利用液相色谱-串联质谱同时定量分析利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班和贝曲沙班的方法

技术领域

本发明涉及生物化学和药物分析化学领域，具体而言，涉及一种利用高效液相色谱-串联质谱联用技术同时定量分析4种直接口服抗凝药(DOAC)即利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班和贝曲沙班的方法。

背景技术

液相色谱-质谱分析法主要应用于药物代谢、药物动力学、临床药理学、天然药物开发等领域。其具有高灵敏度、高特异性、重现性好、定量准确、线性范围宽、数据处理简单等优点。高效液相色谱能够有效地将待测物的成分分离开，而质谱能够对分开的成分逐个地进行定性定量分析。液相色谱-质谱分析法是利用试样各组分在色谱柱中的流动相和固定相间的分配和吸附系数不同，由流动相把试样带入色谱柱中进行分离后，经接口装置，不同的离子碎片在不同的电场和/或磁场的运动行为不同，质量分析器把电离子按质荷比(m/z)分开，得到依质量顺序排列的质谱图。通过对质谱图的分析处理，可以得到样品的定性、定量分析结果。

利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班和贝曲沙班是新一代直接口服抗凝药(DirectOral Anticoagulant，DOAC)，具有起效快、药理作用可预测和出血倾向低等特点，通常在无需常规实验室监测的情况下以固定剂量给药。然而，在新型抗凝药物的使用过程中，存在着一定的出血风险，尤其在使用剂量较大时，出血和凝血功能障碍都是不可忽视的严重问题。血浆中DOAC水平与不良结果之间存在关联。较低的DOAC血浆谷浓度增加了房颤患者发生严重中风的风险，小于50ng/mL可能是一个独立的风险因素。对于需要手术或侵入性治疗的DOAC患者，术前停药已达成共识并且血浆中DOAC的水平需降至30ng/mL以下，以防止任何出血事件。迄今为止，与不良结果相关的DOAC浓度尚未明确定义。因此，对于某些患者来说，药物浓度监测可能是必要的。

四种常见的直接口服抗凝药分子结构式如下所示。

A)利伐沙班，B)阿哌沙班，C)艾多沙班，和D)贝曲沙班

现有的DOAC检测方法大多数只检测一种药物且样本制备方法比较繁琐，随着使用多种DOAC治疗的患者的增加，这些方法不能满足当前实验室监测的需要。多分析物检测方法避免了实验室中单一分析物方法的频繁切换，统一的样品制备方法消除了繁琐的程序，这是未来临床实验室监测的必然趋势，但目前仅有少数报道。已有的少数几篇多分析物检测方法，样本制备时间长、操作步骤复杂，实验材料成本高，并且通常需要100～1000μL血浆样本(GOUVEIA F等人，Liquid chromatographic methods for the determination ofdirect oral anticoagulant drugs in biological samples：A critical review[J].Analytica Chimica Acta，2019，1076：18-31.)，这意味着血药浓度监测可能导致患者出现不同程度贫血。

在FOERSTER K I等人(Simultaneous quantification of direct oralanticoagulants currently used in anticoagulation therapy[J].Journal ofPharmaceutical and Biomedical Analysis，2018，148：238-44.)和MAIER V等人(Asynergy of liquid chromatography with high-resolution mass spectrometry andcoagulation test for determination of direct oral anticoagulants for clinicaland toxicological purposes[J].Biomedical Chromatography，2021，35(10)：e5195.)建立的DOAC多分析物方法中，部分分析物色谱峰完全重叠，这可能导致分析物之间的干扰。FOERSTER K I等人建立的方法是目前唯一将贝曲沙班纳入同时分析的。然而，贝曲沙班的残留超过了接受标准，需要在相邻样品之间注入空白样品以避免干扰。DOAC约30％～40％通过肾脏由尿液排出。尿样采集方便，而且是真正意义上的无创采集，因此更受患者的青睐。然而，目前仅有PAN T-Y等人(Rapid simultaneous clinical monitoring of fiveoral anti-coagulant drugs in human urine using green microextractiontechnique coupled with LC-MS/MS[J].Journal of King Saud University-Science，2021，33(8)∶101602.)报道了采用尿液的方法，他们开发了一种超声波辅助盐诱导液-液微萃取法，用于从尿液中提取四种DOAC。该方法需要四个步骤，制备过程中的多种因素会显著影响萃取效率，操作繁琐且耐用性差。

因此，本领域仍需要一种简便的同时定量分析多种DOAC的方法。

发明内容

本发明目的在于提供一种同时定量分析利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班和贝曲沙班的方法。

本发明的一个方面涉及一种利用高效液相色谱-串联质谱联用装置同时定量分析利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班和贝曲沙班的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)制备含有利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班和贝曲沙班的样品溶液；

2)将所述样品溶液注入到高效液相色谱-串联质谱联用装置中，获得质量色谱图；

3)根据所述质量色谱图使用内标法对利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班和贝曲沙班进行定量分析，

其中，所述高效液相色谱中使用由流动相A和流动相B组成的混合流动相进行梯度洗脱，所述流动相A为含0.05体积％至0.25体积％甲酸和1mmol/L至10mmol/L甲酸铵的水溶液，所述流动相B为含0.05体积％至0.30体积％甲酸的乙腈-甲醇溶液，其中所述流动相B中的乙腈与甲醇的体积比为2∶1至5∶1。

优选地，所述流动相A含有0.10体积％至0.20体积％甲酸，更优选0.10体积％甲酸，并且含有4mmol/L至8mmol/L的甲酸铵，更优选5mmol/L的甲酸铵。

优选地，所述流动相B含有0.10体积％至0.20％体积的甲酸，更优选0.10体积％的甲酸。

在一个优选实施方案中，所述梯度洗脱程序的总时长不超过15分钟，优选不超过10分钟，更优选不超过7分钟，并且在所述梯度洗脱程序中，起始流动相和最终流动相均为75体积％流动相A+25体积％流动相B，流动相B的浓度梯度从25体积％变化至60体积％所用的时间为0.5至1.5min。

优选地，所述梯度洗脱程序为：

0.00至5.00min，25体积％至60体积％流动相B；

5.00至5.60min，60体积％至80体积％流动相B；

5.60至7.00min，80体积％至25体积％流动相B，

其中流动相A和流动相B的总量为100体积％。

更优选地，所述梯度洗脱程序为：

0.00至4.00min，25体积％至25体积％流动相B；

4.00至5.00min，25体积％至60体积％流动相B；

5.00至5.50min，60体积％至60体积％流动相B；

5.50至5.60min，60体积％至80体积％流动相B；

5.60至6.00min，80体积％至80体积％流动相B；

6.00至6.01min，80体积％至25体积％流动相B；

6.01至7.00min，25体积％至25体积％流动相B，

其中流动相A和流动相B的总量为100体积％。

在一个优选实施方案中，所述高效液相色谱中的色谱柱为反相色谱柱，优选以十八烷基硅烷键合硅胶填充的色谱柱。

在一个优选实施方案中，所述制备含有利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班和贝曲沙班的样品溶液包括：用体积比为1∶1的乙腈-水混合物溶解利伐沙班、阿哌沙班和艾多沙班，用二甲基亚砜溶解贝曲沙班，然后用体积比为1∶1的乙腈-水混合物将所得溶液稀释。

在一个实施方案中，所述利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班和贝曲沙班来自受试者的血浆或尿液。

在一个实施方案中，所述制备含有利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班和贝曲沙班的样品溶液包括：向受试者的血浆中加入内标工作液，然后加入沉淀剂乙腈，涡旋混合后将所得混合物离心，取上清液用所述流动相B稀释并且混匀。

在一个实施方案中，所述制备含有利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班和贝曲沙班的样品溶液包括：向受试者的尿液中加入内标工作液，然后用体积比为1∶3的乙腈-水混合物稀释。

优选地，利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班和贝曲沙班的内标物分别为为D

A1)D

在一个实施方案中，其中所述利伐沙班的去簇电压DP为50至200V，优选为168V，并且所述利伐沙班的碰撞能量CE为20至40V，优选为40V。

在一个实施方案中，其中所述阿哌沙班的去簇电压DP为50至200V，优选为200V，并且所述阿哌沙班的碰撞能量CE为15至55V，优选为55V。

在一个实施方案中，其中所述艾多沙班的去簇电压DP为50至200V，优选为57V，并且所述艾多沙班的碰撞能量CE为15至55V，优选为26V。

在一个实施方案中，其中所述贝曲沙班的去簇电压DP为50至200V，优选为90V，并且所述贝曲沙班的碰撞能量CE为15至55V，优选为55V。

在一个实施方案中，其中所述D

在一个实施方案中，其中所述D

在一个实施方案中，其中所述D

在一个实施方案中，其中所述D

与现有技术相比，本发明利用高效液相色谱-串联质谱联用技术同时分离并且定量分析了利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班和贝曲沙班。本发明的方法具有灵敏度高，稳定性好，特异性强和数据重现性强等优点，具有较高的实用性和可靠性。此外，本发明的方法分析时间短，能够在血浆或尿液中准确、高通量的定量利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班和贝曲沙班。

本发明的方法能够同时对利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班和贝曲沙班进行准确定量分析，从而满足临床药物代谢动力学研究的需求。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施方案描述中所使用的附图作简单地介绍。

图1为通过高效液相色谱-串联质谱联用装置获得的利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班和贝曲沙班的质量色谱图。

图2A、图2B、图2C和图2D分别为血浆中利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班和贝曲沙班的典型标准曲线。

图3A、图3B、图3C和图3D分别为尿液中利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班和贝曲沙班的典型标准曲线。

图4为血浆(a)和尿液(b)样本中的利伐沙班、阿哌沙班、贝曲沙班和艾多沙班的色谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本公开一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在下面给出本发明的技术方案的具体实施例，但本领域技术人员能够理解，以下具体实施例仅是实施本发明的多种方案中的一部分示例，它们不应被理解为以任何方式限制本发明的范围。

实施例所使用的试剂及原料如下：

阿哌沙班、贝曲沙班、利伐沙班和D

实施例所采用的仪器如下：

●LC-20AD高效液相色谱系统(Shimadzu公司，日本)；串联质谱仪为API 4000系统(Sciex公司，美国)

实施例1：利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班和贝曲沙班的定量分析

本实施例说明了利用高效液相色谱-串联质谱联用技术对利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班和贝曲沙班的定量分析。

溶液配制：分别精密称量利伐沙班、D

由图1可见，利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班和贝曲沙班通过本发明的方法能够完全分离，并同时进行定量分析。

高效液相色谱条件：

●色谱柱：Acquity

●流动相：流动相A(含0.10体积％甲酸和5mmol/L甲酸铵的水溶液)和流动相B(含0.10体积％甲酸的乙腈∶甲醇(80∶20，v/v)溶液)

●梯度洗脱程序：

0.00至4.00min，25体积％至25体积％流动相B；

4.00至5.00min，25体积％至60体积％流动相B；

5.00至5.50min，60体积％至60体积％流动相B；

5.50至5.60min，60体积％至80体积％流动相B；

5.60至6.00min，80体积％至80体积％流动相B；

6.00至6.01min，80体积％至25体积％流动相B；6.01至7.00min，25体积％至25体积％流动相B，其中流动相A和流动相B的总量为100体积％。●流速：0.4mL/min●柱温：40℃●自动进样器温度：10℃●进样体积：20μL(血浆)和10μL(尿液)所述串联质谱的工作参数在以下表1中示出。

表1：串联质谱的工作参数

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实施例二：方法学验证

本实施例说明了血浆和尿液中利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班和贝曲沙班定量分析方法的方法学验证。

混合内标工作液的配制：分别取D

血浆样本制备方法：

取30μL含利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班和贝曲沙班的血浆，加入30μL混合内标工作液(200ng/mL)，加入60μL沉淀剂(乙腈)，涡旋混匀10秒，13000转(1700g)离心10分钟，取40μL上清液，加入80μL流动相A，混匀，取20μL进样。

尿液样本制备方法：

取20μL含利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班和贝曲沙班的尿液，加入40μL混合内标工作液(200ng/mL)，再加入940μL稀释液(乙腈∶水＝1∶3(v/v))，混匀后取10微升上样分析。

采用本发明提供的分析方法，使用内标法进行定量分析。对方法的特异性、标准曲线、定量下限、精密度和准确度、基质效应和回收率进行了验证。

A.特异性：采用6个不同志愿者的个体血浆样本，使用本发明提供的分析方法测定，在得到的质量色谱图中根据保留时间可以判断血浆中没有内源性物质的干扰。

B.标准曲线：分别配制含有1、5、10、25、50、100、250和500ng/mL利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班和贝曲沙班的标准曲线血浆样品和含有10、50、100、500、1000、2000、5000、10000ng/mL的利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班和贝曲沙班的标准曲线尿液样品，采用本发明提供的方法进行测定。以浓度为横坐标，利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班和贝曲沙班的峰面积为纵坐标，进行直线拟合，得到血浆标准曲线见图2A、图2B、图2C和图2D，尿液标准曲线见如图3A、图3B、图3C和图3D。标准曲线相关系数>0.99，线性相关性良好。

C.定量下限、精密度和准确度：配制4种不同浓度的质量控制样本(定量下限(LLOQ)、低浓度质控(LQC)、中浓度质控(MQC)和高浓度质控(HQC))，采用本发明提供的方法重复制备和测定6个样本，连续测定3批，计算日内和日间精密度和准确度。结果如表2所示，定量下限精密度结果RSD<20％，准确度结果：偏差维持在20％以内；低中高3种质控样本精密度结果RSD<15％，准确度结果：偏差维持在15％以内。该结果说明本方法准确性高，重现性好，具有较高的实用可靠性。

表2：利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班和贝曲沙班的精密度和准确度结果

D.基质效应和回收率：使用乙腈为基质配制低中高三种浓度质控样品进行测定，同时使用空白血浆作为样品进行沉淀萃取，使用该萃取液配制低中高三种浓度质控样品溶液，进行测定。通过对比相同浓度水平的上述两种方式处理得到的样本的峰面积，来判断血浆基质增强或抑制电离。

利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班和贝曲沙班的3种不同浓度的质控样本得到的基质效应和回收率结果见表3。该结果说明血浆基质对于本发明提供的方法的影响在不同的样本浓度条件下保持稳定。

表3利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班和贝曲沙班的基质效应和回收率结果

实施例三：临床治疗药物监测

本实施例说明了临床上血栓性疾病患者服用利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班或贝曲沙班后的治疗药物监测研究。

收集口服利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班或贝曲沙班抗凝患者的血液和尿液样本。血液样本收集于2.5mL枸橼酸钠抗凝管中，在4°橼以1900g离心15分钟以获得血浆，尿液样本收集于洁净的离心管中。样本收集后置于-80℃冰箱中，在一个月内完成分析。

采用本发明所提供的血浆和尿液预处理方法，利用高效液相色谱-串联质谱联用技术的定量分析方法分析人血浆和尿液中的利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班和贝曲沙班浓度，以实现治疗药物浓度监测，为患者的剂量调整提供依据。血浆和尿液样本中利伐沙班、阿哌沙班、贝曲沙班和艾多沙班色谱图见图4。

本发明的方法是一种多分析物分析方法，在一次运行中可同时定量四种DOAC。在本发明的方法中，分别采用蛋白质沉淀和一步稀释法来制备血浆和尿液，操作简单，易于推广，大大缩短制备时间。经测试，在30分钟内可制备24份血浆或30份尿样，具有分析效率的优越性。样本需求量少，血浆仅需20μL，尿液仅需30μL。四种DOAC之间均可实现基线分离，避免分析物之间的干扰。本方法未观察到任何分析物残留，无需在相邻样本之间注入空白样本减少干扰。本方法还检测了尿液中DOAC的浓度，这对于采血困难的患者是非常有意义的。最后，本方法成功应用于患者和受试者的治疗药物监测和药代动力学研究。

总之，本研究开发的方法在可靠性、分析效率和可操作性方面显示出巨大的优势。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本公开揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。