一种脂质体酶纳米反应器及制备方法和抗肿瘤治疗的应用

技术领域

本发明属于生物纳米医学技术领域，具体涉及一种脂质体酶纳米反应器及制备方法和抗肿瘤治疗的应用。

背景技术

酶通过降低活化能并显著提高化学反应速率，在生物反应和代谢过程中起着不可或缺的作用。涉及多种酶的级联反应是生物体内信号传递和代谢(如氧化磷酸化)的基础。在真核细胞中，酶被划分在特定的细胞器和生物分子凝聚体中，为多步反应提供了一个封闭的环境，以完成预期的生物过程，具有反应效率高，独立性强的特点。

大多数研究都集中在用合成系统模仿大自然的划分策略上，目前已经开发出多种人工细胞和亚细胞类似物，如人工细胞和纳米细胞器，来模拟基本的细胞结构和反应。这种区域化的分离不仅保留了酶的活性和功能，而且能够通过不同的方式组装目标酶，用来模拟复杂的自然催化过程。然而，不同酶的组合以及酶的定量划分以及实现对级联反应的时空控制仍然具有挑战性。此外，将这些人工合成系统用于生物医学领域应用的研究目前也很罕见。介孔二氧化硅纳米容器常被用于封装酶或作为其他药物的载体。然而，在二氧化硅形成过程中，原位酶包埋需要苛刻的合成条件，这一过程通常会导致酶活性降低。聚合物是在酶纳米反应器的水核中捕获酶的另一种选择，在这种情况下，嵌段共聚物的合成需要多步过程。此外，合成聚合物的生物相容性仍然是体内应用另一个主要问题。

为解决目前存在的问题，开发一种具有高效酶级联反应能力的酶纳米反应器用于生物医学等领域具有重要研究意义。

发明内容

本发明针对现有问题，提供一种脂质体酶纳米反应器、制备方法，以及将其用于抗肿瘤治疗的应用。本发明不需要复杂的合成过程，采用薄膜分散法和挤压法制备脂质体酶纳米反应器(LNRs)。该纳米反应器具有高效酶级联反应能力，具有临床抗肿瘤治疗的前景。

为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种脂质体酶纳米反应器包括脂质体；以及葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶，与所述脂质体复合。

所述脂质体包括L-α-磷脂酰胆碱、胆固醇和1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺。

其中，所述的脂质体酶纳米反应器中GOx(葡萄糖氧化酶)和HRP(辣根过氧化物酶)的负载量分别为1～1000μg mg

其中，所述脂质体酶纳米反应器的流体动力学半径为1～1000nm。

其中，所述脂质体酶纳米反应器的电动电势为-100～100mW。

在一些具体实施方式中，所述脂质体酶纳米反应器的流体动力学半径为10～300nm。

在一些具体实施方式中，所述脂质体酶纳米反应器的流体动力学半径为20～220nm。

在一些具体实施方式中，所述的脂质体酶纳米反应器中GOx(葡萄糖氧化酶)和HRP(辣根过氧化物酶)的负载量分别为1～300μg mg

在一些具体实施方式中，所述的脂质体酶纳米反应器中GOx(葡萄糖氧化酶)和HRP(辣根过氧化物酶)的负载量分别为10～300μg mg

所述的脂质体酶纳米反应器的制备方法，采用脂质体、葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶通过薄膜分散法和挤压法制备脂质体酶纳米反应器。

所述的脂质体酶纳米反应器的具体制备方法，包括以下步骤：

1)将L-α-磷脂酰胆碱、胆固醇和1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)溶解在有机溶剂中；

2)去除溶剂，获得均匀透明的脂质体薄膜；

3)将脂质体薄膜、葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶在溶液中混合，得到脂质体悬浮液；

4)依次使用不同孔径的聚碳酸酯膜对步骤3的悬浮液进行挤压过滤；

5)过滤后的滤液离心纯化，重悬于新鲜PBS中，得到脂质体酶纳米反应器的悬浮液。

在一些具体实施方式中，所述制备方法中，L-α-磷脂酰胆碱的用量为0～800mg，胆固醇的用量为0～200mg，1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)的用量为0～200mg。

在一些具体实施方式中，所述制备方法中，葡萄糖氧化酶的用量为1～10000μg，辣根过氧化物酶用量为1～10000μg。

在一些具体实施方式中，所述制备方法中，依次使用孔径为800nm、400nm和200nm的聚碳酸酯膜对步骤3的悬浮液进行挤压过滤。

所述制备方法中，使用聚碳酸酯膜对步骤3的悬浮液进行挤压过滤的时间根据实验物质的投料量不同时间不同，挤压完全即可，具体的，挤压过滤的时间为0-30min。

所述的一种脂质体酶纳米反应器在制备抗肿瘤治疗材料或者药物中的应用。

开发了基于脂质体的酶纳米反应器(GOx/HRP-LNRs)，模拟了用于抗肿瘤治疗的真核细胞器的结构和串联反应。葡萄糖氧化酶(GOx)和辣根过氧化物酶(HRP)共同负载在脂质体的水核中心。两种酶的共区隔化提高了串联反应的整体效率。纳米反应器中的GOx可以消耗肿瘤细胞中的葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢(H

所述脂质体酶纳米反应器外层为生物相容性良好的脂质体，内部包含葡萄糖氧化酶，辣根过氧化物酶，两种酶在纳米反应器中区隔化时，实现了高效的级联反应。

与现有技术相比，本发明具有如下的特色及优点：本发明原理新颖，脂质体酶纳米反应器的制备方法简单，在保留酶活性的同时具有高效的级联反应效率，并将基于脂质体的酶纳米反应器用于催化抗肿瘤治疗。由葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶组成的纳米反应器消耗葡萄糖，产生具有高细胞毒性的·OH作为级联反应的最终产物。脂质体中两种酶的共区隔化产生了一个受限的微环境，增加了局部H

附图说明

图1是脂质体酶纳米反应器GOx/HRP-LNRs的冷冻透射电镜图像。

图2是脂质体中BODIPY标记的GOx(GOx-BDP)和Cy5标记的HRP(HRP-Cy5)的荧光图像。

图3是不同葡萄糖浓度下GOx/HRP-LNRs的反应动力学测试图。

图4是GOx/HRP-LNRs级联反应的Michaelis-Menten动力学测试图。

图5是脂质体酶纳米反应器细胞摄取成像图。

图6是GOx/HRP-LNRs在细胞内产生羟基自由基的荧光图像。

图7是常氧和乏氧条件下不同酶类型的脂质体酶纳米反应器的细胞毒性实验图。

图8是不同类型的脂质体酶纳米反应器对小鼠的肿瘤体积影响变化图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。

在一些具体实施例中，脂质体酶纳米反应器包括脂质体；以及与脂质体复合的葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶。脂质体包括L-α-磷脂酰胆碱、胆固醇和1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺。

脂质体酶纳米反应器的基本表征：对脂质体酶纳米反应器的粒径、PDI，zeta电位以及形貌等进行表征，测量LNRs测试最终分散体的流体动力学半径(R

脂质体酶纳米反应器在溶液中酶活性及级联反应效率进行测试，测定相应底物的GOx和HRP活性：在96孔微板的单孔中分别加入每种酶样品，再加入相应的酶纳米反应器。然后，记录产物与试卤灵反应的荧光强度。通过计算机辅助非线性回归分析，将实验数据拟合成双曲方程，确定Michaelis常数(KM)和最大速率(Vmax)的取值。

脂质体酶纳米反应器进行细胞摄取实验评价其进入细胞的能力：MCF-7细胞接种于6孔板上，培养过夜后，用含GOx/HRP-LNRs的完全培养基更换旧培养基，继续孵育0、1、2、3、4、5、6、8、10和24h。随后，用流式细胞仪测试孵育后不同时刻细胞的荧光强度。共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察不同时间点(0、1、2、3、4h)MCF-7细胞的荧光图像。

脂质体酶纳米反应器进行细胞内羟基自由基检测：使用·OH特异性荧光探针羟基苯基荧光素(HPF)检测MCF-7细胞中·OH的生成。MCF-7细胞以5×10

脂质体酶纳米反应器进行细胞毒性实验，作为抗肿瘤能力的评价。MCF-7细胞接种于96孔板中，在常氧或低氧条件下培养24h。然后在DMEM细胞中分别加入不同酶浓度的不同酶类型的酶纳米反应器，继续孵育24h。随后，每孔加入MTT溶液，在相同条件下再孵育。除去MTT溶液，加入DMSO。用微板读取器测量OD值。对A549细胞和4T1细胞进行相同的实验程序，以评估细胞活力。

利用脂质体酶纳米反应器进行体内外抗肿瘤治疗应用研究：使用具有良好生物相容性并且已广泛应用于临床的脂质体作为酶的载体，通过尾静脉注射对小鼠进行给药。脂质体酶纳米反应器通过EPR效应在体内血管通透性增强的部位积累，增强肿瘤靶向性。同时，利用脂质体构建特殊的腔室来模拟基本的细胞结构和反应，保留了酶的活性和功能，能够模拟复杂的自然催化过程。在体内外具有显著的抗肿瘤效果。

脂质体酶纳米反应器对荷瘤小鼠进行尾静脉注射给药，并记录肿瘤体积随时间的变化评估其体内抗肿瘤能力。体内抗肿瘤研究在携带小鼠乳腺癌细胞系4T1的BALB/c小鼠(雌性，6～7周龄)上进行。在小鼠右前肢腋下接种4T1细胞，开始监测肿瘤体积。当肿瘤达到一定体积时，将小鼠随机分为5组(n＝5)。各组荷瘤小鼠静脉注射等量浓度脂质体的纳米反应器。监测18天内肿瘤体积和体重。

实施例1

本发明脂质体酶纳米反应器采用如下方式制备而成：

(1)将L-α-磷脂酰胆碱(egg PC)(40mg)、胆固醇(Chol)(10mg)和1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)(10mg)(摩尔比＝55:30:15)溶解在无水氯仿中。在无水氯仿中加入DiD染料(占总脂质的0.2mol％)标记脂质体纳米反应器，用于后续的细胞实验；

(2)步骤1的溶剂在旋转蒸发器上蒸发至干燥，以获得均匀透明的薄膜。在圆底瓶中加入4mL水相(PBS,0.1M,pH＝7.4)，与膜混合(搅拌，不超声)，使其脱落形成不含酶的空白脂质体纳米反应器(LNRs)悬浮液。

(3)脂质体的制备同步骤1，溶剂在旋转蒸发器上蒸发至干燥，以获得均匀透明的薄膜。在圆底瓶中加入含有GOx(10mg mL

(4)脂质体的制备同步骤1，溶剂在旋转蒸发器上蒸发至干燥，以获得均匀透明的薄膜。在圆底瓶中加入含有HRP(10mg mL

(5)脂质体的制备同步骤1，溶剂在旋转蒸发器上蒸发至干燥，以获得均匀透明的薄膜。在圆底瓶中加入含有GOx/HRP(两种酶的浓度均为10mg mL

(6)依次使用孔径为800nm、400nm和200nm的聚碳酸酯膜对上述步骤的悬浮液进行挤压过滤5min，挤压不动时更换新的滤膜；

(7)将LNRs离心纯化，重悬于新的PBS中，放入冰箱4℃保存备用。

通过紫外光谱测试得到不同脂质体纳米反应器中两种酶的负载量，其中GOx-LNR悬浮液中GOx相对于脂质体的负载为31.82μg mg

实施例2

(1)将L-α-磷脂酰胆碱(egg PC)(800mg)、胆固醇(Chol)(200mg)和1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)(200mg)溶解在无水氯仿中。

(2)溶剂在旋转蒸发器上蒸发至干燥，以获得均匀透明的薄膜。在圆底瓶中加入含有GOx/HRP(两种酶的浓度均为10mg mL

(3)依次使用孔径为800nm、400nm和200nm的聚碳酸酯膜对上述步骤的悬浮液进行挤压过滤30min，挤压不动时更换新的滤膜；

(4)将LNRs离心纯化，重悬于新的PBS中，放入冰箱4℃保存备用。

实施例3

(1)将L-α-磷脂酰胆碱(egg PC)(400mg)、胆固醇(Chol)(100mg)和1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)(100mg)溶解在无水氯仿中。

(2)溶剂在旋转蒸发器上蒸发至干燥，以获得均匀透明的薄膜。在圆底瓶中加入含有GOx/HRP(两种酶的浓度均为10mg mL

(3)依次使用孔径为800nm、400nm和200nm的聚碳酸酯膜对上述步骤的悬浮液进行挤压过滤15min，挤压不动时更换新的滤膜；

(4)将LNRs离心纯化，重悬于新的PBS中，放入冰箱4℃保存备用。

实施例4

(1)将L-α-磷脂酰胆碱(egg PC)(200mg)、胆固醇(Chol)(50mg)和1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)(50mg)溶解在无水氯仿中。

(2)溶剂在旋转蒸发器上蒸发至干燥，以获得均匀透明的薄膜。在圆底瓶中加入含有GOx/HRP(两种酶的浓度均为10mg mL

(3)依次使用孔径为800nm、400nm和200nm的聚碳酸酯膜对上述步骤的悬浮液进行挤压过滤8min，挤压不动时更换新的滤膜；

(4)将LNRs离心纯化，重悬于新的PBS中，放入冰箱4℃保存备用。

实施例5

(1)将L-α-磷脂酰胆碱(egg PC)(40mg)、胆固醇(Chol)(10mg)和1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)(10mg)溶解在无水氯仿中。

(2)溶剂在旋转蒸发器上蒸发至干燥，以获得均匀透明的薄膜。在圆底瓶中加入含有GOx/HRP(两种酶的浓度均为10mg mL

(3)依次使用孔径为800nm、400nm和200nm的聚碳酸酯膜对上述步骤的悬浮液进行挤压过滤5min，挤压不动时更换新的滤膜；

(4)将LNRs离心纯化，重悬于新的PBS中，放入冰箱4℃保存备用。

实施例6：葡萄糖氧化酶(GOx)和辣根过氧化物酶(HRP)共同负载的表征实验。

使用冷冻透射电镜(JEOL JEM1400)观察实施例1制备的脂质体或者脂质体纳米反应器的形貌。如图1所示，脂质体的形态为球形，大小分布均匀。使用荧光探针BODIPY标记的GOx(GOx-BDP)和Cy5标记的HRP(HRP-Cy5)，使用荧光探针BODIPY和Cy5共同标记GOx/HRP-LNRs，用激光共聚焦显微镜进行共定位分析。如图2所示，观察到GOx/HRP-LNRs存在两种标记染料的荧光信号重叠(图2中的overlay)，证实了两种酶的共包封，葡萄糖氧化酶(GOx)和辣根过氧化物酶(HRP)共同负载在脂质体的水核中心。

实施例7：脂质体酶纳米反应器进行基本表征实验。

使用Zetasizer(Nano S90,Malvern Panalytical GmbH,Germany)测量实施例1制备的脂质体或者脂质体酶纳米反应器的粒径、PDI和zeta电位。使用ALV光谱仪(ALV LangenGmbH,Germany)获得了最终分散体的流体动力学半径(Rh)。如表1所示，LNRs的流体动力学半径(Rh)取决于其加载状态，随着酶负载量的增加而增加，zeta电位变化不大。

表1样品基本表征数据

实施例8：脂质体酶纳米反应器在溶液中酶活性及级联反应效率。

使用AmplexTM Red法测定实施例1制备的脂质体或者脂质体纳米反应器中GOx和HRP的活性，配置待测样品：对于含有GOx的样品(样品中游离GOx的浓度为5μg mL

实施例1制备的脂质体或者脂质体纳米反应器在溶液中的级联反应效率测试。

在96孔微板的单孔中分别加入100μL上述配制的GOx-LNR、100μLGOx/HRP-LNRs、100μL HRP-LNRs反应混合物样品，2.5μL上述配制的两种游离酶样品。然后，用TECAN M1000微板阅读器每隔15s记录产物与试卤灵反应的荧光强度(λem＝595nm)，计算Michaelis-Menten动力学数据。通过计算机辅助非线性回归分析，将实验数据拟合成双曲方程，确定了Michaelis常数(K

几种样品的动力学数据如表2所示，两种酶在包封后都保持活性，并且反应底物(葡萄糖或H

表2样品动力学数据

实施例9：实施例1制备的脂质体或者脂质体纳米反应器进行细胞摄取实验评价其进入细胞的能力。

MCF-7细胞以每孔5×10

实施例10：实施例1制备的脂质体或者脂质体酶纳米反应器进行细胞内羟基自由基检测。

使用特异性荧光探针羟基苯基荧光素(HPF)检测MCF-7细胞中·OH的生成。MCF-7细胞以5×10

实施例11：实施例1制备的脂质体或者脂质体酶纳米反应器进行细胞毒性实验。

MCF-7细胞以每孔5×10

实施例12：实施例1制备的脂质体或者脂质体酶纳米反应器对荷瘤小鼠进行尾静脉注射给药，随后记录肿瘤体积随时间的变化评估其体内抗肿瘤能力。体内抗肿瘤研究在携带小鼠乳腺癌细胞系4T1的BALB/c小鼠(雌性，6～7周龄)上进行。在小鼠右前肢腋下接种约1×10