一种低流失混合分离模式液相色谱填料及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于高效液相色谱填充材料技术领域，具体涉及一种低流失混合分离模式液相色谱填料及其制备方法和应用。

背景技术

随着科技水平不断的进步，生物医药、材料科学、环境科学等的快速发展，越来越多复杂样品需要提供更全面、更准确的结构与成分表征信息。这些复杂样品不仅仅是复杂的天然产物、环境样品等，也包括目标化合物本身存在较难分离的样品体系(如结构组成相似或存在异构现象的农兽药、药物及代谢产物)。这不仅需要更简便且有效的前处理手段来完成提取和纯化，同时更重要的是对现有的分析检测手段提出了极大的挑战。

对于某些复杂的样品用单一固定相的色谱柱，一种色谱分离模式，无论如何优化色谱参数也无法使其中某些组分得到很好的分离，这是就需要利用混合分离模式解决单一固定相不易分离的难题。目前混合固定相有以下几种实现方式：(a)将两根固定相组成相似或相异的色谱柱以物理方式连接；(b)将两种固定相填料按特定比例混合装柱；(c)通过化学键和的办法在硅胶基质上连接带有可离子化官能团的烷基链。将两个相似或者相异的色谱柱串联、采用两根相异的色谱柱串联、两根色谱柱能适应的流动相具有较大区别、能同时满足两根串联色谱流动相范围大大缩减；采用两根相似的色谱柱串联，整个分离系统的压力较高，通常增大色谱填料颗粒，降低柱压实现，但是会伴随柱效降低、分离纯化能力降低，且该工艺需针对样品作相应的方法开发，普适性差。将两种固定相混合装柱，两种固定相是微观分离，色谱柱装填的稳定性和一致性存在较大问题。通过化学键键合带有官能团的烷基链，带有官能团烷基种类单一，价格昂贵，且均以单键修饰在硅胶避免、耐酸性能差，易流失。

发明内容

针对目前混合分析模式存在的问题，本发明提供了一种低流失混合分离模式液相色谱填料及其制备方法和应用，本发明的色谱填料具有多种色谱分离模式，可以满足一些复杂样品的分离纯化；本发明的色谱填料混合模式含有范德华力、π-π作用力、面间作用力，混合键合相含有：长链烷基、全氟苯基烷基，应用时，根据实际分离需求调整混合模式中范德华、π-π、面间作用力的作用力，实现复杂化合物的分离。

本发明采取的具体技术方案是：

本发明第一方面是提供了一种低流失混合分离模式液相色谱填料，所述填料为硅球表面键合长链烷烃、全氟苯基烷基和短链烷基；

所述填料的结构式如下：

其中，R1长链烷烃、R2为全氟苯基烷基、R3短链烷基。

进一步地，所述R1与R2摩尔比为1：0.05-20。

进一步地，所述R1选自辛基、十八烷基、6-苯基丙基、6-苯基己基、12-苯基十二烷基中的一种；所述R2选自五氟苯基烷基、丙基五氟苯基烷基，己基五氟苯基氟烷基、十二烷基五氟苯基烷基中的一种。

本发明第二方面是提供了上述低流失混合分离模式液相色谱填料的制备方法，具体步骤如下：

(1)硅胶粒子硅羟基活化：用硅羟基活化酸对符合液相色谱条件的硅胶粒子进行活化处理，冷却至室温，依次用离子水、无水乙醇洗涤，在15kPa以下真空、温度50-80℃的条件上，干燥12小时以上后得到一步键合的硅胶粒子；

(2)三键全氟苯基烷基修饰：将一步键合的硅胶粒子分散在无水甲苯中，在有机胺的存在和氮气保护下与全氟苯基烷基三氯硅烷回流反应，反应完成后，冷却至室温，依次用色谱纯甲醇、去离子水、四氢呋喃洗涤后，15kPa以下真空及温度50-80℃的条件上，干燥12小时以上后得到三键全氟苯基烷基修饰后的硅胶粒子。

(3)三键烷基修饰：将三键全氟苯基烷基修饰后的硅胶粒子分散在无水甲苯中，在有机胺的存在和氮气保护下与长链烷基三氯硅烷回流反应，反应完成后，冷却至室温，依次色谱纯甲醇、去离子水、四氢呋喃洗涤后，在15kPa以下真空、温度50-80℃，干燥12小时以上后得到全氟苯基烷基和长链烷基混合键合的硅胶粒子；

(4)将混合键合硅胶粒子分散在无水甲苯中，在有机胺的存在和氮气保护下与短链氯硅烷回流反应，反应完成后，冷却至室温，依次用色谱纯甲醇、去离子水、四氢呋喃洗涤后，15kPa以下真空，温度50-80℃，干燥12小时以上后得到混合分离模式硅胶粒子，即低流失混合分离模式液相色谱填料。

进一步地，所述长链烷基三氯硅烷选自辛基三氯硅烷、十八烷基三氯硅烷、6-苯基丙基三氯硅烷、6-苯基己基三氯硅烷、12-苯基十二烷基三氯硅烷中的一种；所述全氟苯基烷基三氯硅烷选自五氟苯基烷基三氯硅烷、丙基五氟苯基烷基三氯硅烷，己基五氟苯基氟烷基三氯硅烷、十二烷基五氟苯基烷基三氯硅烷中的一种。

进一步地，所述步骤(1)硅羟基活化酸为盐酸、氢氟酸、硫酸、硝酸中的一种或多种混合；

进一步地，所述步骤(2)(3)(4)有机胺为三乙胺、乙二胺、二异丁胺、咪唑中的一种或多种混合；

进一步地，所述步骤(2)(2)(3)(4)中硅胶粒子与无水甲苯的质量比为1:3-10；

进一步地，所述步骤(2)(2)(3)(4)中色谱纯甲醇、去离子水、四氢呋喃与硅胶粒子的质量比为3-10：3-10:3-10:1。

本发明第三方面是提供了上述低流失混合分离模式液相色谱填料作为高效液相色谱柱固定相在复杂样品分析纯化的应用。

进一步地，将上述低流失混合分离模式液相色谱填料匀浆，然后将匀浆液立即倒入匀浆罐中，装满后，将匀浆罐盖好、旋紧；以甲醇为顶替液进行增压、保压、匀浆液中的填料滞留于柱尾的滤板上而匀浆液则被排除于柱外；保压时间达到后进行泄压，逐步将压力降至常压；压拆下已填装好的柱子并装配上带有筛板(滤网)的柱头，按照相应色谱柱检测条件进行检测。

更进一步地，所述填装压力为50-70MPa左右；所述升压方式采用程序加压；所述匀浆采用高压匀浆法。

进一步地，根据样品实际情况，确认用富集、过滤、稀释前处理等手段制备合适样品，选择合适的检测方式(检测器类型、采样频率)，样品和检测条件确认完善后采用低流失混合分离模式液相色谱填料进行样品检测与开发。

本发明的有益效果是：

本发明以长链烷烃、全氟苯基烷基、短链烷基为主要原料，在通过分布步键合的方式克服键合相活性不同的因素，得到范德华力、π-π作用力、面间作用力均匀分布在基质表面混合分离模式的色谱填料。比传统长链烷烃或者全氟苯基烷基单一作用力提供了更多分离模式。混合分离模式既具有C18的疏水作用，同时也具有PFP的π-π相互作用、偶极-偶极、氢键和形状选择性，多重作用模式，解决多重的分离问题；

本发明采用分步键合方法可以准备控制长链烷烃和全氟苯基烷基使用比例，相比于键合带有可离子化官能团的烷基链，可提供可更宽泛和自由的组合，可根据样品的性质进行调整，提供更多的选择性、降低分离的难度、且原料成本远远低于可离子化官能团的烷基链。并且，本发明采用分步法三键键合修饰实现混合键合相制备，可克服不同键合相反应活性的区别，准确控制不同键合相的比例，保证产品稳定性和一致性。

本发明的色谱填料长链烷烃和全氟苯基烷基均采用三键键合方式修饰至硅胶表面，采用三键合相，键合相与色谱填料基质结合更为牢固、使该系列填料具有更宽的耐pH范围，更低键合流失，色谱柱重现性与稳定性。

相比于两种固定相混合装柱，两种固定相是微观分离，本发明的填料应用时，色谱柱装填的稳定性、一致性、批次间稳定、重复性更好。

附图说明

图1混合分离模式填料键合示意(本发明填料的结构示意)；

图2实施例1、2、3、4混合分离模式填料柱性能检测色谱图：

图3实施例1相同条件不同分分离模式对复杂化合物分离效果；

图4实施例2甲基苯硫酚异构体的分离：

图5混合分离模式色谱流失性验证图。

具体实施方式

下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明提供了一种混合分离模式的色谱填料的制备，其特征在于，该制备方法的工艺过程是：硅羟基活化→三键全氟苯基烷修饰→三键烷基修饰→封尾→装填→复杂样品纯化。包括以下步骤：

(1)将符合液相色谱条件的硅胶粒子在0.01-0.1wt％酸中回流20-50小时。回流结束，冷却至室温，用去离子水洗涤三次后，无水乙醇洗涤三次，在15kPa真空及温度80℃的条件下，干燥20小时后得到硅羟基活化的硅胶粒子。

(2)干燥硅羟基活化的粒子分散在无水甲苯中，在有机胺的存在和氮气保护下与全氟苯基烷基三氯硅烷回流反应20小时。完成后，冷却至室温，分别用色谱纯甲醇、去离子水。四氢呋喃洗涤三次后，在15kPa真空及温度80℃的条件下，干燥20小时后得到一步键合的硅胶粒子。

(3)将一步键合硅胶粒子分散在无水甲苯中，在有机胺(的存在和氮气保护下与长链烷基三氯硅烷回流反应20小时。完成后，冷却至室温，分别用色谱纯甲醇、去离子水、四氢呋喃洗涤三次后，在15kPa真空及温度80℃的条件下，干燥20小时后得到混合键合的硅胶粒子。

(4)将混合键合硅胶粒子分散在无水甲苯中，在有机胺(的存在和氮气保护下与短链氯硅烷回流反应20小时。完成后，冷却至室温，分别用色谱纯甲醇、去离子水、四氢呋喃洗涤三次后，在15kPa真空及温度80℃的条件下，干燥20小时后得到混合分离模式硅胶粒子。

(5)色谱柱装填与表征配将步骤(4)填料匀浆，浆液是高压匀浆法的重要一环，将准备好的匀浆液立即倒入匀浆罐中，装满后，将匀浆罐盖好、旋紧。以甲醇为顶替液进行增压、保压、匀浆液中的填料滞留于柱尾的滤板上而匀浆液则被排除于柱外。保压时间达到后进行泄压，逐步将压力降至常压。压拆下已填装好的柱子并装配上带有筛板(滤网)的柱头，按照相应色谱柱检测条件进行检测。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例1

一种低流失混合分离模式液相色谱填料合成及在复杂样品分析纯化的应用，包括以下步骤：

将物理性质如下：粒径3.5μm全结构杂化球形、比表面185m

图3显示混合分离模式色谱填料在复杂化合物分离-取代的甲氧基苯异构体的分离的应用对比，其中，图中，分离的化合物为：

图3实验结果展示了C18/PFP具有和C18类似的疏水保留能力，单一键合的PFP保留相对偏弱，单一键合的C18对于苯环三取代异构体的选择性也相对较差，而混合分离模式tC18/PFP同时兼具了C18和PFP两种固定相的分离选择性,很好的提升了此款固定相的分离性能。

实施例2

一种低流失混合分离模式液相色谱填料合成及在复杂样品分析纯化的应用，包括以下步骤：

将物理性质如下：粒径3.5μm全结构杂化球形、比表面185m2/g、孔径

图4显示填料在甲基苯硫酚异构体的分离的应用对比，其中，分离的化合物为：

图4实验结果展示实验结果展示了C18/PFP具有和C18类似的疏水保留能力，单一键合的PFP分离效果差，封对称性好；单一键合的C18分离效果，拖尾严重；而混合分离模式tC18/PFP同时兼具了C18和PFP两种固定相的分离选择性,具有较好的分离度以及较好的拖尾因子。

实施例3

一种低流失混合分离模式液相色谱填料合成及在复杂样品分析纯化的应用，包括以下步骤：

将物理性质如下：粒径3.5μm全结构杂化球形、比表面185m2/g、孔径

图5显示了填料在复杂化合物分离-曲伏前列素的应用：

图5显示展示了C18/PFP具有对曲伏前列素异构体具有较好的分离性能，经过多次进样分离冲洗，异构体保留时间无变化，该填料具有较高的稳定性、键合相具有较低的流失。

实施例4

一种低流失混合分离模式液相色谱填料合成及在复杂样品分析纯化的应用，包括以下步骤：

将物理性质如下：粒径5μm全结构杂化球形、比表面185m

复杂化合物分离-曲伏前列素

实施例5

一种低流失混合分离模式液相色谱填料合成及在复杂样品分析纯化的应用，包括以下步骤：

将物理性质如下：粒径3μm高纯硅胶、比表面300m

实施例6

一种低流失混合分离模式液相色谱填料合成及在复杂样品分析纯化的应用，包括以下步骤：

将物理性质如下：粒径3.5μm全结构杂化球形、比表面185m

实施例7

按照与实施例1相同的方法获得相应的混合分离模式液相色谱填料，不同的是长链烷烃采用的是辛基三氯硅烷。

实施例8

按照与实施例1相同的方法获得相应的混合分离模式液相色谱填料，不同的是全氟苯基烷基三氯硅烷采用的是五氟苯基己基三氯硅烷。

实施例9

按照与实施例5相同的方法获得相应获得相应的混合分离模式液相色谱填料，不同的是步骤2、3、4采用的有机胺为乙二胺。

实施例10

按照与实施例5相同的方法获得相应混合分离模式液相色谱填料，不同的是粒径3μm高纯硅胶、比表面120m

实施例11

按照与实施例5相同的方法获得相应的获得相应的混合分离模式液相色谱填料，不同的是硅羟基活化酸为：氢氟酸。

实施例12

按照与实施例1相同的方法获得相应的混合分离模式液相色谱填料，不同的硅胶：甲苯＝1:3。

尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。