新型饲粮及其增强热应激下罗曼蛋鸡免疫力的测试方法

技术领域

本发明属于家禽养殖用新型饲粮技术领域，尤其涉及一种新型饲粮及其增强热应激下罗曼蛋鸡免疫力的测试方法。

背景技术

目前，环境温度的上升会对家禽产生热应激，对生产性能和免疫系统产生有害影响。热应激降低了鸡的免疫器官(脾脏、法氏囊、胸腺和肝脏)的重量，并导致这些组织萎缩，导致免疫反应受到抑制。许多研究发现，在高温条件下，家禽体内的抗体(IgG、IgM)和体液免疫应答水平降低。环境热应激还可以通过降低肠腔中IgA等细胞的分泌、上皮内淋巴细胞和影响巨噬细胞吞噬活性的抗体滴度母鸡的水平来影响肠道免疫。IL-1β由触发的巨噬细胞产生，被认为是炎症介质。氧化应激中的热应激导致活性氧(ROS)大量产生，ROS是不稳定的代谢产物，通过脂质过氧化和DNA损伤破坏细胞膜。热应激条件下ROS产生刺激炎性白细胞介素(Interleukin，IL)，如IL-6、IL-1β和TNF-α。许多研究表明，较高的环境压力条件会降低IgG、IgM和白细胞细胞因子相关蛋白的合成，增加炎性细胞因子，增加脾细胞凋亡速度。

中草药物质通过改善免疫反应、消化酶分泌和抗氧化作用有益于缓解热应激带来的有害影响。姜黄素(Curcumin)是一种总多酚，来源于姜黄(Curcuma longa L)，具有抗氧化和抗炎作用。姜黄素是姜黄植物的重要成分，被认为是一种天然抗氧化剂，它具有多种药理和治疗特性，包括抗氧化特性，脂质过氧化抑制，清除自由基，抗菌，抗炎，抗原生动物，以及作为免疫增强剂的抗病毒和抗肿瘤特性。姜黄素添加剂可在恶劣条件下恢复家禽的自由基和抗氧化平衡。在许多情况下，姜黄素被认为是抗炎的，在鱼类中也检测到姜黄素的抗炎特性。补充姜黄素可以通过提高生长速度和增强肉鸡以及蛋鸡中的抗氧化剂和免疫相关生物标志物来减轻环境压力的不利影响。姜黄素在热应激条件下具有优异的免疫刺激反应。一些研究表明，姜黄素具有不同的免疫增强功能，对外周血单个核细胞具有刺激作用，可以直接或间接地控制许多细胞信号传导生物途径。姜黄素还可以下调炎性细胞因子和趋化因子。热应激条件下的饲粮中添加姜黄素可以增强鸡的抗氧化反应和免疫相关基因表达。在蛋鸡饮食中补充姜黄素粉可以通过增加免疫球蛋白水平来改善免疫反应。

为了提高蛋鸡养殖过程中的生长性能，提高饲料利用率，同时降低蛋鸡因被细菌感染而引起的患病率，养殖人员会在饲料中添加抗生素，但抗生素过量添加不仅会污染水源，且不利于人体健康。同时，现有技术中关于姜黄素在蛋鸡饲粮中的最佳添加量的相关技术方案尚未见报道。因此，通过分析饲粮中添加姜黄素对热应激添加下母鸡免疫应答的特殊影响，以期可以利用姜黄素代替抗生素使用，从而降低商业家禽生产系统中高温胁迫条件的破坏性后果，为后续推广姜黄素在生产上的使用提供理论数据支持显得极为迫切。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前在蛋鸡饲料中过量添加抗生素不仅会污染水源，且不利于人体健康；同时，现有技术中关于姜黄素在蛋鸡饲粮中的最佳添加量的相关技术方案尚未见报道。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种新型饲粮及其增强热应激下罗曼蛋鸡免疫力的测试方法。

本发明是这样实现的，一种增强热应激下罗曼蛋鸡免疫力的新型饲粮测试方法，增强热应激下罗曼蛋鸡免疫力的新型饲粮测试方法包括：采集罗曼蛋鸡翅静脉血样并离心，获得血清，采用ELISA试剂盒检测皮质酮血清浓度；制备血液涂片，分别进行白细胞和淋巴细胞计数；采用ELISA试剂盒检测鸡血清免疫球蛋白IgG和IgM水平，分别评估炎症细胞因子、抗氧化剂以及脾脏功能。

进一步，增强热应激下罗曼蛋鸡免疫力的新型饲粮测试方法包括以下步骤：

步骤一，采集禁食12h的罗曼蛋鸡翅静脉血样并离心，获得血清并储存；

步骤二，采用ELISA试剂盒根据标准曲线检测皮质酮血清浓度，单位pg/mL；

步骤三，采集血样并制备血液涂片，计算异嗜性粒细胞与淋巴细胞比值；

步骤四，使用甲酚蓝染色剂进行白细胞计数并检测鸡血清免疫球蛋白水平；

步骤五，评估炎症细胞因子和抗氧化剂并根据线性回归方程计算样品浓度；

步骤六，获取活体体重与脾脏重量数据并计算脾脏指数以评估脾脏功能。

进一步，步骤一中，在试验的第31、34和37周，采集罗曼蛋鸡翅静脉血，将血液于3000r/min离心10min，获得血清，于-20℃储存。

进一步，步骤三中，在试验的第31、34和37周采集血样，在玻片上制备血液涂片，Giemsa染色，异嗜性粒细胞与淋巴细胞比值通过淋巴细胞计数计算。

进一步，嗜异性粒细胞包括淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞以及嗜碱性粒细胞。

进一步，步骤四中，采用ELISA试剂盒检测鸡血清免疫球蛋白IgG和IgM水平；使用正常曲线分析血清免疫球蛋白，单位为ng/mL。

进一步，步骤五中，采用鸡ELISA试剂盒评估炎症细胞因子和抗氧化剂SOD、CAT、GSH-Px和MDA，分光光度计使用450nm。

进一步，步骤六中，在实验第31、34和37周，屠宰后称量活体体重与脾脏重量再计算脾脏指数以评估脾脏功能，脾脏指数＝脾脏重量/活体体重。

本发明的另一目的在于提供一种实施所述的增强热应激下罗曼蛋鸡免疫力的新型饲粮测试方法的新型饲粮，新型饲粮添加有姜黄素。

进一步，新型饲粮中姜黄素的添加量优选为150mg/kg和200mg/kg。

结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：

第一，本发明提供的增强热应激下罗曼蛋鸡免疫力的新型饲粮测试方法，通过分析饲粮中添加姜黄素对热应激条件下母鸡免疫应答的特殊影响，确定了在饲粮中添加姜黄素对热应激条件下母鸡免疫应答的特殊影响降低，其中姜黄素添加量在150mg/kg和200mg/kg时效果最佳，降低了商业家禽生产系统中高温胁迫条件的破坏性后果，为后续推广姜黄素在生产上的使用提供理论数据支持。

姜黄源于生姜，多见于东南亚和南亚地区。姜黄素是一种从姜黄中提取的总多酚，具有抗氧化和抗炎功能，是姜黄植物的一种重要成分。姜黄素作为一种天然抗氧化剂，它具有多种药理和治疗特性，包括抗氧化特性、脂质过氧化抑制、自由基清除、抗菌、抗炎、抗原生菌以及作为免疫增强剂的抗病毒和抗肿瘤功能，补充姜黄素可以在恶劣条件下恢复家禽的自由基和抗氧化剂平衡。

第二，本发明通过在饲粮中添加姜黄素增强了热应激下罗曼蛋鸡免疫力，降低了禽养殖业中高温给家禽带来的不利影响，提高了饲粮转化率和家禽生产性能。

第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：

(1)本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：本发明降低禽养殖业中高温给家禽带来的不利影响，包括神经内分泌紊乱、免疫抑制和电解质失衡，提高饲粮转化率和家禽生产性能，降低生产成本，提高盈利能力。

(2)本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：姜黄素是一种从姜黄中提取的总多酚，具有抗氧化和抗炎功能，可通过影响机体免疫系统从而减少热应激对机体的损伤。本发明通过分析姜黄素影响罗曼蛋鸡脾脏免疫反应的机制，提高高温下鸡群的生产性能，而目前国内外尚未有相关的技术方案。

(3)本发明的技术方案解决了人们一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题：鸡的生理、行为和免疫反应受到高温的影响，高温可能导致神经内分泌紊乱、免疫抑制和电解质失衡，从而降低饲料转化率、饲料摄入量和生产成本，最终降低盈利能力，本发明通过添加姜黄素解决了该技术难题。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的增强热应激下罗曼蛋鸡免疫力的新型饲粮测试方法流程图；

图2A是本发明实施例提供的姜黄素对罗曼蛋鸡在常温条件下免疫球蛋白IgG水平示意图；

图2B是本发明实施例提供的姜黄素对罗曼蛋鸡在常温条件下免疫球蛋白IgM水平示意图；

图3A是本发明实施例提供的姜黄素对罗曼蛋鸡在热应激条件下免疫球蛋白IgG水平示意图；

图3B是本发明实施例提供的姜黄素对罗曼蛋鸡在热应激条件下免疫球蛋白IgM水平示意图；

图4A是本发明实施例提供的姜黄素对罗曼蛋鸡在常温条件下皮质酮水平示意图；

图4B是本发明实施例提供的姜黄素对罗曼蛋鸡在热应激条件下皮质酮水平示意图；

图5A是本发明实施例提供的姜黄素对罗曼蛋鸡在常温条件下血清炎性细胞因子IL-1示意图；

图5B是本发明实施例提供的姜黄素对罗曼蛋鸡在常温条件下血清炎性细胞因子IL-6示意图；

图5C是本发明实施例提供的姜黄素对罗曼蛋鸡在常温条件下血清炎性细胞因子TNF-α示意图；

图6A是本发明实施例提供的姜黄素对罗曼蛋鸡在热应激条件下血清炎性细胞因子IL-1示意图；

图6B是本发明实施例提供的姜黄素对罗曼蛋鸡在热应激条件下血清炎性细胞因子IL-6示意图；

图6C是本发明实施例提供的姜黄素对罗曼蛋鸡在热应激条件下血清炎性细胞因子TNF-α示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种新型饲粮及其增强热应激下罗曼蛋鸡免疫力的测试方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的增强热应激下罗曼蛋鸡免疫力的新型饲粮测试方法包括以下步骤：

S101，采集禁食12h的罗曼蛋鸡翅静脉血样并离心，获得血清并储存；

S102，采用ELISA试剂盒根据标准曲线检测皮质酮血清浓度；

S103，采集血样并制备血液涂片，计算异嗜性粒细胞与淋巴细胞比值；

S104，使用甲酚蓝染色剂进行白细胞计数并检测鸡血清免疫球蛋白水平；

S105，评估炎症细胞因子和抗氧化剂并根据线性回归方程计算样品浓度；

S106，获取活体体重与脾脏重量数据并计算脾脏指数以评估脾脏功能。

作为优选实施例，本发明实施例提供的增强热应激下罗曼蛋鸡免疫力的新型饲粮测试方法具体包括以下步骤：

1.在试验的第31、34和37周，对每组鸡进行翅静脉采血，采血前禁食12h。血液3000r/min离心10min，获得血清，于-20℃储存。

2.采用ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司)检测皮质酮血清浓度。根据标准曲线检测浓度，单位为pg/ml。

3.在试验的第31、34和37周采集血样，然后在玻片上制备血液涂片，Giemsa染色。每个样本载玻片计数100个白细胞(嗜异细胞包括淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞和嗜碱性粒细胞)。异嗜性粒细胞与淋巴细胞比值(heterophil/lymphocyte，H/L)通过淋巴细胞计数计算。

4.使用甲酚蓝的染色剂进行白细胞计数。

5.采用ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司)检测鸡血清免疫球蛋白(IgG和IgM)水平。使用正常曲线分析血清免疫球蛋白，单位为ng/ml。

6.采用鸡ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司)评估炎症细胞因子和抗氧化剂(SOD、CAT、GSH-Px和MDA)。分光光度计(中国上海生物医药有限公司)使用450nm，并根据线性回归方程计算样品浓度。

7.在实验第31、34和37周，屠宰后称量活体体重与脾脏重量再计算脾脏指数以评估脾脏功能。脾脏指数＝脾脏重量(g)/活体体重(g)。

本发明实施例提供的增强热应激下罗曼蛋鸡免疫力的新型饲粮测试方法，从罗曼蛋鸡的免疫球蛋白、皮质酮、血清炎性细胞因子等方面进行验证，其中，试验的第31、34和37周也就是W3、W6和W9周下的结果。

(1)姜黄素对罗曼蛋鸡的免疫球蛋白的影响

结果显示，在试验的第31、34和37周，HC组血清中的IgG和IgM水平显著低于NC组(p<0.05)。如图2A～图2B所示，在常温添加组中，与NC组相比，NT150组和NT200组中的IgG和IgM水平显著增加(p<0.05)，NT50组和NT100组的IgG和IgM水平略高于NC组，NT250组的IgG和IgM水平显著降低(p<0.05)。

如图3A～图3B所示，在高温添加组中，与HC组相比，HT100、HT150和HT200的IgG和IgM水平显著升高(p<0.05)HT250组的IgG和IgM水平显著低于HC组(p<0.05)。

(2)姜黄素对罗曼蛋鸡皮质酮水平的影响

如图4A～图4B所示，在实验的第31、34和37周，HC组血清中的皮质酮水平显著高于NC组(p<0.05)。在常温添加组中，与NC组相比，NT50组、NT100组、NT150组、NT200组和NT250组的皮质酮水平均有下降，NT150组和NT200组皮质酮水平显著降低(p<0.05)，NT250组的皮质酮水平显著提高(p<0.05)。

在高温添加组中，与HC组相比，HT100组、HT150组和HT200组的皮质酮水平显著下降(p<0.05)。HT250组的皮质酮血清水平下降，但差异不显著。

(3)姜黄素对罗曼蛋鸡血清炎性细胞因子(IL-1、IL-6和TNF-α)的影响

如图5A～图5C所示，在实验的第31、34和37周，HC组的IL-1、IL-6和TNF-α水平显著高于NC组(p<0.05)。在常温添加组中，与NC组相比，NT50组和NT100组的IL-1、IL-6和TNF-α水平略有降低，NT150组和NT200组的IL-1、IL-6和TNF-α水平显著降低(p<0.05)，NT250组的IL-1、IL-6和TNF-α水平显著提高(p<0.05)。

如图6A～图6C所示，在高温添加组中，与HC组相比，HT150组和HT200组的IL-1、IL-6和TNF-α水平显著降低(p<0.05)，HT50组、HT100组和HT250组的IL-1、IL-6和TNF-α水平降低，差异不显著。

(4)姜黄素对罗曼蛋鸡脾脏的组织学影响

1)姜黄素对常温条件下脾脏的组织学影响

结果显示，在试验的第31、34和37周，NT50组、NT100组和NT150组脾脏组织细胞形态正常，红髓与白髓结构完整，边缘区清晰；NT200组观察到少量的出血点与淋巴细胞浸润；NT250组观察到脾脏组织局部坏死，淋巴细胞浸润和出血性病变增加，在试验期第37周时更为严重。

2)姜黄素补充对高温条件下脾脏组织学的影响

在试验的第31、34和37周，与NC组相比，在高温条件下，随着高温处理时间的增加，HC组脾脏组织红髓与白髓边界模糊，边缘区结构消失，脾细胞出现异常，部分脾细胞出现核固缩、核破裂等现象，出现大量的坏死与嗜异性淋巴细胞浸润，有明显的出血斑。与HC组相比，HT组脾脏组织具有明显改善，红髓与白髓结构较清晰，坏死区域与出血点减少，脾细胞形态恢复正常，其中HT200组改善效果最好，基本能恢复正常水平。

3)姜黄素对正常温度下脾脏免疫应答TLR4/NF-κB信号通路的影响

结果显示，在试验的第31、34和37周，HC组IL-1、IL-6、Nrf2、TNF-和NF-κB的mRNA表达水平显著高于NC组(p<0.05)。在常温添加组中，与NC组相比，NT150组和NT200组IL-1β、IL-6、Nrf2、TNF-α和NF-κB的mRNA表达水平显著降低(p<0.05)，NT50组和NT100组IL-1β、IL-6、Nrf2、TNF-α和NF-κB的mRNA表达量降低，差异不显著，NT250组IL-1β、IL-6、Nrf2、TNF-α和NF-κB mRNA表达量略有升高。

在高温添加组中，与HC组相比，HT50组和HT100组IL-1β、IL-6、Nrf2、TNF-α和NF-κBmRNA表达量不受影响，HT150组和HT200组IL-1、IL-6、Nrf2、TNF-和NF-B的mRNA表达显著降低(p<0.05)，HT250组IL-1β、IL-6、Nrf2、TNF-α和NF-κB的mRNA表达显著增加(p<0.05)。

根据以上的试验结果，可以得到：

1.热应激会导致血清中IgG和IgM水平下降，饲粮中添加姜黄素可提高血清中IgG和IgM水平，其中添加量在100mg/kg时效果最佳。

2.热应激会导致血清中皮质酮水平上升，饲粮中添加姜黄素可降低血清中皮质酮水平，其中添加量在150mg/kg和200mg/kg时效果最佳。

3.热应激会引起TLR4/NF-κB信号通路的表达量上调，饲粮中添加姜黄素可抑制TLR4/NF-κB信号通路的表达量上调，其中添加量在150mg/kg和200mg/kg时效果最佳。

4.热应激可能损害免疫反应、生长性能、营养物质消化率和细胞抗氧化系统，进而影响蛋鸡的产蛋性能、蛋品质和产量。高温地区的高温可能导致蛋鸡氧化应激。氧化应激可在脾脏等免疫器官中产生ROS，引起组织损伤。氧化剂和抗氧化剂代谢产物的失衡会影响不同细胞水平的信号通路，从而降低家禽的免疫力。姜黄素作为家禽饲料添加剂是缓解热应激的潜在成分。姜黄素具有抗氧化和抗炎的作用，抑制脂质过氧化最终可作为免疫增强剂。许多研究已经报道了天然和草药的抗炎作用。饲粮添加200mg/kg姜黄素可缓解热应激条件下日本鹌鹑的血脂过氧化和下调HSP70表达，也可上调Nrf2相关通路。

5.在本发明实施例提供的试验结果中，热应激会显著上调TLR4/NF-κB信号通路的表达，使脾脏组织发生严重的炎症反应，饲粮中添加姜黄素可有效缓解这一症状，其中添加量在150mg/kg和200mg/kg时效果最佳，然而，当添加量提高到250mg/kg时，TLR4/NF-κB信号通路表达会显著提高，猜测其原因是高剂量姜黄素在发挥抗炎功能的同时，会引起脾脏组织氧化应激，损害脾脏，增加ROS的产生，进而增加炎症介质的产生，最终导致炎症反应的发生。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。