广谱抗微生物的三明治结构的静电纺丝纳米纤维支架及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种广谱抗微生物的静电纺丝纳米纤维支架制备技术,属于抗微生物材料技术领域。

背景技术

由于现有伤口抗菌敷料的杀菌作用对象有限，往往只对某种细菌有杀灭作用；杀菌持续时间短，大量使用后易产生耐药菌株，反而会威胁人类健康。一些银基抗菌材料因含银量较高，对生物体危害大，不能直接作用于动物或人。此外，大多数敷料的功能较为单一，不能满足伤口愈合所需的复杂条件，因此，亟待研制集抗菌、抗炎、止血和促愈合与一体的多功能敷料，用于感染性伤口的治疗。

发明内容

技术问题：本发明的目的在于：克服现有技术存在的问题，提出一种广谱抗微生物的包封抗生素和蛋白质稳定的纳米银的三明治结构的静电纺丝纳米纤维支架的制备方法，合成过程绿色、简单、快捷，所得材料对多种细菌及耐药菌具有杀灭作用，实现广谱、高效、持续杀菌。同时，通过小鼠伤口感染性实验，证实了该纳米纤维支架对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的伤口的具有优异的治疗效果，提示该材料作为抗菌敷料具有广阔的应用前景。

技术方案：一种广谱抗微生物的三明治结构的静电纺丝纳米纤维支架，所述支架是通过静电纺丝法制备的三明治结构，三层由内到外依次为聚己内酯/牛血清白蛋白/姜黄素/抗生素纤维膜层、聚己内酯/牛血清白蛋白包封的氧化银纳米颗粒作为夹心层，最外层为聚己内酯纳米纤维膜层。

所述的抗生素为硫酸庆大霉素。

所述的广谱抗微生物的三明治结构的静电纺丝纳米纤维支架的制备方法，包括以下步骤：

第一步、制备牛血清白蛋白包封的氧化银纳米颗粒：以牛血清白蛋白为还原剂和稳定剂，将可溶性银盐水溶液加入牛血清白蛋白的水溶液，充分混合后在搅拌下加入碱调节pH；反应后，离心并收集固形物；将固形物洗涤、干燥后，得牛血清白蛋白包封的氧化银纳米颗粒；

第二步、制备聚己内酯/牛血清白蛋白/姜黄素/硫酸庆大霉素纤维膜(PBCG)：将聚己内酯(PCL)溶解于甲酸/乙酸，加入牛血清白蛋白、姜黄素和抗生素，搅拌均匀后超声脱气，装载于针筒中通过静电纺丝技术得到聚己内酯/牛血清白蛋白/姜黄素/抗生素纤维膜；

第三步、制备聚己内酯/牛血清白蛋白包封的氧化银纳米颗粒纳米纤维膜(PBA)：将聚己内酯溶解于甲酸/乙酸，加入牛血清白蛋白包封的氧化银纳米颗粒，搅拌均匀后超声脱气，在PBCG表面纺丝，得到第二层纳米纤维：聚己内酯/牛血清白蛋白包封的氧化银纳米颗粒纳米纤维膜；

第四步、制备广谱抗微生物的三明治结构的静电纺丝纳米纤维支架(SNM)：将聚己内酯溶解于甲酸/乙酸，搅拌均匀后超声脱气，在PBA表面纺丝，得到第三层纳米纤维：聚己内酯纳米纤维膜(PCL)；最终得到三层分别为PBCG(内层)，PBA(中间层)和PCL(外层)的三明治结构的静电纺丝纳米纤维支架。

所述的可溶性银盐为硝酸银，所述的硝酸银与去离子水的质量体积比为0.005±0.0001g：4±0.1mL。

所述牛血清白蛋白与去离子水的体积比为0.005±0.0001g：1±0.1mL；加入牛血清白蛋白时逐滴加入。

第一步的反应条件为：反应温度25℃±5℃，反应时间至少5小时，反应过程中持续搅拌；离心条件为：离心转速10000±100rpm，离心时间至少5分钟；洗涤条件为：采用去离子水洗涤至少3次；干燥温度为40±5℃。

第二步中，所述聚己内酯与甲酸、乙酸的质量体积比为1.0±0.001g：2.5±0.1mL：2.5±0.1mL；所述聚己内酯、姜黄素和硫酸庆大霉素的质量比为1.0±0.001g：0.02±0.001g：0.01±0.001g。

第三步中，所述聚己内酯与甲酸、乙酸的质量体积比为1.0±0.001g：2.5±0.1mL:2.5±0.1mL；聚己内酯与牛血清白蛋白包封的氧化银纳米颗粒的质量比为1.0±0.001g：0.025±0.001g。

第四步中，所述聚己内酯与甲酸、乙酸的质量体积比为1.0±0.001g：2.5±0.1mL:2.5±0.1mL。

有益效果：本发明制备方法绿色、简单、快捷，而且所使用的聚己内酯生物降解性好，对环境友好。所得材料对多种细菌及耐药菌具有杀灭作用，实现广谱、高效、持续杀菌。同时，通过小鼠伤口感染性实验，证实了该纳米纤维支架对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的伤口的具有优异的治疗效果，且能够有效杀灭耐药菌，同时具有良好的生物相容性。该材料作为抗菌敷料具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例3的BSA-Ag

图2为本发明实施例4的PCL,PBA，PBCG和SNM的扫描电镜(SEM)图、吸水重量变化曲线和止血性能柱状图。

图3为实施例5中BSA-Ag

图4为本发明实施例5中SNM对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生长效果评价。

图5为本发明实施例6中BSA-Ag

图6为本发明实施例6中SNM对人成纤维细胞的毒性评价。

图7为本发明实施例8的SNM对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的伤口治疗效果评价。

具体实施方式

根据权利要求所包含的内容举例说明

一种广谱抗微生物的包封抗生素和蛋白质稳定的纳米银的三明治结构的静电纺丝纳米纤维支架的制备方法，包括以下步骤：

第一步、以牛血清白蛋白为还原剂和稳定剂，将AgNO

第二步、将PCL溶解于甲酸/乙酸，加入牛血清白蛋白、姜黄素和硫酸庆大霉素，搅拌均匀后超声脱气，装载于针筒中通过静电纺丝技术得到聚己内酯/牛血清白蛋白/姜黄素/硫酸庆大霉素纤维膜(PBCG)；

第三步、将PCL溶解于甲酸/乙酸，加入牛血清白蛋白包封的氧化银纳米颗粒，搅拌均匀后超声脱气，装载于针筒中，在PBCG表面纺丝，得到第二层纳米纤维：聚己内酯/氧化银纳米颗粒纳米纤维膜(PBA)；

第四步、将PCL溶解于甲酸/乙酸，搅拌均匀后超声脱气，装载于针筒中，在PBA表面纺丝，得到第三层纳米纤维：PCL纳米纤维膜；最终得到三层分别为PBCG(内层)，PBA(中间层)和PCL(外层)的三明治结构的静电纺丝纳米纤维支架(SNM)。

该方法的合成过程绿色、简单、快捷，而且所使用的聚己内酯生物降解性好，对环境友好。该方法制得的复合纳米纤维支架对多种细菌具有杀灭作用，能达到广谱、高效、持续杀菌的效果，且能够有效杀灭耐药菌，同时具有良好的生物相容性。

本发明进一步完善的技术方案如下：

优选地，第一步中，所述的硝酸银与去离子水的质量体积比为0.005±0.0001g：4±0.1mL；所述牛血清白蛋白与去离子水的体积比为0.005±0.0001g：1±0.1mL；加入牛血清白蛋白时逐滴加入；第一步的反应条件为：反应温度25℃±5℃，反应时间至少5小时，反应过程中持续搅拌；离心条件为：离心转速10000±100rpm，离心时间至少5分钟；洗涤条件为：采用去离子水洗涤至少3次；干燥温度为40±5℃。

采用该优选方案，可进一步优化第一步中的各物料比例、各具体条件。

优选地，第二步中，所述聚己内酯与甲酸、乙酸的质量体积比为1.0±0.001g：2.5±0.1mL：2.5±0.1mL；所述聚己内酯、姜黄素和硫酸庆大霉素的质量比为1.0±0.001g：0.02±0.001g：0.01±0.001g。

采用该优选方案，可进一步优化第二步中的各物料比例。

优选地，第三步中，所述聚己内酯与甲酸、乙酸的质量体积比为1.0±0.001g：2.5±0.1mL:2.5±0.1mL；聚己内酯与牛血清白蛋白包封的氧化银纳米颗粒的质量比为1.0±0.001g：0.025±0.001g。

采用该优选方案，可进一步优化第三步中的各具体条件。

优选地，第四步中，所述聚己内酯与甲酸、乙酸的质量体积比为1.0±0.001g：2.5±0.1mL:2.5±0.1mL。

采用该优选方案，可进一步优化第三步中的各具体条件。

实施例1：

本实施例为制备牛血清白蛋白包封的氧化银纳米颗粒。

本实施例的基本制备过程包括：

S1.将AgNO

S2.将反应液离心并收集固形物；将固形物洗涤、干燥后，得牛血清白蛋白包封的氧化银纳米颗粒。

以下是作为示例的具体制备过程：

将5mgAgNO

实施例2：

本实施例为制备三明治结构的纳米纤维支架。

本实施例的基本制备过程包括

S1.将PCL溶解于甲酸/乙酸，加入牛血清白蛋白、姜黄素和硫酸庆大霉素，搅拌均匀后超声脱气，装载于针筒中通过静电纺丝技术得到PBCG纳米纤维膜。

S2.将PCL溶解于甲酸/乙酸，加入牛血清白蛋白包封的氧化银纳米颗粒，搅拌均匀后超声脱气，装载于针筒中，在PBCG表面纺丝，得到第二层纳米纤维：PBA纳米纤维膜

S3.将PCL溶解于甲酸/乙酸，搅拌均匀后超声脱气，装载于针筒中，在PCL/BSA-Ag表面纺丝，得到第三层纳米纤维：PCL；最终得到三层分别为PCL/BSA/CCM/Gen，PCL/BSA-Ag和PCL的三明治结构的静电纺丝纳米纤维支架。

以下是未做示例的具体制备过程：

预先分别配制好原液(A、B、C)进行静电纺丝。将PCL前体先溶于20wt％浓度的甲酸/乙酸(1:1,V/V)中，室温搅拌2小时，然后加入BSA(3％的PCL)、CCM(1％的PCL)和硫酸庆大霉素(2％的PCL)，再搅拌1小时(A溶液)，待PCL(20wt％)完全溶解于甲酸/乙酸(1:1，V/V)，搅拌至均匀分散(溶液B)，将纯PCL溶于浓度为20wt％的甲酸/乙酸(1:1,v/v)中搅拌3h(溶液C)，以PBCG为内层，PBA为中间层，PCL为外层构建三明治结构的纳米纤维膜。所有溶液在静电纺丝前用超声处理30分钟去除气泡。将溶液A、B和C分别装入21号金属针的注射器中，然后依次进行静电纺丝。铝箔覆盖的收集器以5rpm的速度旋转，与针的距离为15cm。溶液A、溶液B、溶液C连接针的自旋电压分别为16.0kV、20.0kV、12.0kV，流速均为0.72mL/h。静电纺丝工艺在25℃、相对湿度40％的条件下进行。获得的样品在40℃下真空干燥过夜，记作SNM，并储存在干燥器中。

实施例3：

对实施例1制得的BSA-Ag

以下为实施例1制得的BSA-Ag

图1A为BSA-Ag

实施例4：

对实施例2制得的SNM进行特性鉴定，其结果包括扫描电镜(SEM)图、吸水重量变化曲线和止血性能柱状图。鉴定时采用的对照组选自PCL,PBCG,PBA,SSD商用敷料。

以下为实施例2制得的SNM的各项特性鉴定结果(且各对照组：PCL,PBCG,PBA由实例2制得，SSD商用敷料为自行购买)：

图2A-C为PCL,PBA和PBCG的扫描电镜(SEM)图，从图中可以看出，三种样品均为无序缠绕的纤维，且分布随机。图2D为SNM横断面的扫描电镜(SEM)图，三层SNM划分良好且紧密结合。图2E为用不同样品密封的分子筛在恒温恒湿箱中的质量变化曲线，未密封的分子筛吸收的水蒸气最多，增重最多。商用SSD敷料组增重幅度小于空白对照组，但由于其孔径较大，高于电放纤维膜密封组，表明PCL,PBA，PBCG和SNM允许气体交换。利用凝血实验对样品的止血性能进行评估，图2F是不同材料处理后小鼠全血样品上清液的OD

实施例5：

本实施例采用实施例1制得的BSA-Ag

以下为采用实施例1示例制得的BSA-Ag

将BSA-Ag

将大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)菌液均匀接种在固体培养基表面，将PBA、PBCG、SNM和SSD圆片分别贴在接种了细菌的平板中央，在37℃下共培养24小时后观察抑菌环，实验结果如图4所示。该结果表明，PBCG对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有良好的杀灭性能，但在接种了MRSA的平板上未观察到抑菌环，表明PBCG对MRSA的杀伤作用不大。SSD敷料处理组仅能在SSD周围看到一个小的抑菌环，PBA和SNM处理组均有明显的抑菌环，且SNM的抗菌抑制区更大，SNM显示出比PBA和SSD更优异的抗菌活性。

实施例6：

对实施例1制得的BSA-Ag

以下为采用实施例1示例制得的BSA-Ag

将BSA-Ag

将PCL、PBA、PBCG、SNM和SSD分别浸泡在细胞培养基中48小时，取浸出液分别与人皮肤成纤维细胞(HSF)在37℃下共孵育，24小时后采用CCK-8试剂盒检测细胞活力，实验结果如图6所示，该结果表明，PCL和PBCG具有良好的细胞相容性，PBA和SNM在高浓度下具有一定的细胞毒性，但比同等浓度SSD毒性低，生物相容性优于SSD敷料。

实施例7：

对实施例2制得的SNM对感染性伤口的治疗效果进行评估。

以下为采用实施例2示例制得的SNM的小鼠伤口治疗实验具体结果：

在小鼠背部做全皮层切除，接种MRSA进行感染，覆盖SNM进行伤口治疗，观察伤口的愈合情况，并取创面浸洗液进行细菌培养，治疗15天后取安乐死的小鼠背部伤口组织进行免疫染色。结果如图7所示，该结果显示，SNM相较于空白对照组，明显加速了伤口的愈合，对伤口处的的MRSA具有显著的杀伤作用。治疗15天后SNM处理组的胶原纤维密度更大，排列更有序。SNM处理组创面部分CD31表达高于对照组，表明SNM促进了新血管的形成，加速了伤口愈合过程；而CD45+细胞水平明显降低，表明SNM在感染伤口中的抗炎作用。