一种基于microRNA制备诱导性多能干细胞的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种基于microRNA制备诱导性多能干细胞的方法。

背景技术

诱导性多能干细胞（iPSCs）技术是通过向终末分化细胞导入特定的转录因子，通过特定基因的表达将体细胞逆转为多能干细胞，使其具备类似于胚胎干细胞的全能性及无限增殖特性。

iPSCs技术开发早期多采用整合病毒载体介导来实现上述细胞逆转过程。最初使用“逆转录酶病毒”为载体向体细胞中植入几种转录因子基因，通过这些转录因子表达对细胞实现基因重编程，最终获得iPS细胞。而这种方法的缺陷是增加了宿主细胞基因组不稳定性风险，有可能会由于外源基因插入细胞基因组，而干扰了内源基因的表达，从而诱发癌症。慢病毒载体(LV)比逆转录病毒载体更有效，它具有广泛的亲和性，重编程效率高达0.1-1%，但同样，此策略的安全性有待提高。

随着iPS技术不断发展，以及人们对其衍生的细胞产品用于药物开发及临床应用的迫切期望，科学家们正在积极的通过不同策略开发安全性更高的iPSCs诱导技术，以达到有效治疗应用的安全性和产品质量标准要求。目前已开发出的安全性更高的iPS技术策略分为通过病毒、非病毒方法介导的非整合转移系统重编程。

目前，腺病毒等非整合病毒载体介导的重编程技术已成功开发，大量数据证明此方法未造成宿主基因组中外源DNA插入。然而，目前非整合病毒载体传递方法的重编程效率仅限于0.001%。另一种替代方法是使用负性单链RNA仙台病毒(Se-V)，因为它在许多类型的细胞和组织中导入外源基因非常有效。然而，这种方法受到了低重编程效率的阻碍。

非病毒方法主要包括：质粒法、化学小分子法、miRNA法等。质粒法是目前临床研究中使用较普遍的方法，利用质粒替代了传统的病毒载体，将转录因子基因导入细胞内部，但仍存在整合及外源基因残留风险，且重编程效率低等问题。为降低外源基因残留风险，通常需多次传代筛选来去除质粒残留，耗时耗力，同时增加了筛选成本。化学小分子法和miRNA法不涉及基因编辑等过程，无基因整合风险，是未来临床应用最有希望的技术策略，但二者诱导效率不理想，较慢病毒载体(LV)诱导率低5-10倍。其中，化学小分子法突出优势为添加过程简单，但单独使用诱导效率较低，目前已报道的成功案例不多，通常与其他方法联用以提高诱导效率。microRNA法也属于小分子法，目前通常以脂质体包裹后电转方式递送至细胞内，科学家们已通过研究证明此策略的可行性。其中有文献报道miR-291-3p、miR-294和miR-295被用来代替c-Myc来产生同质的人类iPSC。此外，有研究表明miRNA 302/367在不使用转录因子的情况下成功将小鼠和人类体细胞重编程为iPSCs。目前已有报道的调控体细胞重编程的miRNA家族主要包括miR-302/367家族、miR-200家族、miR-290/295家族、miR-34家族，此方法现有报道诱导效率为0.4-0.7%，但后续报道研究及应用报道较少，推测其原因micRNA调控下游基因通常为一对多的复杂性，导致结果的不确定性和不稳定性。基于microRNA法的低风险性以及已报到的大量技术可行性数据，其被公认为是针对未来临床应用产品最具前景的iPS诱导技术，但目前提升此方法的诱导效率仍为攻坚难点。

综上所述，现有主流游离型质粒或病毒介导iPS诱导技术存在的主要问题：（1）诱导过程繁琐，需要构建基因序列、制备病毒或质粒载体，同时增加了外源物质引入风险、全过程质控难点及成本，不利于技术未来产业化。（2）诱导技术的实现过程是间接，即先将基因导入细胞内，此过程无法控制每个细胞转染效率及程度的均一性，致使不同细胞中外源基因表达存在差异，进而影响这些转录因子与细胞基因组作用效果，最终导致得到的iPS细胞株个体差异较大，增加了筛选成本及时间，看似诱导效率较高，但实际最终得到的优质目的细胞株较少。（3）诱导技术最致命的缺点还是对细胞有致畸可能性，致使未来临床使用存在风险隐患。此外，化学小分子介导的iPS诱导技术现有的添加物组合诱导效率极低。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种基于microRNA制备诱导性多能干细胞的方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

本发明的第一方面，提供了一种制备诱导性多能干细胞的microRNA组合物，包括miR-195-5p、miR-211-5p、miR-520c-3p、miR-30e-5p、miR-519d-3p、miR-32-5p中的至少一种。

在本发明的一些实施例中，所述microRNA组合物中至少含有miR-195-5p、miR-211-5p、miR-520c-3p、miR-30e-5p、miR-519d-3p、miR-32-5p中的三种。

一种基于上述microRNA组合物制备诱导性多能干细胞的方法，包括如下步骤：

S1：培养贴壁细胞；

S2：将microRNA组合物转染至培养后的贴壁细胞；

S3：将持续转染后发生形变的克隆细胞团进行克隆挑取，传代培养，获得诱导性多能干细胞。

在本发明的一些实施例中，所述步骤S2中培养体系中microRNA组合物的终浓度不超过200nM。

在本发明的一些实施例中，所述步骤S2中培养体系中每种microRNA的物质的量均等。

在本发明的一些实施例中，所述步骤S2中的microRNA组合物装载至脂质体或外泌体后进行转染。

在本发明的一些实施例中，所述步骤S2中的转染次数至少4次。

在本发明的一些实施例中，所述步骤S3中转染后的细胞传代三次以上得到诱导性多能干细胞。

在本发明的一些实施例中，所述步骤S3中转染后的细胞培养2-3天，细胞融合度达到60-70%进行重复传代。

在本发明的一些实施例中，所述贴壁细胞为间充质干细胞、血管内皮细胞或内皮祖细胞。

相对于现有技术，本发明具有以下优势：

（1）本发明克服了传统技术的安全性问题，完全不涉及基因编辑。

（2）本发明通过miRNA小分子对细胞进行短时转录调节便达到重编程效果，细胞作用效果相对均一，筛选效率高。

（3）本发明的方法操作过程简单，外源物质引入极少，且成分简单，便于质控。

（4）本发明的方法与现有miRNA诱导技术相比诱导率得到显著提升，与其他诱导技术联用会明显提升原有方法诱导效率。

附图说明

图1为对照组和组1-组13获得诱导性多能干细胞传代5次后的细胞形态图；

图2为对照组和组1获得诱导性多能干细胞传代5次后的表型检测图；

图3为组2和组3获得诱导性多能干细胞传代5次后的表型检测图；

图4为组4和组5获得诱导性多能干细胞传代5次后的表型检测图；

图5为组6和组7获得诱导性多能干细胞传代5次后的表型检测图；

图6为组8和组9获得诱导性多能干细胞传代5次后的表型检测图；

图7为组10和组11获得诱导性多能干细胞传代5次后的表型检测图；

图8为组12和组13获得诱导性多能干细胞传代5次后的表型检测图。

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面结合实施例来详细说明本发明。

1、试验方法

（1）miRNA递送（试验组）

1.1 细胞准备

以每平方厘米10000个间充质干细胞种到T75培养瓶中，待3-4天后细胞长满，可消化进行传代铺板。吸出上清至新的50mL离心管待用，加入15ml DPBS清洗皿底一次，弃掉洗液；加入2mL Tryple Express，晃动培养瓶使Tryple均匀地覆盖培养瓶底部，置于37℃培养箱中消化3-5分钟，待细胞从瓶底脱落，则加入培养上清结束消化。收集细胞悬液，300g 离心5分钟；弃掉上清液，加入适量完全培养基重悬计数。按照每孔2×10

1.2 miRNA转染（可通过脂质体或外泌体装载后递送，此处以脂质体为例）

铺板后24-36小时内转染，转染前给细胞换液：每孔2 mL 完全培养基（mTeSR-E7）。每组转染体系单独配制，各准备2个1.5 mL离心管，按表1配制。将管2液体加入管1中，充分混匀，室温静置10分钟。吸取混合液加入更换了培养基的细胞中，前后左右晃动6孔板混匀。37 ℃培养箱培养。转染后，12-24h后换液，后续每天换液。铺板算D0，于D1，D4，D7，D11转染3至4次。第四天以相同步及条件骤进行第二次转染，转然后第三天换液，第四天重复第三次转染，转染后第三天换液，第四天再次重复转染。培养至第十五天时更换mTeSR™1培养基。

表1 各组的转染体系配置

注：表1中，M1代表 miR-195-5p；M2代表miR-211-5p；M3代表miR-520c-3p；M4代表miR-30e-5p；M5代表miR-519d-3p；M6代表miR-32-5p，各组microRNA的浓度均为20µM。试剂I使用的是Opti-MEM I；转染试剂使用的是Lipofectamine Stem reagent，溶剂I使用的是Opti-MEM I。

1.3质粒递送（对照组）

用文献报道的现有的诱导效率相对较高、使用较为广泛的经典三质粒法作为对照组。使用的商品化质粒为pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSKp、CXLE-hUL。

1.3.1 细胞准备

以每平方厘米10000个细胞接种到T75培养瓶中，待3-4天后时细胞长满，可消化进行传代铺板。吸出上清至新的50mL离心管待用，加入15ml DPBS清洗皿底一次，弃掉洗液；加入2mL Tryple Express，晃动培养瓶使Tryple均匀地覆盖培养瓶底部，置于37℃培养箱中消化3-5分钟，待细胞从瓶底脱落，则加入培养上清结束消化。收集细胞悬液，300g 离心5分钟；弃掉上清液，加入适量完全培养基重悬计数。吸取1×10

1.3.2 质粒转染

配制电转液：20 μL EL电转缓冲液 + 1 μg pCXLE-hOCT3/4-shp53-F质粒 + 0.5μg pCXLE-hSK质粒 + 0.5 μg pCXLE-hUL质粒吹打混匀。

用配制好的电转液（含质粒）重悬上述细胞，用巴氏吸管吸取细胞悬液加入电极杯中，确保没有气泡，将电极杯放入基座中；Celetrics电转仪开机后选择Legacy，设置电压为560V，时间为20ms；取25ul细胞缓缓加入至电转杯，扣紧盖子，将电转杯放入仪器槽内，启动电流。电击结束后，向电击杯中加入200 μL对应培养基，用巴氏吸管吸出全部细胞悬液至1.5 mL离心管内，再次加入200 μL培养基冲洗一次电击杯，用巴氏吸管吸入同一个1.5mL管中，混匀，取20 μL计数。向Matrigel或Vitronectin包被6孔板孔中加入1 mL完全培养基。每孔铺2.8×10

1.3.3 细胞换液

电转后24小时将细胞培养基更换为mTeSR-E7培养基。

1.3.4 iPS细胞纯化

转染后的细胞隔天换一次液，第十五天更换为mTeSR™1培养基。继续培养直至有小细胞团陆续出现，换成无小分子的上述培养基。每组进行碱性磷酸酶染色，计算诱导效率。

剩余孔继续培养，直至克隆足够大便于挑去。当克隆已长至足够大，小心用枪头将形态良好的克隆从原六孔板中挑出后，接种到事先包被有Vitronectin或Matrigel的24孔板一孔中培养约4-6天待克隆长大后，观察细胞形态，使用枪头将明显分化的细胞集落去除，弃上清，每孔加入1ml Acctase消化酶孵育3分钟，当大部分细胞脱落后加入上清终止消化，每孔加入2ml DPBS 洗液，收集洗液250g离心，离心结束后用适量完全培养基重悬细胞，将细胞接种至12孔板或者六孔板中，此时记为P1代细胞。

1.3.5 iPS细胞扩增

收集上清，每孔加入1ml Acctase消化酶孵育3分钟，当大部分细胞脱落后加入上清终止消化，每孔加入2ml DPBS 洗液，收集洗液250g离心，离心结束后用适量完全培养基重悬细胞，并计数。以3×10

2、实验结果

由表2的结果数据以及图1-图8可以看出：

（1）对照组在13天左右出现ips样克隆；试验组组1-组13在8天左右开始有ips克隆出现。

（2）在诱导21天对各组细胞进行碱性磷酸酶染色，记录染色克隆数，通过接种细胞数计算诱导效率。其中对照组诱导效率约0.83%， 组1-组13，诱导效率均高于对照组。

（3）每组挑取5个克隆进行后续扩增培养，根据每次传代接种细胞数及收获细胞数计算倍增时间。其中对照组的5个克隆扩增过程中有两个细胞系因增殖过慢扩增至P3代便无法继续扩增。其他组别只有组12有一个细胞系由于生长过慢扩增过程中放弃，其他组来自不同克隆产生的细胞系均可正常扩增至P5代。

（4）连续传代5次后，收获每组细胞，进行形态检查、表型检测。总体形态均为典型ips细胞形态，克隆状生长，边缘清晰，质地均匀，表型检测结果显示SSEA4和OCT4的表达量均高于80%，均符合ips标准。

（5）将来源于质粒法的ips细胞系通过PCR的方法进行质粒残留检测，三个细胞系均有不同程度质粒残留，可能需要继续传代筛选来进一步去除。

表2 细胞鉴定结果

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。