一株内生耐冷草假单胞菌菌株EH7及其应用

技术领域

本发明涉及微生物和生物防治技术领域，特别涉及一株内生耐冷草假单胞菌菌株EH7及其在促进烟草生长和青枯病防治中的应用。

背景技术

青枯病是一种由青枯雷尔氏菌引起的土传细菌性病害，具有易感染、传播快、危害极大的特点，能够影响多种作物的正常生长。该病在我国各大烟区都有发生，是烟叶生产中常见的病害之一。烟草长期连作造成病原菌积累、土壤微生物群落不平衡导致烟草感染青枯病有逐年加重的趋势。近年来，烟草青枯病的发生越来越严重，发病的范围也越来越广，主要集中在以湖北、贵州、云南、福建、重庆、四川为代表的南方烟区，给烟叶生产造成毁灭性的打击。

烟草病害的防治长期依赖于化学防治，农药的大量滥用和不科学的使用造成烟田生态系统农残累积，导致病原菌抗药性迅猛上升，加大了防控难度，降低了烟叶品质，严重影响烟草的生产安全。利用微生物及其代谢产物进行病害防治，筛选对人体以及生态环境无害的生防菌剂，逐渐替代化学药剂成为世界范围内植物病害防治的主要发展方向。目前，已发现芽胞杆菌、荧光假单胞菌、链霉菌等对青枯雷尔氏菌有拮抗作用。现有技术中，文献《生防菌在烤烟青枯病和黑怪病防治中的应用》(郭维等、2013)公开了将生防菌原液分别在移栽时和移栽后25天稀释800倍后灌根，能有效降低青枯病的发病率和病情指数。《XQ生防菌防治烟草青枯病研究》(罗俊、2016)公开了喷施XQ生防菌的烟株青枯病发病率明显降低，长势较好，烤后烟叶外观质量好，经济效益显著提高。《两株荧光假单胞杆菌菌株对烟草黑胫病病原菌的抑制作用》(顾金刚等、2004)公开了从土壤中分离得到的两株荧光假单胞杆菌可产生抗生素类物质，能够抑制烟草疫霉的菌丝生长、游动孢子囊的产生和游动孢子的萌发。《Biocontrol potential of antagonist Bacillus subtilis Tpb55 againsttobacco black shank》(Han et al 2016)公开了枯草芽胞杆菌Tpb55可以有效定殖烟草根系，盆栽和大田试验测定其对烟草黑胫病的防效分别为70.66％和59.34％。

因此，研究植烟土壤微生物区系的特征及在病害发生过程中的演变规律，找出维持烟叶高产和土壤健康的关键微生物类群，通过各种人为措施有目的地培育和调控健康稳定的土壤微生物区系，用以控制烟草土传病害，是当前急需研究解决的难题。尤其是根内生菌以其独特的内生性在生物防治中越来越受重视，且广泛存在于植物体内，在生物防治中有着至关重要的意义。虽然国内外关于烟草青枯病的生物防治已有很多研究，但具有促进烟草生长作用且对青枯雷尔氏菌有明显防治效果的耐冷草假单胞菌尚未有报道。

发明内容

针对以上现有技术的不足，本发明提供了一株在烟草青枯病的植烟区分离得到的一株生防菌EH7，经过16Sr DNA基因扩增产物纯化后测序分析，并构建系统发育树鉴定，该菌株为耐冷草假单胞菌Pseudomonas poae，对青枯雷尔氏菌有明显的防治效果，同时具有促进烟草生长的作用，为烟草种植中的病害防治和养护提供了新的微生物资源。

为了实现上述目的，具体通过以下技术实现：

本发明提供了一株内生耐冷草假单胞菌(Pseudomonas poae)菌株EH7，该菌株已于2023年02月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武昌区珞南一路武汉大学)，其保藏编号为CCTCC NO：M 2023107。

上述耐冷草假单胞菌菌株EH7在LB固体培养基中生长良好，菌株呈圆形、为乳白色、边缘半透明、中间微微隆起，结晶紫染色均匀、细胞形态清晰。

本发明还提供了上述耐冷草假单胞菌(Pseudomonas poae)菌株EH7的培养方法，包括将耐冷草假单胞菌(Pseudomonas poae)菌株EH7置于培养基中培养，所述培养基的配方包括碳源、氮源、无机盐。

进一步地，所述碳源为酵母粉、糊精、甘露醇、蔗糖中的一种或多种；所述氮源为胰蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、NaNO

优选地，上述培养基的配方为：1％甘露醇、0.5％酵母粉、1％KCl。

进一步地，上述耐冷草假单胞菌菌株EH7的培养温度为23℃，接种菌种种龄为24h，接种量为1％，装液量为50mL。

本发明还提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂包括所述耐冷草假单胞菌(Pseudomonas poae)菌株EH7或所述耐冷草假单胞菌(Pseudomonas poae)菌株EH7的培养物。该微生物菌剂具有促进烟草生长和防治烟草青枯病的作用。

本发明针对目前青枯雷尔氏菌易对化学农药易产生抗药性的问题，通过对烟草青枯病拮抗菌分离筛选及其防效实验，分离筛选出对烟草青枯病有拮抗作用的菌株，在此基础上进一步进行田间试验，以开发出一种对生态环境无害且能促进烟草生长的微生物菌剂。

优选地，微生物菌剂的培养方法包括固体发酵和液体发酵，微生物菌剂的剂型可以为可湿性粉剂、分水散粒剂、水悬浮剂，本发明对上述微生物菌剂的剂型没有特殊限制，目前通常采用的几种微生物菌剂的剂型都可以使其发挥作用。

本发明还提供了上述耐冷草假单胞菌(Pseudomonas poae)菌株EH7在促进烟草生长，或防治烟草青枯病中的应用。在促进烟草生长的应用原理为耐冷草假单胞菌(Pseudomonas poae)菌株EH7能够分泌吲哚乙酸。而吲哚乙酸是促进植物生长的天然无害的内源生长素，对植物有促进坐果、促进插条生根、促进种子萌发、促进果实成熟及形成无籽果实等作用。

上述的应用方法包括：先采用液体发酵法或固体发酵法制备所述微生物菌剂；然后将所述微生物菌剂与水按比例混合均匀，以200mL/株的量喷施在烟苗上。

进一步地，上述液体发酵法包括：取耐冷草假单胞菌(Pseudomonas poae)菌株EH7划线于LB平板，培养过夜后挑取单菌落，接种于液体培养基中继续过夜培养，以1％的接种量接种于LB液体培养基中，继续培养若干天，得到所述微生物菌剂；上述固体发酵法包括：取耐冷草假单胞菌(Pseudomonas poae)菌株EH7划线于LB平板，培养过夜，然后挑取单菌落接种于液体培养基中继续过夜培养，再按1.5-2ml/100g的用量将菌液接种于300g固体发酵培养基中，混匀，继续培养若干天，得到所述微生物菌剂。

与现有技术相比，本发明的有益之处在于：

1、本发明首次从盐田中筛选出一株耐冷草假单胞菌(Pseudomonas poae)菌株EH7，该菌株能够分泌内源生长素吲哚乙酸，具有促进烟草生长的作用，且对植物和生态环境无害。

2、该菌株还有防治青枯病的作用，对青枯雷尔氏菌的活性有明显的抑制作用，防治效果高达70％，是良好的生防微生物菌剂。

附图说明

图1为实验例1中抗青枯生防菌株的筛选结果图；

图2为实验例1中菌株EH7的系统发育树结果图；

图3为实验例1中菌株EH7的单菌落结果图：

图4为实验例1中菌株EH7的结晶紫染色结果图；

图5为实验例2中菌株EH7分泌吲哚乙酸活性的检测结果图；

图6为实验例3中处理组和对照组的株高结果图；

图7为实验例3中处理组和对照组的茎围结果图；

图8为实验例3中处理组和对照组的叶片数结果图；

图9为实验例3中处理组和对照组的病情指数结果图；

图10-12分别为实验例4中碳源、氮源、无机盐优化的OD

图13-16分别为实验例4中接种量、装液量、温度、种龄优化的OD

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，如未特别说明，均为常规技术，所用试剂如未特别说明，均来源于商业化渠道。所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实验例1烟草根内生防细菌的筛选鉴定及形态学观察

1、烟草根内生菌的分离

从湖北恩施烟田中挑选健康烟株和感染了青枯病的烟株，分离根内生细菌。分别称取1.0g的根进行表面消毒：采用1％次氯酸钠浸泡5min，无菌水冲洗三次，75％乙醇浸泡2min，无菌水冲洗三次，然后加入9mL无菌水研磨充分。研磨后将其涂布于TSB固体平板，于37℃培养24-48h，挑取菌落形态不同的细菌分离纯化，将纯化的菌株置于-20℃的甘油管保存。

2、抗青枯生防菌株的筛选

将青枯雷尔氏菌(来源于华中农业大学赵秀云老师在实验前期从烟草根际土壤中分离得到)接种于LB液体培养基中，于28℃、180r/min过夜培养活化以后，以1％的比例冷却至约40-55℃的LB固体培养基中混匀，倒平板后静置15min。随后将上述步骤1中分离纯化的菌株转移至液体LB培养基中，于37℃，180rpm过夜活化后，得到菌培养液。再采用滤纸片法，每个滤纸片上加入5μL菌培养液，每个菌设置三个重复，于28℃培养2-3d，观察抑菌圈大小，并测量记录，抑菌圈最大的即为对青枯雷尔氏菌拮抗能力最高的菌株，如图1所示，选取出一株抑菌圈最大的菌株EH7。

3、菌株16Sr DNA基因序列分析鉴定

将上述步骤2中得到的菌株EH7经过16Sr DNA基因扩增产物纯化后测序，通过NCBI数据库进行BLAST比对，采用MEGA5.2软件构建拮抗菌的系统发育树，系统发育树如图2所示，经分析鉴定菌株EH7为Pseudomonas poae。

4、菌株EH7形态学观察

将上述步骤2中得到的菌株EH7的单菌落以1％的接种量接种于5mL液体培养基中，于28℃、180r/min过夜培养活化，采用10倍梯度稀释法，涂布于LB固体培养基上，于28℃培养2d，待长出单菌落后对其进行菌落形态观察。单菌落结果图如图3所示，可以看见菌株呈圆形，为乳白色，边缘半透明，中间微微隆起。此外，将活化后的各个菌株以1％的接菌量转接到5mL液体培养基中，并于28℃、180r/min培养24h，用结晶紫(市场购买)进行简单染色后，利用光学显微镜对其单细胞形态进行观察。结晶紫染色结果图如图4所示，可以看出染色均匀，细胞形态清晰。

实验例2菌株EH7分泌IAA活性的检测

挑取新鲜划线待测菌种的单菌落，接种于5mL LB液体培养基中，于37℃、180r/min过夜培养活化，以1％的比例转接到新鲜5mL LB液体培养基中，于37℃、180r/min培养至OD

实验例3菌株EH7田间实验

1、微生物菌剂培养

微生物菌剂培养包括液体发酵和固体发酵，具体发酵步骤和喷施方法如下：

(1)液体发酵：取所需拮抗菌株划线于LB平板，于37℃培养过夜后，挑取单菌落，接种于LB液体培养基中，于37℃、180r/min、过夜培养。以1％的接种量接种于LB液体培养基中，并于37℃、180r/min、培养36h，得到液体微生物菌剂。

将发酵菌剂与水按1:1比例混匀，得到菌剂，向每株待检测烟苗施用200mL的菌剂，每个处理(100株烟苗)所需菌剂为20L。

(2)固体发酵。取所需拮抗菌株划线于LB平板，于37℃培养过夜后，挑取单菌落，接种于5mL LB液体培养基中，于37℃、180r/min、过夜培养。将5mL菌液接种于300g固体发酵培养基中，并充分摇晃混匀，并于37℃培养7-9天，得到固体微生物菌剂。在此期间，需要在培养箱中放置水，保持培养环境中的湿度。

每个处理(100株烟苗)所需固体微生物菌剂为500g，将其溶于20L水中后施用于田间实验。

2、施用菌剂后田间实验性状调查

对照组CK：清水；处理组：EH7发酵菌剂。依据中华人民共和国烟草行业标准烟草病害分级及调查方法，对每个处理的所有烟苗进行病情等级调查，计算病情指数。生长指标调查包括株高(结果如图6)、茎围(结果如图7)、叶片数(结果如图8)，向上述步骤1中的每个处理中随机调查15株烟苗，设置三个重复。从图6-8可以看出用EH7发酵菌剂处理后的烟草的株高、茎围、叶片数的数值都比对照组的大，说明处理组的烟草植株生长状况比对照组的好。烟草青枯病的发病率、病情指数和防治效果按下式计算：

病情指数＝Σ[(病情级数×此级株数)/(最高级数×总株数)]×100；

病情指数的计算结果如图9，从图9可以看出，对照组的病情指数为处理组的病情指数的两倍多，说明该EH7菌株用于防治青枯病的效果可达到70％，由此可见，EH7发酵菌剂对青枯雷尔氏菌的活性有明显的抑制作用。

实验例4菌株EH7发酵工艺优化

基础培养基为：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g。在基础培养基的基础上根据菌株的不同进行优化，得到优化后的碳源、氮源和无机盐，并在此基础上做正交试验，优化培养基配方，再确定其种龄、温度、接种量及装液量对其生物量的影响。

碳源优化：将培养基中的酵母粉等量替换为糊精、甘露醇、蔗糖，并测量各自在600nm波长处的吸光值，测定结果如图10所示。氮源的优化：将培养基中的胰蛋白胨等量替换为牛肉膏、酵母粉、NaNO

表1正交试验结果表

(表1中，K1为在每个因素下对应水平为1的实验结果的和；K2为在每个因素下对应水平为2的实验结果的和；K3为在每个因素下对应水平为3的实验结果的和；k1、k2、k3分别为K1、K2、K3的均值；R为极差，即每个因素下k的最大值减最小值。)

接种量的优化：将接种量设置为1％、3％、5％，并测量各自在600nm波长处的吸光值确定其最适接种量，测定结果如图13所示。装液量的优化：将装液量设置为50mL、100mL、150mL，并测量各自在600nm波长处的吸光值确定其最适装液量，测定结果如图14所示。温度的优化：将温度设置为23℃、30℃、37℃，并测量各自在600nm波长处的吸光值确定其最适发酵温度，测定结果如图15所示。种龄的优化：将种龄设置为12h、24h、36h，并测量各自在600nm波长处的吸光值确定其最适发酵种龄，测定结果如图16所示。从图10-12可以得出，优化后的培养基的配方为：1％甘露醇、0.5％酵母粉、1％KCl；从图13-15可以得出，菌株EH7的最适培养温度为23℃、接种菌种种龄为24h、接种量为1％、装液量为50mL。

以上具体实施方式详细描述了本发明的实施，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节。在本发明的权利要求书和技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单改型和改变，这些简单变型均属于本发明的保护范围。