鳞砗磲四碱基重复微卫星DNA分子标记

技术领域

本发明属于分子生物学DNA标记技术领域，具体涉及一种鳞砗磲四碱基重复微卫星DNA分子标记、检测引物、试剂盒及其应用。

背景技术

鳞砗磲(Tridacna squamosa)是一种中型规格砗磲种类，最大能生长至30-40cm，外壳有明显棱鳞，由外壳边缘成直行生长一直伸展至外壳底部，是一种重要的造礁护礁生物。在上个世纪，南海诸岛如南沙、西沙等岛屿都有一定的资源量，但近年来由于过度捕捞使鳞砗磲野生资源遭到严重破坏而急剧减少。鳞砗磲已被列入国家一级保护动物，并被世界自然保护联盟红色名录列为易危物种。为了保护鳞砗磲的野生资源，制定相应的保护策略，对其进行群体遗传多样性、群体遗传结构分析等相关工作已经非常迫切。

微卫星标记具有分布广泛、多态性信息高、共显性、符合孟德尔分离规律、易于PCR扩增、再现性好等优点，已经被广泛应用于海洋贝类的群体遗传结构分析、遗传连锁图谱构建、功能基因定位和遗传育种等领域。但目前从鳞砗磲基因组中开发微卫星标记的工作还未开展，尤其是针对四碱基重复微卫星标记的筛选工作还未见报道。

四碱基重复微卫星标记在应用和操作上具有一些独特的优势。现阶段的微卫星标记应用中，在测序仪上进行大批量地、精确地基因分型越来越普遍，也越来越重要，而两碱基重复微卫星标记在毛细管测序胶上很容易出现影子带、杂带，影响了基因分型的准确性，而四碱基重复微卫星标记却可以减少这种现象的产生，增加了它的应用前景和范围。因此需要针对鳞砗磲筛选四碱基重复微卫星标记用于群体遗传结构相关的遗传分析。

发明内容

本发明目的是提供鳞砗磲的四碱基重复微卫星位点及多态性引物，即提供1个稳定性高、特异性强的鳞砗磲多态性四碱基重复微卫星位点，以及相应的多态性微卫星引物，为鳞砗磲群体遗传结构分析、亲权鉴定及分子标记辅助育种提供有效的工具。

本发明通过构建鳞砗磲微卫星(CACT)

因此，本发明的第一个目的是提供一种鳞砗磲四碱基重复微卫星DNA分子标记，所述微卫星分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供一种上述的鳞砗磲四碱基重复微卫星DNA分子标记的扩增引物，所述扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～3所示。

本发明的第三个目的是提供一种试剂盒，所述的试剂盒包括上述的扩增引物，还包括用于PCR扩增的酶、缓冲液、dNTP和无菌水。

本发明的第四个目的是提供上述的微卫星分子标记、扩增引物或试剂盒在鳞砗磲遗传分析中的应用。

优选的，所述的遗传分析包括遗传多样性分析、群体遗传结构分析、基因流分析、聚类分析和构建分子指纹图谱中的一种或多种。

本发明的第五个目的是提供上述的微卫星分子标记、扩增引物或试剂盒在鳞砗磲亲权鉴定中的应用。

本发明的第六个目的是提供上述的微卫星分子标记、扩增引物或试剂盒在鳞砗磲分子标记辅助育种中的应用。

优选的，所述的应用，包括如下步骤：

(1)提取鳞砗磲的基因组DNA；

(2)以鳞砗磲的基因组DNA为模板，使用上述的扩增引物进行PCR扩增得到扩增产物；

(3)将扩增产物进行检测，根据检测结果进行微卫星位点多态性评估。

步骤(3)中所述的检测包括克隆测序、毛细管荧光电泳或聚丙烯酰氨凝胶电泳。

本发明首次提供了1个鳞砗磲的四碱基重复微卫星位点及扩增这个微卫星位点的引物序列和扩增方法，可应用于鳞砗磲的群体遗传结构分析、亲权鉴定及分子标记辅助育种等领域的研究，重复性好，是一种可靠有效的分子标记。

附图说明

图1为TS201位点的特异性引物扩增21个鳞砗磲个体的银染PAGE图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1

1、鳞砗磲微卫星DNA富集文库的构建

1.1基因组DNA的提取和酶切

剪取90％酒精固定的鳞砗磲闭壳肌组织30mg，用蒸馏水浸泡2次，每次20min后换水，以彻底除去闭壳肌中残存的酒精。用剪刀将闭壳肌充分剪碎，用干净的滤纸吸除水分后放入1.5mL离心管中，再加入400μL裂解液和10μL蛋白酶K(10mg/mL)，在振荡器上混匀，55℃水浴消化6h，直到裂解液澄清为止。加入等体积饱和酚(200μL)、氯仿/异戊醇(体积比，24:1)(200μL)混合液抽提两次。用1.2mL的无水乙醇沉淀DNA，经70％酒精洗涤，室温晾干后溶于50μL的灭菌水中。紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度，并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。用限制性核酸内切酶Sau3AI酶切基因组，1％的琼脂糖凝胶电泳后，胶回收试剂盒纯化回收400-900bp的酶切DNA片段。

1.2与接头连接及第一次PCR扩增

寡核苷酸链A(Sau 3AI-L:5’-GCGGTACCCGGGAAGCTTGG-3’)和B(Sau 3AI-R:5’-GATCCCAAGCTTCCCGGGTACCGC-3’)溶液各10μL于PCR小管中混合，在95℃变性10min，然后自然冷却。酶切产物与双链接头的连接采用T4 DNA接酶，16℃过夜连接。以连接产物为模板，Sau 3AI-L为引物进行第一次PCR扩增，25μL反应体系如下：12.5μL

1.3磁珠富集及第二次PCR扩增

将纯化产物与生物素标记的寡核苷酸探针(CACT)

1.4连接转化

将第二次PCR纯化产物与pGEM-T Easy载体(Promega公司)进行连接，4℃连接过夜。转化入JM109感受态细胞，涂布于LB平板上进行培养直至长出单菌落。

1.5三引物法检测阳性克隆、测序及引物设计

挑取单菌落到96孔培养板中，进行扩大培养。用

SP6(CATACGATTTAGGTGACACTATAG)、T7(TAATACGACTCACTATAGGGCGA)和核心序列(CACT)

2、鳞砗磲多态性性四碱基重复微卫星引物的筛选及结果分析

2.1筛选有多态性的引物

参照1.1方法提取21个鳞砗磲野生样品的基因组DNA，然后使用得到1对微卫星引物(表1)进行RCR扩增。扩增反应体系为25μL，反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，变性至延伸三个步骤重复30次，72℃延伸10min。PCR产物用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，银染法染色，UMAX扫描仪进行扫描。共得到1个具有多态性的微卫星标记(见表1)：TS201，TS201为342个核苷酸，序列如SEQ ID NO.1所示。

TS201(SEQ ID NO.1)：

GATCAAAAATGACAAAAAGGAAAAACAGTCCAAGCGTTCAGATGTGACCTGGAGTAAGGCGTTAA

TGACAGACAATCGGATAAAAGCTGTCCCTAATACTCACTCACTCACTCTTTACTCACTCAACTACCC

GTTCACTCACTCAACCATCCCTTCACTCACTCACCTCACTCACTGATGCACTCACTGACGCACTCAC

ACACTCACACACTCACTCACTCACTCACTCACTCACTCACTCACCCGTTCTCTTACACTGACTGATT

GACTGACTCACTCACTCACTCATCCTGCCACCCATCTACCCTATTATTCACTCACTCTGCCACCTAGCACTCACTC。

表1引物特性表

2.2结果分析

使用POPGENE软件计算等位基因数、观察杂合度和期望杂合度，以此来描述这个鳞砗磲四碱基重复微卫星DNA多态位点的特征。

由图1可知，本发明的四碱基重复微卫星序列的长度在供试的21个鳞砗磲样品中都出现了多态性，具有扩增稳定性高、特异性强的优点。由此可见，这个四碱基重复微卫星标记今后能用于鳞砗磲的野生群体评价和遗传连锁图谱构建等工作。

本发明首次提供了1个鳞砗磲的四碱基重复微卫星位点及扩增这个微卫星位点的引物序列和扩增方法，可应用于鳞砗磲的群体遗传结构分析、亲权鉴定及分子标记辅助育种等领域的研究，重复性好，是一种可靠有效的分子标记。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。