一种龙眼促炎蛋白、提取方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种龙眼促炎蛋白、提取方法及应用。

背景技术

龙眼(Dimocarpus longan Lour.)，也称桂圆，含有人体所需的糖分、维生素、矿物质等多种营养成分，具有较高的营养价值，但桂圆性温、味甘，多食易生内热而引起“上火”，常被称为“热性水果”。现代医学认为，“上火”是一种炎症反应。柑橘和荔枝也是常见的“热性水果”，有研究发现其引起“上火”的主要成分是水溶性蛋白，尤其是14-3-3的三个家族蛋白通过人体花生四烯酸(arachidonic acid,AA)代谢途径诱导机体产生免疫炎症反应。

牙龈发炎是“上火”的典型症状，主要是由口腔微生物引起的牙周疾病导致的。细菌是口腔微生物的主要类型，常在唾液薄膜上生长繁殖形成牙菌斑。牙菌斑里的细菌代谢产生有害物质刺激牙龈组织产生炎症。变形链球菌(Streptococcus mutans)是口腔菌群的主要种类，常形成牙菌斑导致龋病，其作用机制主要是通过三种葡糖基转移酶(GtfsB、GtfsC和GtfsD)将蔗糖合成胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)，使细菌牢固地附着在牙齿表面并形成生物膜，为细菌的生长提供保障。表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)常为口腔条件致病菌。口腔细菌在口腔中易形成生物膜，大多数生物膜对各种抗生素具有较高的耐受性，从而导致口腔中各种病症的发生。但是，目前没有对龙眼中引起牙龈发炎的蛋白进行相关研究，同时，在对菌群进行培养时，基本上是单独分开培养，难以对炎症致病菌进行针对性批量培养，从而模拟炎症致病菌增殖的环境。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于，提供一种龙眼促炎蛋白，以解决现有技术中没有对龙眼中引起牙龈发炎的蛋白相关研究、以及难以对菌群中的牙龈发炎致病菌进行针对性培养的问题。

本发明的进一步目的在于，提供一种上述龙眼促炎蛋白的提取方法，用以解决对于难以大量准确获取龙眼促炎蛋白的问题。

本发明的更进一步目的在于，提供一种上述龙眼促炎蛋白的应用，用以解决现有技术中难以对炎症致病菌进行针对性批量培养的问题，为后续药物研发提供基础。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种龙眼促炎蛋白，所述促炎蛋白为酚提法提取的龙眼蛋白提取物，经鸟枪法质谱分析龙眼蛋白提取物，检测得到的肽段覆盖率在30％以上的蛋白质包括：胞质铜/锌超氧化物歧化酶、NADP特异性异柠檬酸脱氢酶、细胞色素c氧化酶亚基Vb、谷胱甘肽转移酶、谷胱甘肽过氧化物酶、核糖体蛋白L22、NADP依赖性异柠檬酸脱氢酶、细胞周期蛋白依赖性激酶、FRIGIDA样蛋白质3a-2、RNA聚合酶β、生长素响应因子、GTP结合核蛋白、NBS-LRR抗病蛋白NBS37、抗坏血酸过氧化物酶、转录因子E2FB、磷脂酶Dδ、隐花色素1、WRKY转录因子2-3、WRKY转录因子72-4、WRKY转录因子28-2、细胞周期蛋白T1-4、核糖体蛋白S4、母体效应胚胎停滞蛋白、谷胱甘肽S-转移酶、脱氢抗坏血酸还原酶；所述龙眼蛋白中促炎蛋白的分子量在30KD以上。

本发明还提供一种龙眼促炎蛋白的提取方法，具体包括如下步骤：

步骤1：龙眼果肉榨汁后过滤，离心处理并收集上清液，冷冻干燥后缩小体积，在4℃下透析处理，然后再次冷冻干燥；

步骤2：将步骤1干燥后的粉末加入预冷的酚提取缓冲液，再加入预冷的Tris饱和酚溶液，剧烈摇晃使其混合均匀，在冰盒中振荡2h，在4℃下离心处理，获得上层液体；

步骤3：所述上层液体重复进行步骤2，取上层酚相，加入预冷的含有乙酸铵的甲醇溶液，在-20℃条件下静置沉淀蛋白，在4℃下离心处理，取沉淀物；

步骤4：向沉淀物中加入丙酮，混合均匀，置于-20℃条件下静置1h，然后在4℃下离心处理；

步骤5：重复进行步骤4两次后，空气干燥得到所述龙眼蛋白。

一种龙眼促炎蛋白的应用，上述提取方法提取得到的龙眼蛋白用于促进口腔菌群中致病菌的生长，尤其是促进变异链球菌和表皮葡萄球菌的生长。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明所述龙眼促炎蛋白能够促进口腔炎症致病菌的生长，在培养口腔菌群时，能够针对性促进致病菌的生长，而并不会促进其他非致病菌的生长，为模拟口腔中致病菌大量繁殖的环境提供实验基础；同时，本发明所述龙眼促炎蛋白还能够促进肠道中致病菌生长，通过较低的浓度促进细胞的炎症因子表达，为后续相关药物研发提供实验基础。

2、本发明所述方法能够高效的从龙眼中提取促炎蛋白，对蛋白活性的影响较小，产物纯度高，促炎活性好，为后续进行龙眼“上火”研究提供了实验基础。

附图说明

图1为本发明所述龙眼蛋白SDS-PAGE电泳图。

图2为本发明所述龙眼蛋白对口腔细菌生长的影响图；其中，图2A为变异链球菌，图2B为表皮葡萄球菌，图2C为腐生葡萄球菌，且P<0.05。

图3为不同浓度龙眼蛋白对细菌生长的影响图；其中，图3A为变异链球菌，图3B为表皮葡萄球菌，图3C为腐生葡萄球菌，且P<0.05。

图4为龙眼蛋白对细菌生物膜形成的影响图；其中，A为生物膜形态，B为生物膜量，且P<0.05。

图5为龙眼蛋白对细菌生物膜产EPS的影响图；其中，图5A为变异链球菌，图5B为表皮葡萄球菌，图5C为腐生葡萄球菌，且P<0.05。

图6为不同方法提取龙眼蛋白组分的SDS-PAGE电泳分析。

图7为不同浓度龙眼蛋白对小鼠肠道致病菌和益生菌的影响。

图8为不同浓度龙眼蛋白对细胞炎症因子的影响。

图9为不同浓度龙眼蛋白对血液中炎症因子的影响。

图10为不同浓度龙眼蛋白对肺部炎症的影响。

具体实施方式

下面将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

一、一种龙眼促炎蛋白

本发明所述促炎蛋白为酚提法提取的龙眼蛋白提取物，基于鸟枪法蛋白质组学分析方法，使用反相液相色谱－串联质谱系统分析龙眼蛋白质的胰蛋白酶酶解产物，结合数据库检索，共鉴定到肽段覆盖率在30％以上的蛋白质25种，包括：胞质铜/锌超氧化物歧化酶、NADP特异性异柠檬酸脱氢酶、细胞色素c氧化酶亚基Vb、谷胱甘肽转移酶、谷胱甘肽过氧化物酶、核糖体蛋白L22、NADP依赖性异柠檬酸脱氢酶、细胞周期蛋白依赖性激酶、FRIGIDA样蛋白质3a-2、RNA聚合酶β、生长素响应因子、GTP结合核蛋白、NBS-LRR抗病蛋白NBS37、抗坏血酸过氧化物酶、转录因子E2FB、磷脂酶Dδ、隐花色素1、WRKY转录因子2-3、WRKY转录因子72-4、WRKY转录因子28-2、细胞周期蛋白T1-4、核糖体蛋白S4、母体效应胚胎停滞蛋白、谷胱甘肽S-转移酶、脱氢抗坏血酸还原酶。

二、一种龙眼促炎蛋白的提取方法

实施例1

新鲜龙眼果肉榨汁后用4层纱布过滤，4℃，5000rpm/min离心15min收集上清液，冷冻干燥后缩小体积后4℃于透析3天后，收集样品再次冷冻干燥。称取100mg干燥粉末，加入15mL预冷的酚提取缓冲液(pH7.5，500mM Tris-base、63.7mM EDTA水溶液、100mM KCl、700mM蔗糖)，再加入15mL预冷的Tris饱和酚溶液，剧烈摇晃使其混合均匀，至于冰盒中在摇床上振荡2h，在4℃，5000rpm/min离心15min。取上层，重复上述步骤，重新取得的上层酚相中加入提前预冷的含有0.1M乙酸铵的甲醇35mL，-20℃静置过夜沉淀蛋白，4℃，5000rpm/min离心15min，去上清。加入丙酮，轻轻摇晃，后置于-20℃条件下静置1h，4℃，5000rpm/min离心15min。重复上述步骤2次，空气干燥得到龙眼蛋白，溶于水后定量。

对比例1：等电点沉淀法提取龙眼总蛋白

取500g龙眼果干肉，粉碎机粉碎后加入1600g蒸馏水，调pH值至8.0，浸泡2h后抽滤，取滤液调pH至3.0、4.0、5.0，静置2h后离心(10000r/min，10min)，去除上清液，取沉淀物冷却干燥得到龙眼蛋白，溶于水后定量。

对比例2：试剂盒提取龙眼总蛋白

参照植物蛋白抽提试剂盒(上海生工C500053-0050)说明书：将植物组织在-80℃冷冻，剪碎，将冷冻剪碎的组织放入预冷的研钵中，一边加入液氮保持冷冻，一边将植物组织研磨成粉末。取100mg组织粉末，加入1mL SolutionA溶液和0.7μL Solution C，悬浮粉末后-20℃静置45min，离心(4℃、15000r/min、15min)取沉淀，再加入1mL Solution B、10μLSolution D和0.7μL Solution C，重悬，-20℃静置60min，离心取沉淀。再次加入以上相同试剂，立即离心，取沉淀。取沉淀进行冷冻干燥，得到龙眼蛋白，溶于水后定量。

三、龙眼促炎蛋白的应用

配制10％的分离胶，灌胶冷凝；再配制5％的浓缩胶溶液，灌注于分离胶上方，插入梳子。静置30min后，拔出梳子，在上样孔中加入100μg上述龙眼蛋白水溶液，120V 1h，停止电泳，取出胶放入考马斯亮蓝R250染色液中振荡过夜，后将胶依次放入25％甲醇和7.5％乙酸中室温振摇下脱色，拍照。

由图1可知，龙眼蛋白提取物经考马斯亮蓝染色后条带清晰，杂质较少，分子量在30kDa～250kDa条带数量较多，低于30kDa的条带数量较少，说明蛋白完整、质量较高，可用于后续实验中。

表1不同方法提取龙眼的吸光度

经过考马斯亮蓝染色后，饱和酚提取法与试剂盒提取法提取的样品条带分离基本清晰，如图6所示。饱和酚提取法提取龙眼蛋白质量高，所得龙眼蛋白分子量分布在250kDa-15kDa，能提取到龙眼果肉中含有的大部分完整的蛋白质。等电点沉淀法提取的龙眼蛋白浓度较饱和酚提取法提取的龙眼蛋白浓度较低，只能提取特定pH值的龙眼蛋白。综上，饱和酚提取法提取效果最好。

(1)龙眼促炎蛋白对口腔致病菌的影响

1、菌种活化

配制TYP培养基和TSA培养基，将冻存的变异链球菌、腐生葡萄球菌、表皮葡萄球菌进行菌种活化。

2、龙眼蛋白对三种口腔细菌生长的影响

取处于对数生长期的100mL菌液加入2mL 3mg/mL的龙眼蛋白样品溶液，对照加入2mL 3mg/mL牛血清蛋白，每隔2h吸取1mL菌液用分光光度计在600nm处测定菌液的OD值。

3、不同浓度龙眼蛋白对口腔细菌生长的影响

配制浓度为0mg/mL、3mg/mL、6mg/mL、9mg/mL的龙眼蛋白溶液，在100mL 3种细菌培养液中分别加入2mL上述不同浓度龙眼蛋白溶液，37℃培养12h，使用分光光度计在600nm测定OD值。

4、不同浓度龙眼蛋白对三种口腔细菌生物膜形成的影响

将处于对数生长期的3种细菌菌悬液1mL加入24孔板中，每一种细菌的菌悬液分别加入0mg/mL、3mg/mL、6mg/mL、12mg/mL浓度龙眼蛋白1mL，37℃培养12h，小心吸弃孔内液体，用PBS缓冲液清洗孔板，在每孔中加入1mL结晶紫染色液，染色15min，再用PBS缓冲液清洗3次，置于显微镜下拍照，再加入1mL 33％的乙酸溶液，50r/min振荡30min，吸取200μL溶液，在575nm使用酶标仪读取数值。

5、不同浓度龙眼蛋白对三种口腔细菌产EPS的影响

将处于对数生长期的3种细菌菌悬液1mL加入24孔板中，每一种细菌的菌悬液分别加入0mg/mL、3mg/mL、6mg/mL、12mg/mL浓度龙眼蛋白1mL，37℃培养12h，吸弃上清液，用PBS缓冲液清洗孔底形成的生物膜，再将生物膜全部刮下，4000r/min离心10min，离心后弃上清，沉淀用PBS溶液重悬并清洗2～3次，每管加入1mL0.4 mol/LNaOH溶液重悬沉淀，37℃孵育2h，在4℃，6000r/min离心10min。取200μL上清液加入600μL蒽酮试剂，95℃加热8min，冷却至室温，取200μL加入96孔板中，在625nm处读取吸光值。

对以上获得的数据重复实验三次，采用SPSS 19.0软件进行方差分析和多重比较，P<0.05表示差异有统计学意义。

6、结果分析

分析3mg/mL龙眼蛋白对三种菌生长的影响，由图2可知，在0h～4h时，3mg/mL龙眼蛋白对变异链球菌生长无显著影响；在4h～26h时，3mg/mL龙眼蛋白显著促进了其生长(P<0.05)，可能是因为细菌处于对数期，生长迅速。在0～6h和在22～26h时，3mg/mL龙眼蛋白对表皮葡萄球菌的生长无显著影响；在6～22h时，3mg/mL龙眼蛋白显著促进了其生长(P<0.05)，在0h～26h内，3mg/mL龙眼蛋白对腐生葡萄球菌的生长影响均不显著，可能是因为细菌处于迟缓期，生长缓慢。变异链球菌为常见的口腔致病菌，表皮葡萄球菌是条件致病菌，而腐生葡萄球菌在口腔内通常不致病，以上结果说明龙眼蛋白对口腔致病菌生长有促进作用，对非致病菌生长无显著影响。

由图3可知，3mg/mL、6mg/mL龙眼蛋白可以显著促进变异链球菌、表皮葡萄球菌的生长(P<0.05)，其效应随浓度增大而增强，9mg/mL龙眼蛋白抑制了两种菌的生长，但仍高于对照组(P<0.05)，可能因为蛋白浓度过大，导致细胞渗透压过大，从而引起细菌死亡。不同浓度的龙眼蛋白对腐生葡萄球菌生长影响均不显著。以上结果说明龙眼蛋白可显著促进口腔致病菌、条件致病菌的生长，对口腔非致病菌的生长无显著影响。

由图4可知，3mg/mL、6mg/mL龙眼蛋白显著促进了变异链球菌、表皮葡萄球菌生物膜的形成能力，且随蛋白浓度增大，生物膜直径越大(p<0.05)，而9mg/mL抑制了变异链球菌生物膜的形成，但仍显著高于未处理组。不同浓度的龙眼蛋白对腐生葡萄球菌的生物膜形成均无显著影响。说明3mg/mL以上浓度的龙眼蛋白能促进口腔致病菌的生物膜形成，但过高浓度的龙眼蛋白会抑制生物膜的继续形成，可能是由于高浓度的龙眼蛋白抑制了细菌生长，从而导致细菌形成生物膜能力的下降。以上结果说明龙眼蛋白可显著促进口腔致病菌、条件致病菌的生物膜形成，对非致病菌无显著影响。

利用蒽酮-硫酸法检测龙眼蛋白对三种细菌生物膜产胞外EPS的影响，结果如图5所示，3mg/mL、6mg/mL龙眼蛋白使变异链球菌和表皮葡萄球菌合成EPS的量显著增大(P<0.05)，且呈浓度递增，9mg/mL龙眼蛋白使上述细菌合成EPS的量有所降低，但无统计学意义，可能是由于高浓度龙眼蛋白使细菌生长受到抑制，但已合成的EPS仍分泌在培养基中。龙眼蛋白对腐生葡萄球菌产EPS量均无显著差异影响。以上结果说明龙眼蛋白可显著促进口腔致病菌、条件致病菌的生物膜产胞外多糖，对非致病菌无显著影响。

本发明发现3mg/mL、6mg/mL龙眼蛋白能增强口腔致病菌变异链球菌和条件致病菌表皮葡萄球菌的生长能力，促进其生物膜形成和分泌胞外多糖，且呈现出剂量依赖性。但9mg/mL龙眼蛋白对变异链球菌、表皮葡萄球菌的生长、生物膜和EPS形成产生了一定的抑制，可能是由于过高的龙眼蛋白中某些组分对细菌的生长产生抑制作用，从而抑制了生物膜及胞外多糖的产生。同时本发明也发现，龙眼蛋白对腐生葡萄球菌这一非致病菌的生长、生物膜形成、EPS产量均无显著影响，推测龙眼蛋白能够较为专一的影响口腔致病菌的生长，从而模拟口腔中致病菌增殖的环境，为后续药物应用提供模拟条件。

(2)龙眼促炎蛋白对肠道致病菌的影响

用100mg/mL.d组、200mg/mL.d组龙眼蛋白分别灌胃两只C57BL/6小鼠，同时设置对照组，所有小鼠的培养条件完全相同，24小时后，分别收集每只小鼠粪便，取0.1克的小鼠粪便，在无菌条件下进行稀释至10-7分别涂布于BBL琼脂、改良GAM培养基、Lbs琼脂和Pfizer肠球菌选择性琼脂中进行培养，36℃进行厌氧培养48小时。以每克小鼠的粪便稀释剂(CFU/g)为单位，计算式如下：

以涂布平板法分析龙眼蛋白对小鼠肠道内肠球菌的影响。如图7所示，与对照组相比，100mg/mL.d组、200mg/mL.d组龙眼蛋白使小鼠肠道中肠球菌、拟杆菌数量显著上升(P<0.05)，乳杆菌、双歧杆菌数量显著下降(P<0.0.01)，说明龙眼蛋白可促进小鼠肠道致病菌的生长、抑制益生菌的生长。

(3)龙眼促炎蛋白对细胞炎症因子的影响

为了分析龙眼促炎蛋白对细胞促炎因子表达的作用，分别用0.2mg/m L、0.4mg/mL、0.6mg/m L龙眼促炎蛋白处理RAW264.7细胞12h，检测促炎因子TNF-α、IL-6、IL-8的表达。由图8可知，使用0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL龙眼促炎蛋白处理后细胞12h后，细胞中TNF-α、IL-6、IL-8mRNA和蛋白表达量有上升，0.4mg/mL龙眼促炎蛋白处理组和0.4mg/mL龙眼促炎蛋白处理组的上述炎症因子具有统计学意义(P<0.01)，且随着处理浓度上升，其表达量也上升，说明0.4mg/mL龙眼促炎蛋白可促进RAW264.7细胞的炎症因子表达。

(4)龙眼促炎蛋白对血液中促炎因子的影响

选择雄性C57BL/6小鼠(20～22g)在温度22±2℃，湿度55±5％的条件下适应性饲养5d。小鼠随机分组为4组，每组10只，分为空白对照组、低剂量组和高剂量组。空白对照组灌胃生理盐水，低剂量组腹腔注射100mg/kg·d龙眼蛋白，高剂量组腹腔注射200mg/kg·d龙眼蛋白，试验期为24小时。取小鼠血清或细胞培养于离心管中，室温放置10min，3000rpm/min离心10min分离血清。参照酶联免疫吸附剂ELISA试剂盒说明书进行操作，使用酶标仪，根据标准曲线，分别测量各个样本的SAA、hs-CRP、PCT、TNF-α、IL-6、IL-8的含量。

取小鼠肺组织于4％的多聚甲醛中固定，常规HE染色，切片机连续切片，厚度4～6μm，镜下观察，全景扫描。

以100mg/kg·d、200mg/kg·d龙眼蛋白腹腔注射小鼠24h后，用ELISA检测试剂盒检测小鼠血液中炎症因子SAA、hs-CRP、PCT、IL-6的表达。如图9所示，同空白对照组相比，灌胃100mg/kg·d龙眼蛋白使小鼠血液中SAA、hs-CRP、PCT、IL-6表达显著上升(P<0.01)，灌胃200mg/kg·d龙眼蛋白使小鼠上述炎症因子表达进一步上升(P<0.01)，呈剂量递增效应。

光学显微镜下观察经HE染色的小鼠肺部病理切片发现，如图10可知，对照组肺泡壁均比较薄，且大小均匀，结构正常，未见间质性水肿发生，无充血及炎性细胞浸润的现象。100mg/mL龙眼蛋白处理组小鼠的肺泡间隔明显加宽，一些肺泡结构完整，有炎性细胞浸润。200mg/mL龙眼蛋白处理组小鼠的肺泡间隔进一步加宽，更多的肺泡结构不完整，大量的炎性细胞浸润，说明100mg/mL龙眼蛋白可导致小鼠肺部出现炎症反应。

最后需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制技术方案，本领域的普通技术人员应当理解，那些对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。