一种药物组合物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种药物组合物及其应用。

背景技术

前列腺癌（Prostate cancer，PCa）是一种恶性实体肿瘤，在全球男性中发病率高。针对早期局限性前列腺癌的治疗，可选择前列腺切除术或结合放疗进行根治。对于晚期或转移性前列腺癌，采用雄激素剥夺疗法（Androgen deprivation therapy，ADT）联合第二代抗雄激素药物（abiraterone acetate, enzalutamide, apalutamide and darolutamide）进行治疗。然而，在疾病进展过程中，大多数PCa会对ADT产生抗性，发展成去势抵抗性前列腺癌（Castration-resistant prostate cancer，CRPC）或转移性去势抵抗性前列腺癌（Metastatic castration-resistant prostate cancer，mCRPC）。其中，前列腺特异性膜抗原（Prostate specific membrane antigen，PSMA）在去势抵抗性前列腺癌中显著过表达，其过表达与高肿瘤分级、疾病进展和复发、临床预后较差和患者生存期缩短相关。

mCRPC是PCa进展的最后阶段，也是死亡的主要原因。一旦发生，患者仅可选择细胞毒性化疗、放疗、雄性激素受体抑制剂或PARP抑制剂以延长生存期。但这些疗法存在组织选择性差，高全身毒性和耐药性等局限性，且生存期延长期限通常限制在6个月以内，故迫切需要新的更有效的治疗方法用于mCRPC治疗。

近年来，靶向肿瘤治疗已显示出较传统疗法的显著优势。J591是第一个靶向PSMA细胞外结构域的人源化单抗，其具有靶向性好、相对分子量低等优点，避免了人体对鼠的免疫作用。因此，人源化J591在PCa的诊疗中具有良好的应用前景。与传统的细胞毒性药物相比，抗体药物缀合物（Antibody-Drug Conjugates，ADC）避免了全身用药，降低了非靶器官的毒性，有望提高PSMA阳性肿瘤的靶向治疗效果。到目前为止，三种靶向PSMA的ADC分子已进入临床试验，但仍存在对PSMA阳性肿瘤细胞的杀伤活性低，无法实现有效抑制肿瘤的生长和转移。

发明内容

本发明的目的在于提供一种药物组合物及其应用，本发明提供的药物组合物，通过黏着斑激酶（FAK）抑制剂破坏肿瘤微环境提高抗PSMA抗体-药物缀合物在肿瘤组织中的渗透，进一步提高对PSMA阳性肿瘤细胞的杀伤活性，并可有效抑制肿瘤生长和转移。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种药物组合物，包括抗PSMA抗体-药物缀合物和黏着斑激酶抑制剂；

所述抗PSMA抗体-药物缀合物由人源化抗体J591或其功能性片段通过二肽连接子与微管蛋白抑制剂偶联得到。

优选的，所述黏着斑激酶抑制剂包括地法替尼和/或GSK2256098。

优选的，所述微管蛋白抑制剂为澳瑞他汀类细胞毒性分子。

优选的，所述澳瑞他汀类细胞毒性分子包括单甲基耳抑素肽E和/或单甲基耳抑素肽F。

优选的，所述二肽连接子为Val-Cit连接子。

优选的，所述抗PSMA抗体-药物缀合物具有式1所示结构：

式1；

式1中，Ab为人源化抗体J591或其功能性片段；

P为1~16的任意整数。

优选的，所述抗PSMA抗体-药物缀合物和黏着斑激酶抑制剂的摩尔比为(0.01~8):(1000~50000)。

优选的，所述药物组合物中，黏着斑激酶抑制剂的给药浓度范围为0.5～20 μM。

本发明提供了上述技术方案所述的药物组合物在制备治疗PSMA阳性实体肿瘤药物中的应用。

优选的，所述PSMA阳性实体肿瘤为PSMA阳性去势转移性前列腺肿瘤。

本发明提供了一种药物组合物，包括抗PSMA抗体-药物缀合物和黏着斑激酶抑制剂；所述抗PSMA抗体-药物缀合物由人源化抗体J591或其功能性片段通过二肽连接子与微管蛋白抑制剂偶联得到。本发明提供的药物组合物，通过黏着斑激酶（FAK）抑制剂破坏肿瘤微环境提高抗PSMA抗体-药物缀合物在肿瘤组织中的渗透，进一步提高对PSMA阳性肿瘤细胞的杀伤活性，并可有效抑制肿瘤生长和转移。相较于单独施用ADC药物或（FAK）抑制剂，本发明提供的药物组合物能够突破肿瘤微环境介导的肿瘤耐药和转移，并可拓宽ADC药物的治疗窗口以提高用药安全性，有望解决PSMA阳性去势转移性前列腺癌患者的临床用药需求。由实施例的结果表明，在PSMA表达阳性的LNCaP细胞中，本发明提供的药物组合物联合用药对LNCap细胞的杀伤活性高于ADC单药，其中ADC与GSK2256098的药物组合杀伤效果优于与VS-6063的药物组合；在C4-2B细胞中，本发明提供的药物组合物联合用药对LNCap细胞的杀伤活性高于ADC单药，其中ADC与GSK2256098和VS-6063的药物组合之间无明显差异；且联合用药对肿瘤细胞的杀伤活性具有PSMA特异性。

附图说明

图1为本发明实施例中MC-VC-PAB-MMAE的制备路线图；

图2为本发明实施例制备的人源化J591单抗在还原和非还原条件下SDS-PAGE电泳图；

图3为本发明实施例制备的人源化J591单抗在214 nm波长条件下的尺寸排阻色谱分析结果；

图4为本发明实施例制备的人源化J591单抗在280 nm波长条件下的尺寸排阻色谱分析结果；

图5为吸光度值与Biotin-PSMA重组蛋白浓度曲线图；

图6为人源化单抗J591对不同PSMA阳性肿瘤细胞系结合后荧光强度对比图；

图7为人源化单抗J591在不同PSMA阳性肿瘤细胞中的内化活性测定图；

图8为本发明实施例不同FAK抑制剂对前列腺癌肿瘤细胞系C4-2的杀伤IC

图9为本发明实施例不同FAK抑制剂对前列腺癌肿瘤细胞系LNCap的杀伤IC

图10为本发明实施例不同FAK抑制剂对前列腺癌肿瘤细胞系CP-3的杀伤IC

图11为本发明实施例提供的药物组合物联合用药对前列腺癌肿瘤细胞系LNCap的杀伤结果；

图12为本发明实施例提供的药物组合物联合用药对前列腺癌肿瘤细胞系C4-2B的杀伤结果；

图13为本发明实施例提供的药物组合物联合用药对前列腺癌肿瘤细胞系CP-3的杀伤结果。

具体实施方式

本发明提供了一种药物组合物，包括抗PSMA抗体-药物缀合物和黏着斑激酶抑制剂；

所述抗PSMA抗体-药物缀合物由人源化抗体J591或其功能性片段通过二肽连接子与微管蛋白抑制剂偶联得到。

在本发明中，若无特殊说明，所有制备原料/组分均为本领域技术人员熟知的市售产品。

本发明提供的药物组合物包括黏着斑激酶抑制剂。

在本发明中，黏着斑激酶（Focal Adhesion Kinase，FAK）是一种分子量为125kD的酪氨酸激酶，在细胞信号传导系统中起着至关重要的作用。FAK在多个癌细胞中过表达和/或过度磷酸化，导致细胞迁移、存活、增殖、粘附。此外，FAK与肿瘤的发生和发展密切相关。第二代FAK抑制剂地法替尼（defactinib，VS-6063），是一种安全性较高的FAK抑制剂，已被证明在1期临床试验中耐受性良好。GSK2256098已在几个I期临床试验中被评估，作为单药和与其他抗癌药物联合使用具有良好的耐受性和抗肿瘤活性。

在本发明中，所述黏着斑激酶抑制剂包括地法替尼（VS-6063）和/或GSK2256098，更优选为VS-6063或GSK2256098。

本发明提供的药物组合物包括抗PSMA抗体-药物缀合物。所述抗PSMA抗体-药物缀合物由人源化抗体J591或其功能性片段通过二肽连接子与微管蛋白抑制剂偶联得到。

在本发明中，所述人源化抗体J591优选包含重链和轻链。

在本发明中，所述轻链优选包含可变区和恒定区；所述轻链的可变区具有如SEQID NO.1所示的氨基酸序列，或者具有与SEQ ID NO.1至少80％序列同一性的序列，优选为85~99%，具体优选为85％、90％、95％、98％或者99％。

在本发明中，SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列为：

DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSIICKASQDVGTAVDWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSEDLADYFCQQYNSYPLTFGAGTMLDLK。

在本发明中，SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列获得，SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为：

GACATTGTGATGACCCAGAGCCACAAATTTATGAGCACCAGCGTGGGAGATAGAGTGAGTATTATCTGCAAGGCCAGCCAGGACGTGGGAACCGCCGTGGACTGGTATCAGCAGAAACCTGGCCAGAGCCCAAAACTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGACATACCGGAGTGCCCGACAGGTTCACAGGATCAGGCAGCGGCACAGACTTCACCCTGACCATCACCAACGTGCAGAGCGAGGACCTGGCCGACTATTTCTGCCAGCAGTACAACAGCTACCCCCTGACATTTGGAGCCGGCACCATGCTGGACCTGAAG。

在本发明中，所述轻链的恒定区优选为人源化的或人源的，更优选为人源的。

在本发明中，所述重链优选包含可变区和恒定区；所述重链的可变区具有如SEQID NO.3所示的氨基酸序列，或者具有与SEQ ID NO.3至少80％序列同一性的序列，优选为85~99%，具体优选为85％、90％、95％、98％或者99％。

SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列为：

EVQLQQSGPELKKPGTSVRISCKTSGYTFTEYTIHWVKQSHGKSLEWIGNINPNNGGTTYNQKFEDKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAAGWNFDYWGQGTTLTVSS。

在本发明中，SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列由SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列获得，SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列为：

GAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGGCCAGAGCTGAAGAAGCCAGGGACAAGCGTGAGAATTAGCTGCAAGACAAGCGGGTACACATTTACAGAGTATACCATTCACTGGGTGAAACAGAGCCACGGTAAGAGCCTGGAATGGATTGGAAACATCAACCCCAATAACGGAGGAACAACCTACAACCAGAAATTCGAGGACAAAGCCACCCTGACCGTGGACAAAAGCAGTAGCACCGCCTACATGGAGCTGAGAAGCCTGACCAGCGAAGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCGCCGGCTGGAACTTCGACTATTGGGGACAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGC。

在本发明中，所述重链的恒定区优选为人源化的或人源的，更优选为人源的。

在本发明中，所述人源化抗体J591的亚型优选包括IgM、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4中的一种或多种，更优选为IgG1。

在本发明中，所述微管蛋白抑制剂优选为澳瑞他汀类细胞毒性分子。

在本发明中，所述澳瑞他汀类细胞毒性分子优选包括单甲基耳抑素肽E（MMAE）和/或单甲基耳抑素肽F（MMAF），更优选为MMAE。

在本发明中，所述二肽连接子优选为Val-Cit连接子。

在本发明中，所述抗PSMA抗体-药物缀合物优选具有式1所示结构：

式1；

式1中，Ab为人源化抗体J591或其功能性片段，优选为人源化抗体J591；

P为1~16的任意整数，优选为4。

在本发明中，所述式1中的P表示所述抗PSMA抗体-药物缀合物分子中人源化抗体J591或其功能性片段与所述MMAE的摩尔比；在本发明的具体实施例中，抗PSMA抗体-药物缀合物分子中：所述人源化抗体J591和所述MMAE的摩尔比为1:4。

在本发明中，所述的PSMA抗体-药物缀合物的制备方法，优选包括以下步骤：

将还原剂、保护剂和人源化抗体J591混合，进行还原，得到还原后的人源化J591抗体；

将连接物、活性药物、偶联试剂和溶剂混合，进行偶联反应，得到linker-活性药物偶联物；

将所述还原后的人源化J591抗体、所述linker-活性药物偶联物和溶剂混合，进行偶联反应，得到PSMA抗体-药物缀合物。

本发明将还原剂、保护剂和人源化抗体J591混合，进行还原，得到还原后的人源化J591抗体。

在本发明中，所述人源化抗体J591的制备方法优选包括以下步骤：

将鼠源单抗J591的可变区与人IgG1κ恒定区通过重叠延伸PCR的方法连接成完整片段，将完整片段亚克隆到表达载体上，将构建的质粒转染到悬浮的宿主细胞中表达产生所述人源化抗体J591。

在本发明中，所述表达载体具体优选为表达载体pcDNA3.0。

在本发明中，所述宿主细胞具体优选为CHO细胞（Invitrogen）。

本发明优选从所述转染的悬浮的宿主细胞培养上清液中收集表达的人源化抗体J591。在本发明中，所述转染的悬浮的宿主细胞培养上清液中收集的为人源化抗体J591的粗品，本发明优选对所述人源化抗体J591的粗品进行纯化，得到人源化抗体J591的纯品。在本发明中，所述纯化优选采用Protein A进行纯化。

本发明优选通过所述SDS-PAGE电泳及SEC分析所述人源化抗体J591的纯度。

在本发明中，所述人源化抗体J591的纯品的纯度优选≥95%。

在本发明中，所述还原剂优选为三(2-羧乙基)膦盐酸盐（Tris-2-ca rboxyethyl-phos phine，简称为TCEP）。

在本发明中，所述保护剂优选为二乙基三胺五乙酸（Diethylenetriaminepentacetate acid，简称为DTPA）。

在本发明中，所述还原剂和所述保护剂的摩尔比优选为1~20:1~20。

在本发明中，所述还原剂和所述人源化抗体J591的摩尔比优选为1~4:1，更优选为3:1。

在本发明中，所述还原反应优选在溶液中进行。所述还原反应时的溶剂优选为PBS缓冲液。

在本发明中，所述还原剂、保护剂和人源化抗体J591的混合优选包括以下步骤：将还原剂和保护剂溶解于PBS缓冲液中，得到混合母液；将人源化抗体J591用30KD膜包超滤透析到PBS缓冲液中，浓缩后得到人源化抗体J591溶液；将所述混合母液和所述人源化抗体J591溶液混合。在本发明中，所述混合母液中，所述还原剂的摩尔浓度优选为1~20mM，所述保护剂的摩尔浓度优选为1~20mM；所述人源化抗体J591溶液的质量浓度优选为5~30mg/mL；所述混合母液和所述人源化抗体J591溶液的体积比优选为1:1。

在本发明中，所述还原反应的温度优选为37℃，所述还原反应的时间优选为30~120min，更优选为30min。

本发明将连接物、活性药物、偶联试剂和溶剂混合，进行偶联反应，得到linker-活性药物偶联物。

在本发明中，所述连接物优选为Fmoc-Val-Cit-PAB-PNP。

在本发明中，所述活性药物优选为MMAE。

在本发明中，所述linker-活性药物偶联物具体优选为MC-VC-PAB-MMAE。

在本发明中，所述MC-VC-PAB-MMAE的制备方法优选包括以下步骤：

将Fmoc-Val-Cit-PAB-PNP和MMAE溶于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，依次加入1-羟基苯并三唑（HoBt）和吡啶，室温下搅拌反应过夜；反应产物使用高效液相法进行分离纯化，收集纯品，冻干反应产物，得到所述MC-VC-PAB-MMAE的纯品。在本发明中，所述Fmoc-Val-Cit-PAB-PNP和MMAE的摩尔比优选为0.125:0.083；所述Fmoc-Val-Cit-PAB-PNP和HoBt的摩尔比优选为0.125:0.074；所述Fmoc-Val-Cit-PAB-PNP的物质的量和所述吡啶的体积之比优选为0.125mmol:0.5mL。

得到还原后的人源化J591抗体和所述linker-活性药物偶联物后，本发明将所述还原后的人源化J591抗体、所述linker-活性药物偶联物和溶剂混合，进行偶联反应，得到PSMA抗体-药物缀合物。

在本发明中，所述溶剂优选为二甲基亚砜（DMSO）和水；所述溶剂中DMSO的体积百分含量优选为25%。在本发明中，所述linker-活性药物偶联物与所述还原后的人源化J591抗体的摩尔比优选为1～2:1，更优选为1.5~2:1；所述偶联反应的温度优选为0~37℃，更优选为0℃，所述偶联反应的时间优选为30~120min，更优选为130min；所述偶联反应在搅拌的条件下进行。在本发明中，所述偶联反应得到的反应液，本发明优选采用PBS缓冲液对所述偶联反应得到的反应液离心超滤3次，纯化去除残余未反应linker-活性药物偶联物以及DMSO等游离小分子。在本发明中，本发明优选利用SDS-PAGE电泳和疏水高效液相(HIC-HPLC)法检测偶联情况。

在本发明中，所述PSMA抗体-药物缀合物具体优选为Ab-MC-VC-PAB-MMAE（记为YC1605）。

在本发明中，所述抗PSMA抗体-药物缀合物和黏着斑激酶抑制剂的摩尔比优选为(0.01~8):(1000~50000)。

在本发明的具体实施例中，本发明以对癌细胞有杀伤活性的抗PSMA抗体-药物缀合物和黏着斑激酶抑制剂的摩尔比范围具体优选为：所述黏着斑激酶抑制剂为VS-6063时，所述抗体-药物缀合物和所述VS-6063的摩尔比优选为0.0195~5 : 10000；所述黏着斑激酶抑制剂为GSK2256098时，所述抗体-药物缀合物和所述GSK2256098的摩尔比优选为0.03125~8 : 4101~4625。

在本发明中，所述药物组合物中，黏着斑激酶抑制剂的给药浓度范围优选为0.5～20 μM，更优选为0.8~19.5 μM。

本发明提供了上述技术方案所述的药物组合物在制备治疗PSMA阳性实体肿瘤药物中的应用。

在本发明中，所述PSMA阳性实体肿瘤为PSMA阳性去势转移性前列腺肿瘤。

本发明通过J591单克隆抗体偶联MMAE制备了ADC药物，并将ADC药物与FAK抑制剂VS-6063和GSK2256098组合用于治疗PSMA阳性肿瘤，可突破肿瘤微环境介导的肿瘤耐药和转移，并可拓宽ADC药物的治疗窗口以提高用药安全性，有望解决PSMA阳性去势转移性前列腺癌患者的临床用药需求。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

在本发明实施例中：

原料种类及来源为：

本发明中MC-MMAE、Fmoc-Val-Cit-PAB-PNP等小分子化学试剂均购自上海皓元生物医药有限公司；前列腺癌细胞系LNCap细胞、22RV1细胞和PC-3细胞购自武汉尚恩生物；C4-2B细胞购自北纳生物。Cell Counting Kit-8(CCK8)购自碧云天，人PSMA重组蛋白购自ACRO。Protein A抗体纯化填料购自GE公司，酶标仪购自OMEGA公司。

实施例1

人源化抗体J591的重组表达和纯化：

将鼠源单抗J591的可变区与人IgG1κ恒定区通过重叠延伸PCR的方法连接成完整片段，其中鼠源单抗J591的轻链的可变区具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，重链的可变区具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

将上述扩增片段亚克隆到表达载体pcDNA3.0上，将构建的质粒转染到悬浮的宿主细胞（Invitrogen）中以产生人源化抗体J591。从宿主细胞培养上清液中收集表达的抗体，经Protein A进行纯化。通过尺寸排阻色谱法和还原和非还原条件下SDS-PAGE分析抗体纯度，结果表明表达纯化的人源化抗体J591纯度大于95%，经0.22 μm滤膜过滤后内毒素含量小于1 EU/mg。纯化后的人源化抗体J591的SDS-PAGE分析结果如图2所示，尺寸排阻色谱分析结果见图3和图4所示。

图2为人源化抗体J591在还原和非还原条件下SDS-PAGE电泳图，其中：Lane M：Marker；Lane R：还原电泳；Lane N-R：非还原电泳。图3为：214 nm波长条件下SEC-HPLC图谱；图4为：280 nm波长条件下SEC-HPLC图谱。

实施例2

（1）人源化单抗J591的生物活性分析：

ELISA分析实施例1制备的人源化抗体J591对PSMA重组蛋白的结合活性：采用购自ACRO公司的PSMA重组蛋白验证表达的人源化单抗J591的结合活性。将人源化单抗J591稀释至2 μg/mL，100 μL/孔包被酶标板，4°C包被过夜。2%BSA 37 °C封闭2 h。将Biotin-PSMA重组蛋白稀释至1 μg/mL，2倍梯度稀释7个点，100 μL/孔加入酶标板，37 °C孵育1 h。100 μL/孔加入1:10000倍稀释的HRP-Streptavidin酶标二抗，37 °C孵育1 h后加入TMB显色液进行显色反应，2 M H

（2）流式细胞术分析J591对PSMA阳性肿瘤细胞系的结合活性：

检测人源化单抗J591对PSMA阳性前列腺癌细胞系LNCap细胞、C4-2B细胞和22RV1细胞，以PSMA阴性前列腺癌细胞系PC-3的结合活性。取对数生长期的上述四种细胞，消化后收集细胞，离心收集细胞沉淀，PBS重悬细胞后离心清洗细胞一次。去除离心后上清，PBS重悬细胞，计数后分别取上述细胞每种5×10

实施例3

Biacore测定人源化单抗J591亲和性：

为进一步表征抗PSMA的人源化单抗J591，测定了人源化单抗J591对人PSMA蛋白的亲和性。将重组PSMA蛋白固定在CM5Biacore芯片上，将分析物以0.125 μg/mL、0.25 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、4.0 μg/mL；浓度在流动相中与蛋白结合，流动相流速：30μL/min；结合时间：180 s；解离时间：300 s。测得实施例1制备的人源化单抗J591对人PSMA的结合亲和力Kd为1.612 nM。

实施例4

流式细胞术检测人源化单抗J591在PSMA阳性肿瘤细胞中的内化活性测定：

将LNCap细胞使用5 μg/mL，人源化单抗J591和对照抗体anti-hPSMA AF488在4℃下孵育30 min，洗涤后，将细胞在37℃孵育使抗体内化。分别在放入37℃环境中第0 min、30min、60 min、120 min时间点通过流式检测各组细胞的荧光强度，分析J591的内化活性。结果如图7，人源化单抗J591在PSMA阳性肿瘤细胞LNCap中具有较高内化活性，在第30 min、60min、120 min内化率分别为：18.71%、27.37%和45.67%。

实施例5

按照图1所示流程制备抗PSMA抗体-药物缀合物（MC-VC-PAB-MMAE）：

将Fmoc-Val-Cit-PAB-PNP (93mg,0.125mmol)和MMAE (60mg,0.083mmol)溶于4mLDMF中，依次加入HoBt(10mg，0.074mmol)和0 .5mL吡啶，37℃条件下搅拌反应过夜。反应产物使用制备液相进行分离纯化，收集纯品，冻干反应产物，制得MC-VC-PAB-MMAE。

抗PSMA抗体-药物缀合物的制备：

（1）人源化抗体J591的纯化及处理：

经Protein A从宿主细胞培养上清液中捕获的人源化抗体J591，通过SDS-PAGE电泳及SEC分析抗体纯度达到95%以上。用30KD膜包将所获抗体蛋白超滤透析到PBS缓冲液中，浓缩后用紫外分光光度计标定浓度，用于后续偶联反应；

（2）抗PSMA抗体-药物缀合物的制备

抗体-药物缀合物的制备采用通用的偶联方法：用PBS缓冲液分别配制还原剂和保护剂如下：1mM TCEP (Tris-2-ca rboxyethyl-phos phine)、1mM DTPA（Diethylenetriaminepentacetate acid）母液；与质量浓度为30mg/mL单克隆抗体按照体积比(1:1)混合，TCEP与抗体的终浓度摩尔比0.5:1，于25℃搅拌反应1h。TCEP还原后的抗体可直接进行偶联；

取实施例5制备的MC-VC-PAB-MMAE配制摩尔浓度为5mM的linker-活性药物偶联物，将实施5制备的MC-VC-PAB-MMAE溶于25％的DMSO水溶液 (dimethyl sulfoxide，二甲亚砜)，按照linker-活性药物偶联物的活性药物与还原后的抗体中的巯基的摩尔比1.5:1缓慢加药，于0℃搅拌反应120min。反应结束后，用PBS缓冲液离心超滤3次，纯化去除残余未反应药物以及DMSO等游离小分子，并且利用SDS-PAGE电泳和疏水高效液相(HIC-HPLC)法检测偶联情况；

通过本实施例提供的方法，制备了抗体-药物缀合物Ab-MC-VC-PAB-MMAE(即YC1605)，结构式如式1所示：

式1；

式1中，A为人源化抗体J591，p为4。

实施例6

不同FAK抑制剂对前列腺癌肿瘤细胞系的杀伤IC

（1）使用细胞计数试剂盒8(CCK-8)测定细胞活力。将前列腺癌细胞系LNCap、C4-2B、22RV1和PC-3细胞以5000细胞/孔接种到96孔板中，孵育过夜。

（2）用含10% FBS的培养基将FAK抑制剂VS-6063和GSK2256098分别进行2倍浓度梯度稀释后加入各细胞孔，同时设置空白对照组（无细胞和药物组）和阴性对照组（有细胞，无药物组），每个浓度梯度设置3复孔。将细胞板在37℃，5％CO

（3）每孔中加入10 μL CCK8试剂并放回培养箱中，孵育1h后检测450nm波长处的吸光度值。

（4）根据各组细胞检测的吸光度值，按式1所示公式计算细胞成活率，并使用PrismGraphPad软件分析数据绘制剂量反应曲线，并计算FAK抑制剂对4个细胞系的IC

细胞成活率=（加药组A

实施例7

ADC与FAK抑制剂组合对前列腺癌肿瘤细胞系的杀伤活性测定：

（1）使用细胞计数试剂盒8(CCK-8)测定细胞活力。将前列腺癌细胞系LNCap、C4-2B和PC-3细胞以3000-10000细胞/孔接种到96孔板中，孵育过夜。

（2）将实施例5制备的抗体-药物缀合物用含10% FBS的培养基稀释为8nM、4nM、2nM、1nM、0.5nM、0.25nM、0.125nM、0.0625nM和0.03125nM，分别加入各细胞孔，以J591裸抗体作为对照；并加入实施例6中计算所得各细胞对应的IC

（3）每孔加入10 μL CCK-8试剂继续培养1~2 h。观察颜色反应，并用酶标仪测定450 nm波长处的吸光度值，根据各组细胞的吸光度值，按式1公式计算细胞成活率，使用Prism GraphPad软件分析数据绘制剂量反应曲线，分析抗体-药物缀合物对四个细胞系的杀伤活性，其中，实施例5制备的抗体-药物缀合物（ADC）和VS-6063或GSK2256098联合用药时，ADC的浓度范围为：0.03125nM～8nM，FAK抑制剂GSK2256098的浓度为16μM，VS-6063的浓度范围为4.101μM～4.625μM。ADC与FAK抑制剂VS-6063的摩尔比为：0.0195~5 : 10000；ADC与FAK抑制剂GSK2256098的摩尔比为：0.03125~8 : 4101~4625。

结果如图11~13所示。结果表明在PSMA表达阳性的LNCaP细胞中，联合用药对LNCap细胞的杀伤活性高于ADC单药，其中ADC与GSK2256098的药物组合杀伤效果优于与VS-6063的药物组合；在C4-2B细胞中，联合用药对LNCap细胞的杀伤活性高于ADC单药，其中ADC与GSK2256098和VS-6063的药物组合之间无明显差异；且联合用药对肿瘤细胞的杀伤活性具有PSMA特异性。

细胞成活率=（加药组A

本发明利用J591单克隆抗体，采用MMAE作为活性分子，Val-Cit连接子，通过还原抗体链间二硫键与VC-MMAE偶联，构建了一种靶向PSMA以实体瘤治疗为主的抗体偶联药物YC1605，其具有对PSMA阳性肿瘤细胞较高的杀伤活性。

本发明提供了ADC分子与FAK抑制剂VS-6063（Defactinib）、GSK2256098的组合用于PSMA阳性实体肿瘤治疗。相较于单独施用ADC药物或FAK抑制剂，该组合治疗方法通过FAK抑制剂破坏肿瘤微环境提高药物在肿瘤组织中的渗透，进一步提高对PSMA阳性肿瘤细胞的杀伤活性，并可有效抑制肿瘤生长和转移。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。