一株宽宿主谱的肺炎克雷伯菌噬菌体及其组合物与应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域,具体涉及一株宽宿主谱的肺炎克雷伯菌噬菌体及其组合物与应用。

背景技术

肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae,KP)为革兰氏阴性细菌,属于肠杆菌科,是一种人畜共患病病原菌,广泛分布于水、土壤、粪便、医院、社区、动物和人类等各种环境中。临床上肺炎克雷伯菌可引起尿路、肺部感染、菌血症、外科术后感染等。

由于抗生素的滥用,使得肺炎克雷伯菌的抗药性日益严重,导致了“多重耐药肺炎克雷伯菌”甚至“全耐药肺炎克雷伯菌”的出现。产超广谱β-内酰胺和耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌已被世界卫生组织确定为严重的公共卫生威胁,并归类为超级细菌,给临床治疗带来了巨大困难。为此,如何高效的抑制多重耐药肺炎克雷伯菌成为了一项亟待解决的问题。而作为细菌“天然杀手”的噬菌体由于其数量繁多、抗菌活性高的特点,近年来被越来越多地用于治疗多重耐药菌的感染。

噬菌体(bacteriophage,phage)是一类以特定的细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物作为宿主的病毒。与别的病毒相似,噬菌体的头部是由包裹着遗传物质的蛋白质衣壳构成。有尾噬菌体还具有长短不一、形态多样的"尾巴",用来特异性识别宿主菌,并将遗传物质注入宿主体内。与传统抗生素药物相比,噬菌体具有杀菌能力强、高特异性、安全性高、低成本等优势,且其杀菌能力不依赖于细菌的耐药性,因此噬菌体在防治细菌感染尤其是耐药细菌感染方面展现出极大的应用潜力。

噬菌体无疑是克制耐药菌的有利武器,其应用范围十分广泛。早在100多年前,在噬菌体发现之初,欧洲一些国家已经尝试用其治疗痢疾等疾病。后来由于抗生素的发现和广泛使用,使得许多国家放弃了噬菌体治疗。但如今细菌耐药性问题的日益严重,噬菌体疗法重新得到重视,在国内外已经开展了多例噬菌体个性化治疗耐药肺炎克雷伯菌感染的临床案例,展示了噬菌体治疗的巨大潜力。

目前,专利CN 113201506 A公开了一株从医院污水处理厂的污水中分离出的可裂解多重耐药肺炎克雷伯菌17-11的烈性噬菌体vB_kpnM_17-11,保藏号为CCTCC NO:M2021408。该噬菌体属于有尾噬菌体目、肌尾噬菌体科,具有较宽的温度耐受范围,pH稳定性好,且对肺炎克雷伯菌的特异性强、裂解效率高,可应用在裂解肺炎克雷伯菌、制备裂解肺炎克雷伯菌的药物等方面。专利CN 113174372 A公开了一株噬菌体vB_KpnS_ZH01,是一株以K2型肺炎克雷伯菌的噬菌体突变株为宿主菌分离的新噬菌体,该噬菌体具有较窄的杀菌谱,可以感染、杀灭肺炎克雷伯菌,更重要的是对已报道的噬菌体抗性株有杀菌活性,为肺炎克雷伯菌噬菌体鸡尾酒治疗法提供了基础。但现有噬菌体的特异性强,宿主谱窄,不利于大多数耐药细菌的配型。并且现有噬菌体的制剂形式、应用范围有限,不利于充分发挥噬菌体的杀菌效果。

发明内容

本发明的目的是,提供一株宽宿主谱的肺炎克雷伯菌噬菌体及其组合物与应用。基于不同的天然噬菌体拥有不同的裂解谱范围,因此通过噬菌体组合可以一定程度上突破上述噬菌体治疗的瓶颈,大幅拓宽了宿主谱,在临床治疗肺炎克雷伯菌感染和环境净化中具有广阔的应用潜力。

本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下:

本发明提供一株肺炎克雷伯菌噬菌体,所述噬菌体CP-p-KP-21099,保藏编号为:CCTCC M2023064；所述噬菌体于2023年01月10日保藏于中国典型培养物保藏中心,分类命名为长尾病毒家族Podoviridae。

本发明还提供一株肺炎克雷伯菌噬菌体,所述噬菌体CP-p-KP-21013,保藏编号为:CGMCC 45411；所述噬菌体于2023年01月09日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,分类命名为短尾病毒家族Podoviridae。

本发明还提供一株肺炎克雷伯菌噬菌体,所述噬菌体CP-p-KP-21016,保藏编号为:CGMCC 45412；所述噬菌体于2023年01月06日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,分类命名为肌尾病毒家族Myoviridae。

本发明还提供一株肺炎克雷伯菌噬菌体,所述噬菌体CP-p-KP-21069,保藏编号为:CGMCC 45413；所述噬菌体于2023年01月06日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,分类命名为短尾病毒家族Podoviridae。

本发明还提供一株肺炎克雷伯菌噬菌体,所述噬菌体CP-p-KP-21076,保藏编号为:CCTCC M2023063；所述噬菌体于2023年01月10日保藏于中国典型培养物保藏中心,分类命名为短尾病毒家族Podoviridae。

本发明还提供一种肺炎克雷伯菌噬菌体组合物,所述组合物为所述的噬菌体CP-p-KP-21099与噬菌体CP-p-KP-21013,噬菌体CP-p-KP-21016,噬菌体CP-p-KP-21069或噬菌体CP-p-KP-21076中一株或多株组合而成。

作为优先实施方式,所述噬菌体CP-p-KP-21099包含SEQ ID NO.11所示的特异性核苷酸序列；所述噬菌体CP-p-KP-21013包含SEQ ID NO.12所示的特异性核苷酸序列；所述噬菌体CP-p-KP-21016包含SEQ ID NO.13所示的特异性核苷酸序列；所述噬菌体CP-p-KP-21069包含SEQ ID NO.14所示的特异性核苷酸序列；所述噬菌体CP-p-KP-21076包含SEQ IDNO.15所示的特异性核苷酸序列。

本发明还提供一种用于防治肺炎克雷伯菌的制剂,所述制剂包含所述的肺炎克雷伯菌噬菌体或所述的肺炎克雷伯菌噬菌体组合物。

作为优先实施方式,所述制剂为抗菌药物和/或环境消杀剂。

本发明还提供一种非疾病诊断目的的检测肺炎克雷伯菌噬菌体的引物组,所述噬菌体包括CP-p-KP-21099、CP-p-KP-21013、CP-p-KP-21016、CP-p-KP-21069或CP-p-KP-21076中的任意一株,其中,

所述CP-p-KP-21099的引物组为引物对P-KP099-F/P-KP099-R,所述P-KP099-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述P-KP099-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述CP-p-KP-21013的引物组为引物对P-KP013-F/P-KP013-R,所述P-KP013-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,所述P-KP013-R的核苷酸序列SEQ ID NO.4所示；

所述CP-p-KP-21016的引物组为引物对P-KP016-F/P-KP016-R,所述P-KP016-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示,所述P-KP016-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述CP-p-KP-21069的引物组为引物对P-KP069-F/P-KP069-R,所述P-KP069-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示,所述P-KP069-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

所述CP-p-KP-21076的引物组为引物对P-KP076-F/P-KP076-R,所述P-KP076-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示,所述P-KP076-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

本发明还提供所述的肺炎克雷伯菌噬菌体或所述的肺炎克雷伯菌噬菌体组合物在防治肺炎克雷伯菌污染方面的应用。

本发明所涉及的序列如下所示：

与现有技术相比,本发明的有益效果如下:

1，本发明从不同环境中分离多种肺炎克雷伯菌噬菌体(共26株),使用来自全国不同地区多家医院的临床耐药肺炎克雷伯菌93株对分离的26株肺炎克雷伯菌噬菌体进行裂解谱分析,发现其中两株肺炎克雷伯菌噬菌体相对于其他噬菌体具有明显的裂解优势。其中,肺炎克雷伯菌噬菌体CP-p-KP-21099和CP-p-KP-21013分别能够裂解27株和23株不同类型的肺炎克雷伯菌,在临床应用中具有很大潜力。

2，本发明提供的肺炎克雷伯菌噬菌体CP-p-KP-21099、CP-p-KP-21013的最佳感染复数为10

3，本发明提供的噬菌体CP-p-KP-21099,噬菌体CP-p-KP-21013,噬菌体CP-p-KP-21016,噬菌体CP-p-KP-21069和噬菌体CP-p-KP-21076的感染宿主菌潜伏期分别为5min、5min、0min、5min和10min；这五株噬菌体的一个裂解周期分别为20min,40min,20min,10min和20min；说明该五株噬菌体能够在短时间内大量扩增,具有高效的裂解活性。

4，本发明提供的肺炎克雷伯菌噬菌体能够特异性杀死肺炎克雷伯菌,与细菌是否含有耐药基因无关。

5，本发明提供的肺炎克雷伯菌噬菌体组合物,拓宽了宿主谱和裂解能力,在临床治疗肺炎克雷伯菌感染和环境净化中具有广阔的应用潜力。

6，本发明采用分离于不同地区不同医院的93株肺炎克雷伯菌临床株,并进行噬菌体与宿主的互作分析,提供了肺炎克雷伯菌噬菌体组合物,该噬菌体组合物与单株噬菌体相比,拓宽了所能裂解的宿主谱,覆盖率大幅提高。

附图说明

图1是本发明的噬菌体纯化结果图，其中，A为噬菌体CP-p-KP-21099，B为噬菌体CP-p-KP-21013，C为噬菌体CP-p-KP-21016，D为噬菌体CP-p-KP-21069，E为噬菌体CP-p-KP-21076。

图2为本发明的噬菌体透射电镜结果图，其中，A为噬菌体CP-p-KP-21099，B为噬菌体CP-p-KP-21013，C为噬菌体CP-p-KP-21016，D为噬菌体CP-p-KP-21069，E为噬菌体CP-p-KP-21076。

图3为本发明的PCR扩增五株噬菌体特异性序列核酸电泳图，其中，A为噬菌体CP-p-KP-21099，B为噬菌体CP-p-KP-21013，C为噬菌体CP-p-KP-21016，D为噬菌体CP-p-KP-21069，E为噬菌体CP-p-KP-21076，M为Marker。

图4为本发明肺炎克雷伯菌噬菌体的最佳感染复数结果图，其中，A为噬菌体CP-p-KP-21099，B为噬菌体CP-p-KP-21013，C为噬菌体CP-p-KP-21016，D为噬菌体CP-p-KP-21069，E为噬菌体CP-p-KP-21076。

图5为本发明噬菌体的一步生长曲线图，其中，A为噬菌体CP-p-KP-21099，B为噬菌体CP-p-KP-21013，C为噬菌体CP-p-KP-21016，D为噬菌体CP-p-KP-21069，E为噬菌体CP-p-KP-21076。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明,均为商业化产品。

(1)LB(Luria broth)液体培养基(1L):蛋白胨10g,酵母粉5g,NaCl 10g,加ddH

(2)0.5％ LB半固体培养基(1L):蛋白胨10g,酵母粉5g,NaCl 10g,,琼脂粉5g,加ddH

(3)1.5％ LB固体培养基(1L):蛋白胨10g,酵母粉5g,NaCl 10g,琼脂粉15g,加ddH

实施例1:肺炎克雷伯菌噬菌体分离

污水样品采自上海市公共卫生中心外科大楼下水道、上海交通大学附属瑞金医院、复旦大学附属金山医院下水道,取20mL污水样品于4℃、12000rpm离心10min,上清液用0.22μm滤膜过滤,滤液备用。取9mL上清滤液,加入1mL 10倍的LB液体培养基,同时加入0.1mL噬菌体,对数期宿主菌菌液,放置于37℃培养过夜。次日,4℃、12000rpm离心10min,上清用0.22μm滤膜过滤除菌,形成含有噬菌体的原液,即噬菌体悬液。

取不同的临床耐药菌株划线接种于1.5％ LB固体培养基上,37℃培养过夜后,挑取单克隆接种于5mL LB液体培养基中,37℃振荡培养8h后作为宿主菌培养物备用。吸取上述备用的宿主菌培养物0.3mL和3mL 0.5％ LB半固体培养基混合均匀后平铺于1.5％ LB固体培养基上,待其晾干后将琼脂平板划分为2个区域,取上述噬菌体悬液10μL滴于其中一个区域,另一区域滴加等量PBS做对照,待自然晾干后,置于37℃培养箱培养后,观察滴加噬菌体区域有无空斑形成。若有空斑形成,证明有噬菌体存在。

实施例2:肺炎克雷伯菌噬菌体纯化

挑取实施例1中的噬菌体空斑至装有0.5mL PBS的无菌EP管中,置于4℃过夜以释放出噬菌体,得到噬菌体浸出液。利用双层平板法,将噬菌体浸出液连续10倍稀释,分别取出10

实施例3:肺炎克雷伯菌噬菌体及细菌的聚类分析及裂解谱分析

根据噬菌体和宿主之间的裂解对应关系可以对分别对噬菌体和细菌进行聚类分析,聚集到同一个簇中的不同对象之间有很大的相似性,不同簇间的对象有很大的差异性,具体分析过程如下:

(1)首先使用来自全国不同地区多家医院的临床耐药肺炎克雷伯菌93株和用不同的污水分离出的肺炎克雷伯菌噬菌体26株进行裂解谱分析,具体操作如下:

1)分别取肺炎克雷伯菌的对数期菌液0.3ml,加入55℃左右的0.5％ LB半固体培养基3ml,均匀铺在预先制备好的固体1.5％LB固体培养基上；

2)然后将每个平板平均分成两个区域,取2μL实施例2中备用的噬菌体滴加在其中一个区域,另一个区域滴加等量PBS作对照,待液滴干燥后倒置于37℃培养12h。噬菌斑为细菌生长的平板上噬菌体裂解形成的空斑,根据有无噬菌斑分为有(+)、无(空格)。

(2)统计裂解谱结果,根据噬菌斑形态分为大而透亮(LT)、小而透亮(ST)、大而浑浊(LO)、小而浑浊(SO)和无噬菌斑(NP)；

(3)将噬菌斑透亮程度符号转化为数值(0为无噬菌斑,1为噬菌斑模糊,2为噬菌斑小而透亮,3为噬菌斑大而透亮)；

(4)使用RStudio软件加载R包的函数进行绘图；

(5)对生成的聚类结果进行分析。

试验结果:结果如表1所示,表1是26株肺炎克雷伯菌噬菌体的裂解谱结果,根据裂解谱及聚类分析结果选择宿主谱相对较广且相互补充的噬菌体进行组合。本发明中将噬菌体CP-p-KP-21099、噬菌体CP-p-KP-21013,噬菌体CP-p-KP-21016,噬菌体CP-p-KP-21069和噬菌体CP-p-KP-21076组合形成组合物。

单株噬菌体CP-p-KP-21099,噬菌体CP-p-KP-21013,噬菌体CP-p-KP-21016,噬菌体CP-p-KP-21069和噬菌体CP-p-KP-21076分别能够裂解27株、22株、15株、4株和6株肺炎克雷伯菌；其中,噬菌体CP-p-KP-21099与其他4种噬菌体中一株或多株组合成的“鸡尾酒”组合为最多能裂解46株肺炎克雷伯菌,覆盖率可以达到49.5％(46/93)。与单株噬菌体相比,“鸡尾酒”噬菌体拓宽了所能裂解的宿主谱,覆盖率大幅提高。

表1

注:“+”代表细菌被噬菌体裂解,空格代表细菌不能被噬菌体裂解。

实施例4:肺炎克雷伯菌噬菌体的扩大培养

试验方法:取40mL LB液体培养基,同时加入0.4mL对数期宿主菌液,置于37℃摇床200rpm培养1-2h至对数期,随后加入0.05mL实施例2中纯化后的噬菌体悬液,继续置于37℃摇床200rpm培养至试管中液体变至澄清,离心过滤后备用。

双层平板法检测噬菌体效价:上述噬菌体悬液进行10倍梯度稀释,取各梯度的噬菌体稀释液0.1ml与宿主菌液0.3ml充分混匀,铺双层琼脂平板,37℃恒温培养5-10h,对每个琼脂平皿进行噬菌斑计数,选择出现30-300个左右噬菌斑的平皿,根据稀释的倍数计算得到的噬菌体初始浓度,即噬菌体效价(噬菌体的效价(pfu/ml)＝稀释倍数×噬菌斑个数×10)。

试验结果:图1是本发明的噬菌体纯化结果图,其中A为噬菌体CP-p-KP-21099、B为噬菌体CP-p-KP-21013、C为噬菌体CP-p-KP-21016、D为噬菌体CP-p-KP-21069、E为噬菌体CP-p-KP-21076。

如图1所示,CP-p-KP-21099和CP-p-KP-21076分离自复旦大学附属金山医院下水道,噬菌体CP-p-KP-21099在琼脂培养基中可以形成透亮空斑,周围有晕环,边缘清晰规则,直径约0.5mm-2mm；噬菌体CP-p-KP-21076在琼脂培养基中可以形成透亮空斑,周围无晕环,边缘清晰规则,直径约0.5mm-2mm；CP-p-KP-21013分离自上海市公共卫生临床中心外科大楼下水道污水,该噬菌体在琼脂培养基中可以形成透亮空斑,周围有晕环,边缘清晰规则,直径约1mm；噬菌体CP-p-KP-21016分离自上海市公共卫生临床中心外科大楼下水道污水,该噬菌体在琼脂培养基中可以形成针尖样透亮空斑,周围无晕环,边缘清晰规则；噬菌体CP-p-KP-21069分离自复旦大学附属金山医院下水道污水,该噬菌体在琼脂培养基中可以形成透亮空斑,周围有大晕环,边缘清晰规则,直径约0.5mm-2mm。此五株噬菌体均为裂解性噬菌体,且效价均达10^8PFU/mL,为典型的裂解性噬菌体。

实施例5:肺炎克雷伯菌噬菌体的透射电镜观察

试验方法:取实施例4中的噬菌体悬液做电镜观察,将实施例2中纯化后的噬菌体悬液10ul滴在铜片上,自然沉淀10min,用滤纸吸去多余的液体,滴一滴2％的磷钨酸(PTA,2％w/v)染色1-2min,室温干燥后使用透射电子显微镜观察。

试验结果:图2为本发明的噬菌体透射电镜结果图,其中A为噬菌体CP-p-KP-21099、B为噬菌体CP-p-KP-21013、C为噬菌体CP-p-KP-21016、D为噬菌体CP-p-KP-21069、E为噬菌体CP-p-KP-21076。结果如图2所示:

噬菌体CP-p-KP-21099有呈正二十面体的头部,头部直径约为55nm,有长的不可收缩的尾部,尾部长约170nm。根据国际病毒分类委员会(ICTV)2015年发表的《病毒分类一国际病毒分类委员会第八次报告》,噬菌体CP-p-KP-21099属于长尾病毒家族。

噬菌体CP-p-KP-21013有呈正二十面体的头部,头部直径约为55m,尾部约10nm,根据国际病毒分类委员会(ICTV)2015年发表的《病毒分类一国际病毒分类委员会第八次报告》,噬菌体CP-p-KP-21013属于短尾病毒家族(Podoviridae)。

噬菌体CP-p-KP-21016有呈正二十面体的头部,头部直径约为105nm,有长且可伸缩的尾部,尾部长约120nm。根据国际病毒分类委员会(ICTV)2015年发表的《病毒分类一国际病毒分类委员会第八次报告》,噬菌体CP-p-KP-21016属于肌尾病毒家族。

噬菌体CP-p-KP-21069有呈正二十面体的头部,头部直径约为55nm,有尾部。根据国际病毒分类委员会(ICTV)2015年发表的《病毒分类一国际病毒分类委员会第八次报告》,噬菌体CP-p-KP-21069属于短尾病毒家族。

噬菌体CP-p-KP-21076有呈正二十面体的头部,头部直径约为60nm,有尾部。根据国际病毒分类委员会(ICTV)2015年发表的《病毒分类一国际病毒分类委员会第八次报告》,噬菌体CP-p-KP-21076属于短尾病毒家族。

实施例6:肺炎克雷伯菌噬菌体的基因组提取、测序及特异性验证

具体试验步骤如下:

(1)分别取实施例4中噬菌体噬菌体CP-p-KP-21099、噬菌体CP-p-KP-21013、噬菌体CP-p-KP-21016、噬菌体CP-p-KP-21069和噬菌体CP-p-KP-21076 10mL,加入终浓度为1μg/mL的DNase I(10U/μg)和RNase A(10U/μg),充分混匀后37℃温育30min；

(2)加入终浓度为25mM的EDTA,65℃孵育10min(灭活DNA酶)；

(3)此步骤开始,使用M5λ噬菌体基因组DNA快速提取试剂盒提取核酸；

(4)经1％琼脂糖凝胶核酸电泳验证后,用NanoDrop-300测定其浓度和纯度,产物送至上海派森诺生物科技有限公司进行测序。

(5)肺炎克雷伯菌噬菌体CP-p-KP-21099、噬菌体CP-p-KP-21013、噬菌体CP-p-KP-21016、噬菌体CP-p-KP-21069和噬菌体CP-p-KP-21076的基因组序列通过网站分析,选取特异性核苷酸序列进行引物设计,由上海生工生物工程有限公司进行引物合成。

(6)构建PCR反应体系,表2为扩增肺炎克雷伯菌噬菌体CP-p-KP-21099、噬菌体CP-p-KP-21013、噬菌体CP-p-KP-21016、噬菌体CP-p-KP-21069和噬菌体CP-p-KP-21076特异性序列的PCR体系。如表2所示,对肺炎克雷伯菌噬菌体的特异性序列进行扩增。PCR反应程序为:94℃预变性10min,94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸90s(共32个循环),72℃终延伸10min。取5μL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶核酸电泳后观察结果。剩余PCR产物送上海生工生物工程有限公司进行测序。全基因组测序结果为肺炎克雷伯菌噬菌体CP-p-KP-21099的完整基因组大小为50010bp、CP-p-KP-21013的完整基因组大小为40678bp、CP-p-KP-21016的完整基因组大小为174929bp、CP-p-KP-21069的完整基因组大小为39474bp、CP-p-KP-21076的完整基因组大小为39846bp。

表2

使用表3中所示的引物对：P-KP099-F/P-KP099-R，以肺炎克雷伯菌噬菌体CP-p-KP-21099为模板进行PCR验证。结果如图3A所示，图3A为本发明的PCR扩增噬菌体CP-p-KP-21099特异性序列核酸电泳图，其中，图3A中右侧条带代表采用引物对：P-KP099-F/P-KP099-R扩增噬菌体特异性序列核酸条带，左侧条带M为Marker，该引物能够扩增出特异性目的条带，且条带大小与预期大小相符合，证明该引物能够特异性验证肺炎克雷伯菌噬菌体CP-p-KP-21099。按照上述操作分别采用不同的引物验证噬菌体CP-p-KP-21013、噬菌体CP-p-KP-21016、噬菌体CP-p-KP-21069和噬菌体CP-p-KP-21076特异性序列核酸电泳结果分别为图3B-3E所示，均可以得到与预期条带大小相符合的结果。其中，噬菌体CP-p-KP-21099的引物扩增的特异性核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；噬菌体CP-p-KP-21013的引物扩增的特异性核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；噬菌体CP-p-KP-21016的引物扩增的特异性核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；噬菌体CP-p-KP-21069的引物扩增的特异性核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；噬菌体CP-p-KP-21076的引物扩增的特异性核苷酸序列如SEQ IDNO.15所示。

表3

实施例7:肺炎克雷伯菌噬菌体最佳感染复数(MOI)的测定

感染复数(multiplicity of infection,MOI)即噬菌体与细菌个数之比。

试验方法:(1)取实施例一中备用的宿主菌培养物转接培养至对数期(OD

(2)按照感染复数分别为10

(3)取1ml裂解液于4℃、8000rpm离心10min,收集上清,0.22μm滤膜过滤；

(4)取100μL步骤(3)中的滤液连续10倍梯度稀释；

(5)取100μL稀释液与300-400μL细菌悬液混匀,静置5-10min后加入到冷却至55℃左右的0.5％半固体培养基中,混匀,铺双层平板,倒置于37℃恒温培养箱中过夜培养；

(6)观察平板并计算噬菌体滴度,实验重复三次,并绘制柱状图。

试验结果:结果如图4所示,图4为本发明的肺炎克雷伯菌噬菌体的最佳感染复数,肺炎克雷伯菌噬菌体CP-p-KP-21099,噬菌体CP-p-KP-21013,噬菌体CP-p-KP-21016,噬菌体CP-p-KP-21069和噬菌体CP-p-KP-21076的最佳感染复数分别为10

实施例8:肺炎克雷伯菌噬菌体的一步生长曲线测定

试验方法:一步生长曲线能够体现出噬菌体复制特性,包括潜伏期、爆发期,具体方法如下:

(1)取实施例一中备用的宿主菌培养物,按照1:100的比例转接至新鲜培养基培养,同时加入终浓度为5mmol/L的CaCl

(2)取1mL培养至对数生长期的宿主菌,按照MOI＝0.1的比例加入实施例四中备用的噬菌体培养液,混匀后于37℃温箱中静置孵育5min(使细菌与噬菌体吸附)；

(3)4℃、10000rpm离心1min,弃掉上清(未吸附的噬菌体)；

(4)取1mL新鲜LB液体重悬沉淀(相互吸附的细菌及噬菌体颗粒)；

(5)重复步骤(3)、(4),重悬洗涤至少两次；

(6)最后用10ml新鲜LB培养基重悬沉淀,将重悬试管在37℃摇床中200rpm震荡培养90min,前30min每隔5min(0、5、10、15、20、25、30min)取样一次,之后每隔10min(40、50、60、70、80、90min)取样一次,每次取出600μL培养混合物；

(7)4℃、10000rpm离心1min,收集上清,0.22μm滤膜过滤；

(8)取100μL步骤(6)中的噬菌体滤液连续10倍梯度稀释；

(9)取100μL稀释液与300μL-400μL细菌悬液混匀,静置5-10min后加入到冷却至55℃左右的0.5％半固体培养基中,混匀,铺双层平板,倒置于37℃恒温培养箱中过夜培养；

(10)观察平板并计算噬菌体滴度,实验重复三次,并绘制一步生长曲线。

试验结果:结果如图5所示,图5为本发明噬菌体的一步生长曲线图,噬菌体CP-p-KP-21099,噬菌体CP-p-KP-21013,噬菌体CP-p-KP-21016,噬菌体CP-p-KP-21069和噬菌体CP-p-KP-21076的感染宿主菌潜伏期分别为5min、5min、0min、5min、10min；五株噬菌体的一个裂解周期分别为20min,40min,20min,10min和20min；其中，一个裂解周期包括潜伏期、爆发期和平台期；上述结果说明该五株噬菌体能够在短时间内大量扩增,具有高效的裂解活性。

上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。