露糖胺的吸光度接近0，不影响N-乙酰神经氨酸检测。

实施例4：对含有N-乙酰神经氨酸的反应液快检测试

在50mL离心管中分别加入底物120g/L N-乙酰葡萄糖胺、70g/L丙酮酸钠、50g/LN-乙酰神经氨酸裂和酶和1‰tritonx-100，然后再分别加入50g/L N-乙酰葡萄糖胺异构酶样品与50g/L无酶空菌样品pET28a/E.coli Rosetta(DE3)(TaKaRa公司)的酶液。在高通量摇床中，20-50℃，200-500rpm条件下反应18h后，4℃，3600rpm离心10min，收集上清液即为含有N-乙酰神经氨酸的反应液，将反应液进行液相检测。将反应液稀释140倍，稀释至终浓度为0.355mM左右，吸取1mL稀释的反应液加水补充至2mL；加2mL显色剂，95℃水浴25min；流水冷却后加入4mL丁酸丁酯和正丁醇的混合液(丁酸丁酯和正丁醇体积比17：3)，剧烈震荡；冰水冷却10min，将有机相转入酶标板检测：加入N-乙酰葡萄糖胺异构酶的反应液产物吸光度为0.7934nm，加入无酶空菌样品pET28a/E.coli Rosetta(DE3)的反应液吸光度基本为0。

分析可得：将吸光度0.7934nm代入实施例3中制作的标准曲线，得间苯二酚检测N-乙酰神经氨酸为123.2mg/mL，因为同时采用液相检测N-乙酰神经氨酸为135mg/mL，两者差距较小，因此可以使用间苯二酚检测N-乙酰神经氨酸。

实施例5：96孔板体系建立N-乙酰神经氨酸标准曲线(去有机相)

将实施例3的10mL快检体系缩小5倍放置于96孔板中进行高通量筛选。在实验中，我们发现96孔板检测N-乙酰神经氨酸用有机相萃取时，有时会出现萃取不完全的情况，而萃取的目的就是将N-乙酰神经氨酸浓缩于有机相中。因此只要N-乙酰神经氨酸均匀存在于反应液中，便可尝试去有机相进行N-乙酰神经氨酸标准曲线的制作，所以实施例3去除有机相快检反应检测，建立标准曲线。

在96孔板上进行N-乙酰神经氨酸检测：标准曲线流程同实施例3，体系缩小5倍且不加有机相。

反应时间25min，剧烈震荡并不加有机相萃取，将N-乙酰神经氨酸直接测吸光度，进行标准曲线制作，结果如表3所示，N-乙酰神经氨酸标准曲线如图2所示。

表3N-乙酰神经氨酸标准溶液加样量及对应吸光度(去有机相)

由实验结果可知，没有添加有机相进行萃取，间苯二酚显色法检测N-乙酰神经氨酸标准曲线仍呈线性。

实施例6：对含有N-乙酰神经氨酸的反应液快检测试(去有机相)

在50mL离心管(离心管中进行产N-乙酰神经氨酸的反应要比96孔板反应更充分，产量更多，所以选择在离心管中反应产生反应液，在检测筛选突变菌时使用96孔板反应)中加入底物120g/L N-乙酰葡萄糖胺、70g/L丙酮酸钠、50g/L N-乙酰神经氨酸裂和酶和1‰tritonx-100，然后再分别加入50g/L N-乙酰葡萄糖胺异构酶样品与50g/L无酶空菌样品pET28a/E.coli Rosetta(DE3)的酶液，在高通量摇床中，在20-50℃，200-500rpm条件下反应18h后，再4℃，3600rpm离心10min，所得上清液即为含有N-乙酰神经氨酸(去有机相)的反应液，将反应液进行液相检测。

将反应液稀释140倍，稀释至终浓度为0.355mM左右，放入96孔板反应检测(三组平行)。加入显色剂，在95℃水浴反应25min，反应过后，将快检反应液取至酶标板，酶标仪标580nm处测定其吸光度，加入无酶空菌样品pET28a/E.coli Rosetta(DE3)的反应液吸光度基本为0，加入N-乙酰葡萄糖胺异构酶样品的反应液，其结果如表4所示。

表4稀释反应液的快检吸光度表

从表4可以得出，稀释140倍的反应液，其平均吸光度为0.2107nm。将其代入实施例5去有机相的标准曲线，以稀释140倍的反应液去计算未稀释的反应液中N-乙酰神经氨酸含量130.25mg/mL。而未稀释的反应液采用液相检测N-乙酰神经氨酸含量为136mg/mL。可以发现，标准曲线在越靠近140倍样品稀释后的反应上的检测范围左右，准确度越高。

综上，在进行N-乙酰神经氨酸检测时，只需将反应液稀释至0.355mM左右就可对突变菌高通量快速进行筛选，专一性和准确性高，且不加有机相更加简单、绿色，降低了成本。

本发明提供了一种双酶偶联产N-乙酰神经氨酸的高通量筛选方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。