特异性识别原儿茶酸的分子印迹聚合物和电化学传感器

技术领域

本申请涉及高分子材料合成技术和电化学特异性识别的技术领域，尤其涉及特异性识别原儿茶酸的分子印迹聚合物和电化学传感器。

背景技术

在过去的一段时间里，世界各地的药物安全问题特别是中药的规范化使用令人印象深刻并引发广泛关注。其中，原儿茶酸(PA)是一种天然的中药活性成分，广泛分布于丹参、芙蓉、五加、冬青等中药的茎和叶中，也在一些食用蔬菜中少量分布，被认为是一种有效的抗氧化剂、抗菌剂和抗炎剂。然而，已经研究报道发布，医用残留的原儿茶酸或不当使用(过量摄入)原儿茶酸会导致人体及动物呼吸急促和四肢抽搐，甚至导致死亡。因此，对原儿茶酸浓度的监测，特别是对中药药物的实际测定具有重要意义。到目前为止，在众多的分析方法中，电化学分析方法以其操作简单、灵敏度高、经济实惠、输出高效等优点而被学界广泛接受。因此，构建一种全新的电化学传感器来识别检测溶液中的原儿茶酸，以填补这一研究空白是很有价值的。

发明内容

有鉴于此，本申请提供特异性识别原儿茶酸的分子印迹聚合物和以此为探针的电化学传感器，能够在保证高灵敏度的同时实现对原儿茶酸的特异性检测。

<创立过程>

相关技术中，缺乏有效的电化学传感器来特异性识别检测溶液中的原儿茶酸。

为了克服在实际测定中某些可能共存的生物分子的障碍，分子印迹技术(MIT)已经从各种电化学传感器的修饰制备方法中脱颖而出。值得注意的是，在典型的分子印迹技术中，只有模板分子与功能单体通过定向相互作用特异性结合，目标分子才能被特异性识别。更重要的是，尽管分子印迹聚合物具有特定的识别功能，但有毒的传统引发剂(偶氮二异丁腈、过氧化二苯甲酰等)的污染是聚合及后续检测过程中亟待解决的问题，特别是在真实样品中选择性检测原儿茶酸的情况下。幸运的是，羟基自由基(·OH)已经被广泛研究并被认为是合成聚合物的一种绿色高效引发剂，避免了聚合及检测过程中的二次污染。目前，研究人员发现，牛血红蛋白(BHb)作为一种天然的过氧化物酶，不仅能有效分解过氧化氢生成·OH，而且在众多过氧化物酶中价格较低，稳定性较高，具有实际应用价值。此外，牛血红蛋白作为一种重要的金属卟啉，能够在电化学活性载体上进行修饰固定，提高电化学传感器的灵敏度。

在固定酶的载体选择上，钙钛矿纳米材料由于具有优异的电子转移率、显著的生物相容性和令人满意的稳定性在电化学传感方面的功效无可比拟，越来越受到人们的关注。特别是，钙钛矿纳米材料不仅作为载体固定生物酶或仿生酶，还可以选择作为光辅助生物传感探针，使得传感器具有更高的电化学活性。故我们可以预期，钙钛矿纳米材料与分子印迹聚合物的结合确实是实现中药中原儿茶酸特异性识别检测的一个潜在候选材料。

基于以上对相关技术的找寻和发展，本发明人艰难地发现如下：

首先，将镧系无机盐、铁系无机盐和柠檬酸在固定摩尔比下进行溶剂热反应，得到棕红色前躯体，并在高温退火过程中去除残留有机配体，得到以共价键结合的铁酸镧多孔球。这种铁酸镧多孔球一般具有表面凹凸不平的多孔球形貌，可以负载更多的电化学活性组分，工作效率高，球体平均直径在800-900纳米，稳定性高。以铁酸镧多孔球为载体，使金纳米颗粒首先通过静电作用固定在铁酸镧多孔球表面，其平均直径为10纳米；随后过氧化物酶通过金巯共价键固定在金纳米颗粒表面，得到Au@LaFeO

相比于原始的过氧化物酶，该复合酶级联聚合平台具有更高的羟基自由基生产率，在引入过氧化氢后可以自发地引发聚合反应合成分子印迹聚合物，具有较高的合成效率，且绿色环保无污染。本发明中，铁酸镧多孔球在分子印迹聚合物的包裹下呈现出复杂的交联结构，并以该聚合物为基础构建感应探针，在电化学条件下实现了溶液中原儿茶酸的特异性识别检测。

基于以上创先性的发现，创立了本发明创造。

<复合酶级联聚合平台>

复合酶级联聚合平台为Au@LaFeO

其中，所述Au@LaFeO

合适但非限制性地，所述铁酸镧多孔球的平均粒径为800-900nm，所述金纳米颗粒的平均粒径为10nm，所述铁酸镧多孔球的形貌表面凹凸不平的球粒子。

<复合酶级联聚合平台的制备>

上述复合酶级联聚合平台的制备方法包括以下步骤：

提供铁酸镧多孔球；

使所述铁酸镧多孔球和过氧化物酶形成混合分散液；

使所述混合分散液同氯金酸溶液、还原剂溶液反应，再离心干燥得到Au@LaFeO

作为上述还原剂的可示范的具体实例，包括柠檬酸、柠檬酸钠、硼氢化钠、抗坏血酸中的一种或几种；优选的，上述金纳米颗粒的制备方法采用柠檬酸钠为还原剂的一步还原法。

合适但非限制性地，过氧化酶选自牛血红蛋白或辣根过氧化氢酶中的一种合适但非限制性地，所述反应的温度为常温，反应时间为3-5h；

优选地，所述混合分散液的浓度为1-2mg mL

优选地，所述氯金酸溶液的浓度为0.015-0.025M；

优选地，所述还原剂溶液的浓度为0.015-0.025M。

优选地，所述混合分散液、氯金酸溶液、有机源溶液的体积用量比为25：1：1。

合适但非限制性地，所述铁酸镧多孔球的制备方法为，使镧系无机盐、铁系无机盐在有机配体的添加下发生溶剂热反应得到。

这里，有机配体包括无水柠檬酸或柠檬酸一水合物中的一种或几种。

合适但非限制性地，所述镧系无机盐的浓度与铁系无机盐的摩尔量相同，有机源的摩尔量为镧系无机盐浓度的2-3倍；

优选地，所述镧系无机盐选自硝酸镧、氯化镧或溴化镧中的一种或几种；

优选地，所述铁系无机盐选自硝酸铁、氯化铁或硫酸铁中的一种或几种；

优选地，所述溶剂热反应的温度为175-185℃；

优选地，所述铁酸镧多孔球的制备方法还包括在溶剂热反应之后将目标产物退火；

优选地，所述退火的温度为790-810℃，退火时间为1-3h。

<分子印迹聚合物>

上述分子印迹聚合物由聚合功能单体在如上述复合酶级联聚合平台的作用下采用酶诱导聚合所生成。

合适但非限制性地具体实例，所述聚合功能单体来源于丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺或4-乙烯基吡啶中的一种或几种。

<分子印迹聚合物的制备>

酶诱导聚合的过程包括以下步骤：

使催化剂分散在过氧化氢溶液中，形成合复合酶级联聚合平台分散液；

使所述复合酶级联聚合平台分散液和聚合功能单体在添加原儿茶酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯的条件下发生聚合，并从聚合混合产物中分离出分子印迹聚合物；

优选地，所述原儿茶酸为溶解于无水乙腈中得到浓度为0.5-2M的溶液；

优选地，所述聚合功能单体的摩尔用量为原儿茶酸摩尔用量的3-5倍；

优选地，所述乙二醇二甲基丙烯酸酯的摩尔用量为原儿茶酸摩尔用量的10-20倍。

<特异性识别原儿茶酸上的电化学传感器>

该化学传感器包括修饰在工作电极表面并具有如上述的分子印迹聚合物。

可以理解的是，这里，将分子印迹聚合物修饰在工作电极的方式，可采用常规电极表面修饰的方式，例如常规的分散液浸渍。

与相关技术相比，本申请具有以下优点和有益效果：(1)本申请合成的复合酶级联聚合平台能在引入过氧化氢的情况下，产生羟基自由基引发聚合，经济实惠。

(2)本申请提供的分子印迹聚合物结构稳定，合成方法简单且高效，反应条件温和且绿色环保。

(3)本申请中利用电化学方法对溶液中的原儿茶酸进行特异性检测，方法操作简单，工作效率高。

(4)本申请中，该分子印迹聚合物可以特异性识别溶液中的原儿茶酸，并在实际检测中能够有效避免其它结构相似的有机分子干扰。

附图说明

下面结合附图，通过对本申请的具体实施方式详细描述，将使本申请的技术方案及其它有益效果显而易见。

图1为本申请实施例1-1所得铁酸镧多孔球(LaFeO

图2(a)-2(d)为本申请实施例1-1所得铁酸镧多孔球(LaFeO

图3为本申请实施例3所得分子印迹电化学探针(Au@LaFeO

图4(a)-4(f)为本申请实施例3所得分子印迹电化学探针(Au@LaFeO

图5为本申请实施例1-2所得铁酸镧多孔球(LaFeO

图6为本申请对比例1所得铁酸镧多孔球(LaFeO

图7为本申请对比例2所得复合酶级联聚合平台(Au@LaFeO

图8为本申请对比例3所得分子印迹电化学探针。

(Au@LaFeO

图9为本申请对比例4所得分子印迹电化学探针(Au@LaFeO

图10(a)-10(b)为本申请实施例3所得复合酶级联聚合平台(Au@LaFeO

图11(a)-11(b)为本申请实施例3所得复合酶级联聚合平台(Au@LaFeO

图12(a)-12(c)为本申请实施例3所得分子印迹电化学探针(Au@LaFeO

图13为本申请实施例3所得分子印迹电化学探针(Au@LaFeO

具体实施方式

下面将结合本申请实施例以及附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

实施例1-1铁酸镧多孔球(LaFeO

本实施例提供一种铁酸镧多孔球的制备方法，包括以下主要步骤：

(1)将0.4g硝酸镧水合物溶解在50mL去离子水中，保持磁力搅拌；

(2)将步骤(1)的溶液中加入0.4g硝酸铁九水合物，保持磁力搅拌；

(3)将步骤(2)的溶液中加入0.4g无水柠檬酸，保持磁力搅拌；

(4)将步骤(3)中的溶液转移到聚四氟乙烯反应釜中，在电热恒温鼓风干燥箱中以180℃反应10小时，自然冷却；

(5)将步骤(4)中的溶液离心后冷冻干燥得到有机前驱体粉末；

(6)将步骤(5)中的粉末转移到瓷舟中，在管式炉中以800℃退火2小时，自然冷却得到铁酸镧多孔球，命名为LaFeO

实施例1-2铁酸镧多孔球(LaFeO

本实施例提供一种铁酸镧多孔球的制备方法，包括以下主要步骤：

(1)将0.4g硝酸镧水合物溶解在50mL去离子水中，保持磁力搅拌；

(2)将步骤(1)的溶液中加入0.4g硝酸铁九水合物，保持磁力搅拌；

(3)将步骤(2)的溶液中加入0.5g一水柠檬酸，保持磁力搅拌；

(4)将步骤(3)中的溶液转移到聚四氟乙烯反应釜中，在电热恒温鼓风干燥箱中以180℃反应10小时，自然冷却；

(5)将步骤(4)中的溶液离心后冷冻干燥得到有机前驱体粉末；

(6)将步骤(5)中的粉末转移到瓷舟中，在管式炉中以800℃退火2小时，自然冷却得到铁酸镧多孔球，命名为LaFeO

实施例2复合酶级联聚合平台的合成(Au@LaFeO

本实施例提供复合酶级联聚合平台的制备方法，包括以下主要步骤：

(1)将50mg铁酸镧多孔球和50mg牛血红蛋白分散于50mL去离子水中得到浓度为1.0mg mL

(2)将0.4g四氯金酸三水合物溶解在50mL去离子水中得到浓度为0.02M的氯金酸溶液；

(3)将0.2g无水柠檬酸钠溶解于50mL去离子水中得到浓度为0.02M的柠檬酸钠溶液；

(4)将步骤(1)中的悬浮液分别滴加2mL步骤(2)中的溶液和2mL步骤(3)中的溶液，保持搅拌；

(5)将步骤(4)得到的混合液在常温下反应4小时，离心后冷冻干燥得到复合酶级联聚合平台，命名为Au@LaFeO

实施例2为三种活性组分通过静电作用和共价键组合而成的复合酶级联聚合平台，通过场发射扫描电子显微镜可以观察到金纳米颗粒和牛血红蛋白都成功负载在铁酸镧多孔球上，通过粉末X射线衍射证明了铁酸镧和金的存在，分别对应于JCPDS卡片No.75-0541和No.04-0784。

实施例3分子印迹聚合物的制备(Au@LaFeO

本实施例提供特异性识别原儿茶酸的分子印迹聚合物的制备方法，包括以下主要步骤：

(1)将0.1g原儿茶酸、0.2mL甲基丙烯酸和50mL乙腈在常温下混合8小时以上；

(2)将50mg实施例2得到的复合酶级联聚合平台分散于5mL过氧化氢(30％)溶液中，封闭搅拌2小时以上；

(3)将步骤(1)中的溶液加入0.8mL乙二醇二甲基丙烯酸酯，搅拌混匀；

(4)将步骤(2)和(3)中的溶液通氮气30分钟以上除去氧气并混合；

(5)将步骤(4)中的混合液在室温密闭条件下聚合8小时，离心得到粉白色粉末；

(6)将步骤(5)得到的粉末用100mL体积比为9：1的乙醇/乙酸混合溶液洗涤3次以上，离心后冷冻干燥得到分子印迹聚合物，命名为Au@LaFeO

实施例3为可以通过电化学方法在溶液中特异性识别原儿茶酸的分子印迹聚合物，通过场发射扫描电子显微镜可以观察到聚合物的交联结构，通过红外光谱可以观察到交联剂和功能单体中羰基基团的振动峰，通过X射线光电子能谱证明了聚合物中存在碳碳单键、碳氧单键和碳氧双键，证明分子印迹聚合物的成功合成。

对比例1

本对比例提供一种铁酸镧多孔球(LaFeO

(1)将0.3g氯化镧水合物溶解在50mL去离子水中，保持磁力搅拌；

(2)将步骤(1)的溶液中加入0.4g硝酸铁九水合物，保持磁力搅拌；

(3)将步骤(2)的溶液中加入0.4g无水柠檬酸，保持磁力搅拌；

(4)将步骤(3)中的溶液转移到聚四氟乙烯反应釜中，在电热恒温鼓风干燥箱中以180℃反应10小时；

(5)将步骤(4)中的溶液自然冷却，离心后干燥得到前驱体粉末；

(6)将步骤(5)中的粉末转移到瓷舟中，在管式炉中以800℃退火2小时，自然冷却得到铁酸镧多孔球，命名为LaFeO

对比例2

本对比例提供一种复合酶级联聚合平台(Au@LaFeO

(1)将50mg铁酸镧多孔球和25mg辣根过氧化氢酶分散于50mL去离子水中得到浓度为1.0mg mL

(2)将0.4g四氯金酸三水合物溶解在50mL去离子水中得到浓度为0.02M的氯金酸溶液；

(3)将0.2g无水柠檬酸钠溶解于50mL去离子水中得到浓度为0.02M的柠檬酸钠溶液；

(4)向步骤(1)中的悬浮液分别滴加2mL步骤(2)中的溶液和2mL步骤(3)中的溶液，保持搅拌；

(5)将步骤(4)得到的混合液在常温下反应4小时，离心后冷冻干燥得到复合酶级联聚合平台，命名为Au@LaFeO

对比例3

本对比例提供一种特异性识别原儿茶酸的分子印迹聚合物(Au@LaFeO

(1)将0.1g原儿茶酸、0.2g丙烯酰胺溶解于50mL无水乙腈，常温混合8小时以上；

(2)将步骤(1)中的溶液加入0.8mL乙二醇二甲基丙烯酸酯，搅拌混匀；

(3)将50mg实施例2得到的复合酶级联聚合平台分散于5mL过氧化氢(30％)溶液中，封闭搅拌2小时以上；

(4)将步骤(2)中的溶液和(3)中的悬浮液通氮气30分钟以上除去氧气并混合；

(5)将步骤(4)中的混合液在室温密闭条件下聚合8小时，离心得到粉白色粉末；

(6)将步骤(5)得到的粉末用100mL体积比为9：1的乙醇/乙酸混合溶液洗涤3次以上，离心后冷冻干燥得到分子印迹聚合物，命名为Au@LaFeO

对比例4

本对比例提供一种特异性识别原儿茶酸的分子印迹聚合物(Au@LaFeO

(1)将0.1g原儿茶酸、0.3mL4-乙烯基吡啶溶于50mL无水乙腈，常温混合8小时以上；

(2)将步骤(1)中的溶液加入0.8mL乙二醇二甲基丙烯酸酯，搅拌混匀；

(3)将50mg实施例2得到的复合酶级联聚合平台分散于5mL过氧化氢(30％)溶液中，封闭搅拌2小时以上；

(4)将步骤(2)中的溶液和(3)中的悬浮液通氮气30分钟以上除去氧气并混合；

(5)将步骤(4)中的混合液在室温密闭条件下聚合8小时，离心得到粉白色粉末；

(6)将步骤(5)得到的粉末用100mL体积比为9：1的乙醇/乙酸混合溶液洗涤3次以上，离心后冷冻干燥得到分子印迹聚合物，命名为Au@LaFeO

图1为本发明实施例1-1制得的铁酸镧多孔球(LaFeO

FESEM被用来观察各个样品的外部形貌和物理结构，相关描述如下所述：

LaFeO

Au@LaFeO

Au@LaFeO

Au@LaFeO

图2为本发明实施例1-1制得的铁酸镧多孔球(LaFeO

XRD被用来识别各个样品的晶体结构，结果相关描述如下所述：

LaFeO

Au@LaFeO

Au@LaFeO

Au@LaFeO

图3为本发明实施例3制得的加载有分子印迹聚合物的电化学感应探针(Au@LaFeO

FT-IR被用于识别分子印迹聚合物的特征基团，结果相关描述如下所述：

Au@LaFeO

图4为本发明实施例3制得的加载有分子印迹聚合物的感应探针(Au@LaFeO

XPS用于确认感应探针的组成元素和其化合状态，结果相关描述如下所述：

Au@LaFeO

实施例1-2所得铁酸镧多孔球(LaFeO

对比例1所得铁酸镧多孔球(LaFeO

对比例2所得复合酶级联聚合平台(Au@LaFeO

对比例3所得分子印迹聚合物(Au@LaFeO

对比例4所得分子印迹聚合物(Au@LaFeO

测试例1复合酶级联聚合平台的工作效率测试

本测试例1提供了预制复合酶级联聚合平台(Au@LaFeO

图10中曲线分别代表不同浓度下过氧化氢被实验体催化的紫外动力学，曲线由上至下代表的过氧化氢浓度分别为：50mM；20mM；10mM；5mM；2mM；1mM；0.5mM，曲线斜率为在对应氧化氢浓度下实验体的催化速率。图11中Michaelis-Menten方程拟合表明，在相同浓度的过氧化氢条件下，复合酶级联聚合平台的工作效率远远超过原始牛血红蛋白，双倒数曲线Lineweaver-Burk方程拟合中，曲线与x轴截距为1/V

测试例2预制电化学感应探针对原儿茶酸的特异性识别测试

本测试2提供了预制电化学感应探针(Au@LaFeO

以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。