用于人源转移型卵巢癌类器官的培养液及培养方法

技术领域

本发明属于生物医疗技术领域，具体涉及用于人源转移型卵巢癌类器官的培养液及培养方法。

背景技术

转移型卵巢癌恶性高，预后不良，需要依赖化疗药物辅助治疗。高侵袭转移能力的卵巢癌对常规化疗药物的耐药性较高，为临床治疗带来了巨大的挑战。临床上医生通常根据指南及经验进行给药治疗，这种方式往往导致患者遭受更大的药物副作用，因此建立一种体外试药模型可以帮助医生及患者进行精准用药，提高患者的生存质量。类器官是一种优秀的实验模型，其细胞组成比例，基因表达谱与体内相似度高达85％，基于该模型进行药物筛选不仅可以考虑到药物对肿瘤细胞的直接作用，还能涵盖细胞间的相互调控。因此，类器官的药敏结果相比2D肿瘤细胞的药敏结果数据与药物在体内的作用符合度更高。腹水的采集对患者的损伤较小，且腹水中的肿瘤细胞其恶性程度远高于原发灶，因此基于腹水源的类器官药敏结果能够更好的指导患者用药，目前尚无技术公开使用腹水来源的细胞样本进行卵巢癌的类器官构建，常规的类器官培养依赖于基质胶，需要将原代细胞悬液与基质胶按照一定比例预混，其3D结构的产生依赖基质胶的支撑。

发明内容

本发明的目的在于提供用于人源转移型卵巢癌类器官的培养液及培养方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：用于人源转移型卵巢癌类器官的培养液，包括Advance DMEM/F12培养基，所述Advance DMEM/F12培养基中包括有如下浓度的组分：10mM HEPPS、1X B27、1X N2、1X P/S、0.5μg/mL Primocin、25ng/mL Noggion、400ng/mL R-spondin 1、35ng/mL Wnt3a、70ng/mL EGF、35ng/mL bFGF、200ng/mL hGF10、10μM Y-27632、0.5μM SB-202190、2.5μM A-83-01、1X Glutamax、10mM Nicotinamide、1mM N-Acetyl-L-cysteine。

本发明还提供一种用于人源转移型卵巢癌类器官的培养方法，包括如下步骤：

S1、在25mL的细胞培养瓶中加入6mL的卵巢癌类器官悬浮培养液；

S2、使用1mL的卵巢癌类器官悬浮培养重悬转移型卵巢癌腹水原代细胞；

S3、将重悬液转入装有6mL卵巢癌类器官悬浮培养液的25mL的超低吸附细胞培养瓶，进行悬浮培养。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：通过该培养液和该培养方法，能够有效的培养诱导出转移型卵巢癌原代细胞发育成类器官，类器官的形态为葡萄串样与球囊样。本方案不需要基质胶，与传统的类器官培养方法不同，成本低；不再依靠基质胶操作简便；规避了基质胶带来的消化步骤，以及损耗，类器官细胞接触的营养相比基质胶体系更均匀。

附图说明

图1为腹水原代细胞明场图；

图2为腹水悬浮培养的P0代类器官图；

图3为腹水悬浮培养的P1代类器官图；

图4为技术重复1孔位明场变化图；

图5为技术重复2孔位明场变化图；

图6为技术重复3孔位明场变化图；

图7为卵巢癌类器官Epirubicin药物敏感曲线图；

图8为吸光度原始数据表。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了用于人源转移型卵巢癌类器官的培养液配方，包括Advance DMEM/F12培养基，所述Advance DMEM/F12培养基中包括有如下浓度的组分：10mM HEPPS、1X B27、1X N2、1X P/S、0.5μg/mL Primocin、25ng/mL Noggion、400ng/mL R-spondin 1、35ng/mLWnt3a、70ng/mL EGF、35ng/mL bFGF、200ng/mL hGF10、10μM Y-27632、0.5μM SB-202190、2.5μM A-83-01、1X Glutamax、10mM Nicotinamide、1mM N-Acetyl-L-cysteine。浓度单位mM表示毫摩尔每升，浓度单位μM表示微摩尔每升，几X表示对母液稀释的倍数。

HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸(化学式：C8H18N2O4S)，相对分子质量238.30。厂家aladdin，货号H109408-500g。溶剂ddH

Nicotinamide：烟酰胺(化学式：C6H6N2O)，相对分子质量122.13；厂家Merck，货号N0636-500G。溶剂DMSO；母液浓度1mol/L。

N-Acetyl-L-cysteine：N-乙酰L半胱氨酸(化学式：C5H9NO3S)，相对分子质量：163.195；厂家Merck，货号A9165-100G。溶剂DMSO；母液浓度1mol/L。

EGF：表皮生长因子；厂家Merck，货号N0636-500G。溶剂Dhank’s；母液浓度300μg/mL。

Y27632：ATP竞争性的ROCK-I和ROCK-II抑制剂(化学式：C14H21N3O.2HCl)，相对分子质量247.34；厂家MCE，货号HY-10071。溶剂DMSO；母液浓度10mmol/L。

A-83-01：小分子抑制剂(化学式：C6H6N2O)，相对分子质量：421.52；厂家MCE，货号N0636-500G，溶剂DMSO；母液浓度10mmol/L。

Wnt3a：Wnt3a蛋白；厂家MCE，货号HY-P70453B。溶剂Dhank’s；

母液浓度：300μg/mL。

hGF10：重组人成纤维细胞生长因子；厂家OrganRegen，货号816-FGF-0100，溶剂：Dhank’s；母液浓度：1mg/mL。

B27：厂家Gibco，货号17502-048。

N2：厂家Gibco，货号17504-044。

P/S(青霉素链霉素)：厂家ThermoFisher，货号15070063。

Primocin：厂家invivogen，货号ant-pm-05。

Noggin：厂家Sion Biological，货号10267-H02H。

R-spondin-1：厂家Sion Biological，货号11083-HO8H。

bFGF：厂家MCE，货号HY-P77654。

SB202190：厂家MCE，货号HY-10295。

Glutamax：厂家Gibco，货号35050-061。

配制方式：根据每次实验所需体积，按照配方表中的浓度换算成对应的体积，充分混匀后，经0.22μm滤膜抽滤除菌即可使用。由于配方中含有蛋白因子，使用期限建议控制在2个月内，储存方式：4℃避光。

本发明还提供一种用于人源转移型卵巢癌类器官的培养方法，包括如下步骤：

S1、在25mL的细胞培养瓶中加入6mL的卵巢癌类器官悬浮培养液；

S2、使用1mL的卵巢癌类器官悬浮培养重悬转移型卵巢癌腹水原代细胞；

S3、将重悬液转入装有6mL卵巢癌类器官悬浮培养液的25mL的超低吸附细胞培养瓶，进行悬浮培养部。

验证试验

一、样本：转移型卵巢癌患者腹水230mL。

二、转移型卵巢癌患者腹水原代细胞悬浮培养类器官：

1)腹水收集袋转移至生物安全柜内，将腹水倒入50mL离心管，每管装入35mL，离心收集沉淀(离心参数：4℃，2000rpm，5min)。

2)弃上清后每管加入2mL红细胞裂解液，使用移液器缓慢吹打混匀，完成后再次加入33mL红细胞裂解液，进一步吹打混匀，静置3min～5min。离心收集沉淀(离心参数：4℃，2000rpm，5min)。

3)弃上清后，观察沉淀颜色，若沉淀为米白色则代表裂红完成，若沉淀仍有红色表示还需进一步裂红。(注：不同患者来源的腹水其红细胞比例不同)。

4)在离心管中加入2mL的Dhank’s缓冲液，使用移液器缓慢吹打混匀，并将全部管中的悬浊液转移至一个离心管内，加入适量体积Dhank’s稀释细胞悬液。使用100μm的细胞筛过滤，除去大块的组织。

5)细胞筛滤出液离心收集沉淀(离心参数：常温，200rpm，5min)。

6)活率检测(基于countstart)。

7)显微镜下明场检测。

8)完成腹水原代细胞收集，腹水原代细胞明场如图1所示。

9)在25mL的细胞培养瓶中加入6mL的AUTGC卵巢癌类器官悬浮培养液。

10)使用1mL的AUTGC卵巢癌类器官悬浮培养液重悬转移型卵巢癌腹水原代细胞。

11)将重悬液转入装有6mL卵巢癌类器官悬浮培养液的25mL的超低吸附细胞培养瓶，进行悬浮培养(培养条件：37℃，5％CO2)，腹水悬浮培养的P0代类器官见图2。

三传代

1)将25mL培养瓶中的液体转移至15mL离心管，离心收集类器官沉淀(离心参数：1000rpm，5min)。

2)使用10mL的Dhank’s缓冲液清洗类器官，离心收集沉淀(离心参数：1000rpm，5min)。

3)加入2mL的tryplE消化类器官，(消化条件：37℃，3～8min)。

4)加入8mL的Dhank’s缓冲液稀释tryplE，离心回收沉淀(离心参数：1500rpm，5min)。

5)使用1mL的AUTGC卵巢癌类器官悬浮培养液重悬沉淀，并转入装有6mLAUTGC卵巢癌类器官悬浮培养液的25mL的超低吸附细胞培养瓶，进行培养，传代比例(1传2)，腹水悬浮培养的P1代类器官见图3所示。

药敏实验

1)测试药物：表柔比星。药物母液浓度均为10mM，溶解于DMSO。

2)类器官铺板

当类器官传至P2时，进行药敏铺板，为观察类器官在药物作用下不同时间的形态变化，类器官铺板时需要混入50％的基质胶。

3)分组处理

表柔比星药物浓度：0μM(对照组)，40μM，8μM，4μM，1.6μM，0.32μM，0.064μM；每种药物浓度设置3个重复。

4)药物处理时间：共计96小时，在0h，24h，48h，72h，96h五个时间节点对类器官进行4倍物镜的拍摄。

5)活率检测试剂：CCK-8，使用量10μL/100μL，反应时间，4h

6)活率计算公式：

活率＝(实验组相对吸光度/对照组相对吸光度平均值)*100；

实验组相对吸光度＝实验组吸光度-培养液(含药物表柔比星)吸光度平均值；

对照组相对吸光度＝实验组吸光度-培养液(不含药物)吸光度平均值；

7)药敏结果见图4～7所示。

从而得出结论：该例类器官对药物表柔比星的IC50为10.03μM，相对敏感。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。