伯克霍尔德氏菌MGS2在生产铁载体中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，更具体地说，涉及伯克霍尔德氏菌MGS2在生产铁载体中的应用。

背景技术

铁是植物生长发育所必需的微量元素之一，对于植物的生长发育有着至关重要的作用，对于目前的种植业来说，植物缺铁会带来巨大的经济损失。地壳中是高氧低铁的环境，加之土壤盐渍化日益严重，土壤中可植物吸收利用的铁十分匮乏。虽然氨基多羧酸(APCA)等铁离子强螯合剂可以缓解植物缺铁问题，但这些化合物通常不可被生物降解，会对水生系统造成污染，与绿色可持续发展理念相悖。

土壤中有一类微生物可以自行合成和分泌分泌一种或多种铁载体以克服环境中铁有效性低的问题，这类微生物被称为产铁载体微生物(siderophore-producingbacteria)。它们产生的铁载体是一种天然的，可生物降解的能铁离子强螯合剂，能够特异性螯合周围环境中的铁离子，形成“铁离子-嗜铁素”复合物。该复合物既可以在满足自身对铁元素的需求的前提下给植物提供铁营养，还可以通过与病原菌争夺有限的铁元素来抑制病原菌的生长，从而促进植物的生长。

已有的许多研究都证明了不同产铁载体细菌在植物促生、农业修复及医药等领域积极作用。中国专利CN 109913393 A公开的洋葱伯克霍尔德氏菌P10具有溶解无机磷、产ACC脱氨酶及分泌铁载体的功能，在植物生长促生，开发成微生物菌剂的潜力大，尤其对花生促生有明显的有益效果。中国专利CN 114437962 A公开的BsNLG8菌株可以显著降低水稻稻瘟病的病情指数，提高稻瘟病的防治效果。但土壤环境中微生物种类众多，不同菌株的作用能力差异较大，为了更好的发挥菌株的优异特性，仍然需要筛选更多优良产铁载体菌株。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供伯克霍尔德氏菌MGS2在生产铁载体中的应用，用于筛选优良产铁载体菌株。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

伯克霍尔德氏菌MGS2在生产铁载体中的应用，所述的伯克霍尔德氏菌MGS2序列如SEQ ID NO.1所示；其分类命名为Burkholderia diffusa MGS2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2023年5月26日，保藏编号CCTCC No:M 2023828，保藏地址：中国武汉武汉大学。

伯克霍尔德氏菌MGS2在促进栓皮栎生长中的应用。

伯克霍尔德氏菌MGS2在促进栓皮栎株高增加中的应用。

伯克霍尔德氏菌MGS2在促进栓皮栎叶干重增加中的应用。

伯克霍尔德氏菌MGS2在促进栓皮栎根干重增加中的应用。

伯克霍尔德氏菌MGS2的菌剂在促进栓皮栎生长中的应用。

伯克霍尔德氏菌MGS2的菌剂在生产铁载体中的应用。

伯克霍尔德氏菌MGS2的菌剂在促进栓皮栎株高增加中的应用。

伯克霍尔德氏菌MGS2的菌剂在促进栓皮栎叶干重增加中的应用。

伯克霍尔德氏菌MGS2的菌剂在促进栓皮栎根干重增加中的应用。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

1)本发明的伯克霍尔德氏菌MGS2的48小时产铁量为81.93％，分离物的吸光值与超纯水的吸光值的比值为0.1810±0.0464，产铁载体能力为++++。

2)本发明的伯克霍尔德氏菌MGS2菌剂实验组植株的株高比对照组高1.73cm；叶干重和根干重分别比对照组高出3.83％和4.99％。

附图说明

图1为伯克霍尔德氏菌MGS2在CAS检测培养基上的生长情况图；

图2为伯克霍尔德氏菌MGS2的系统发育树图；

图3为伯克霍尔德氏菌MGS2的革兰氏染色图；

图4为伯克霍尔德氏菌MGS2菌剂对栓皮栎幼苗茎粗的影响图(*为与对照组相比差异达到显著水平P＜0.05)；

图5为伯克霍尔德氏菌MGS2菌剂对栓皮栎幼苗株高的影响图(*为与对照组相比差异达到显著水平P＜0.05)；

图6为伯克霍尔德氏菌MGS2菌剂对栓皮栎幼苗叶干重与根干重的影响图(*为与对照组相比差异达到显著水平P＜0.05)。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中如无特殊说明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

栓皮栎新鲜根际土取自山东省临沂市平邑县的明光寺林场内(北纬35°34′46″，东经117°50′39″)，所有样品一分为二，一份放到-80℃冰箱中保存，一份用于分离细菌。

TSB培养基：胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，水1000mL，pH7.3±0.2。

CAS检测培养基：铬天青S 60.5mg，十六烷基三甲基溴化铵72.9mg，六水氯化铁2.645mg，二水磷酸二氢钠295.25mg，十二水磷酸氢二钠1213.5mg，氯化铵125mg，磷酸二氢钾37.5mg，氯化钠62.5mg，葡萄糖5000mg，琼脂15000mg，pH值6.8±0.1。

KMB培养基：丙三醇15mL，酪蛋白氨基酸5g，磷酸二氢钾2.5g，结晶硫酸镁2.5g，pH值7.2。

TSB培养液：胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，pH值7.2。

LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，pH值7.1-7.3。

实施例1

1、细菌的分离与纯化

称量5g栓皮栎新鲜根际土加到含有20-30颗无菌玻璃珠的45mL TSB培养基中，放到震荡培养箱中，28℃，180rpm/min培养12h，进行菌种富集与活化；取1mL上清液梯度稀释至10

2、细菌的筛选和鉴定

将分离得到的细菌接种到CAS检测培养基中，用封口膜将培养平板封口后，28℃倒置培养7天。

将0.079g铬天青，完全溶解于50mL超纯水中，得到溶液A；0.069g十六烷基三甲基溴化铵溶于40mL超纯水中，不断搅拌至完全溶解产生大量绵密的气泡，得到溶液B；对溶液A和溶液B进行121℃高压蒸汽灭菌20min；将溶液冷却至室温，向A中缓慢加入10mL过滤除菌后的1mmol/L Fecl

制备在600nm下吸光值为0.6的菌液作为种子液；吸取500μL种子液添加到50mLKMB培养基中，对照组接等量未加菌的TSB培养液，每个处理三个重复；在摇床中恒温培养2d，4℃、10000rpm离心10min取上清；上清液与CAS检测液等体积混匀静置1h后再次离心，取上清液加到96孔板中，以超纯水为对照，检测其在OD630下的吸光值。

Ar为超纯水的吸光值，As为分离物的吸光值，SU为铁载体的活性单位；As与Ar的比值在0-1之间，每减少0.2就增加1个+。

结果如图1所示，经过筛选得到一株在CAS检测平板上产生明显橙色透明圈的细菌，其透明圈直径与菌落直径比值为4.125，菌株编号为MGS2。该菌48小时产铁量为81.93％，As与Ar的比值为0.1810±0.0464，产铁载体能力为++++。

用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取DNA，采用通用引物27-F(5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3')和1492-R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳观察，回收DNA片段送至上海生工生物工程公司完成序列测定，得到菌株MGS2的16SrDNA序列，碱基长度为1472bp，其序列如SEQ ID NO.1所示。将上述序列在EzBioCloud数据库上进行BLAST分析，并且利用MEGA7.0构建系统系统发育树(图2)，该菌株与Burkholderia diffusa的序列相似度为99.86％。测序结果经BLAST比对，鉴定该菌株为伯克霍尔德氏菌Burkholderia diffusa MGS2。

在载玻片中央用无菌注射器滴一小滴生理盐水，用无菌牙签蘸取少量新鲜细菌于生理盐水中涂匀，经结晶紫初染、碘液媒然、乙醇脱色和沙黄复染对细菌进行革兰氏染色，在油镜下观察单个细菌的形态(图3)，其生理生化特征如表1所示。

表1伯克霍尔德氏菌MGS2的生理生化特征

实施例2

将长相健康、大小相近的栓皮栎种子用1％高锰酸钾进行消毒处理，超纯水冲洗掉种子上残余的高锰酸钾，然后将种子包裹到煮沸消毒后湿纱布里，移置培养箱中(27℃，湿度75，光照12h)催芽，每隔一天洒适量水使纱布保持湿润，等种子冒出约2cm的胚根后，栽种到32孔育苗盘里，半个月后，从育苗盘里挑选长势大体一致的栓皮栎幼苗，移栽到121℃高压蒸汽灭菌90min后的无菌山土中。

将伯克霍尔德氏菌MGS2接种至LB液体培养基摇培过夜，取菌悬液离心，弃上清，用无菌水将菌体洗涤三次；再次用无菌水将菌体重悬，并用紫外分光光度计调节其吸光值OD600到0.6，制得接种用的伯克霍尔德氏菌MGS2菌剂。设置实验组和对照组各三组，每组三棵幼苗，移栽到第四天时，实验组每株苗采用灌根法添加10mL菌剂，对照组浇等量无菌水。三个月后，用直尺测量实验组和对照组各株苗的株高，用游标卡尺测其茎粗。取六组植株的所有叶片和根系于烘箱中105℃烘干2h，等温度降到60℃以下后，用电子分析天平测量每组叶片及根系的干重。

结果如图4所示，施用伯克霍尔德氏菌MGS2菌剂，对栓皮栎幼苗的茎粗没有显著促进作用。

结果如图5所示，实验组植株的株高比对照组高1.73cm。

结果如图6所示，叶干重和根干重分别比对照组高出3.83％和4.99％。