钙卫蛋白在青光眼辅助诊断或分型试剂盒中的应用

技术领域

本发明涉及青光眼诊断技术领域，具体而言，涉及钙卫蛋白在青光眼辅助诊断或分型试剂盒中的应用。

背景技术

青光眼是全球第二大致盲疾病，是由多因素引起的神经退行性疾病，主要表现为视神经退行性病变、视网膜神经节细胞减少和视野缺损。全球约有8000万人青光眼患者，其中40到80岁年龄范围内的成年人发病率约为3.5％，到2040年，这一数字可能将增至1.14亿。青光眼的诊断、分型、治疗效果评估和进展监测比较困难，需要结合眼压、视野和视网膜结构成像检查综合判断。但是由于眼压检查敏感度较低，特别是还存在正常眼压型青光眼。视网膜杯盘比由于敏感性和特异性都较差，不足以准确诊断青光眼。而视野缺陷只有在神经节细胞丢失25％-35％以上才能被临床检测到。因此，为辅助诊断青光眼、监测疾病进展以及评价治疗效果，需要寻找更敏感和特异的方法或生物标志物。

对于一个好的生物标志物，选择样本类型至关重要，非侵入性的、获取简单的样本最佳，而通过高风险、侵入性眼部手术才能获取的样本为次选。众所周知，非侵入性获取的样本主要包括泪液、尿液和粪便等。有文献报道，检测泪液中的某些成分对青光眼的诊断、预后判断和治疗评价有重要意义。但是使用青光眼药物后，特别是滴眼药，泪液中的炎症标记物和免疫反应相关的分子可能会发生特异性改变。由此，受青光眼药物影响较小的无创粪便标志物似乎具有潜在的应用价值。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供钙卫蛋白在青光眼辅助诊断或分型试剂盒中的应用以解决上述技术问题。

钙卫蛋白主要来源于中性粒细胞，是一种嗜中性的胞浆蛋白。钙卫蛋白存在于人体多种体液，在粪便中的浓度大约是正常血清的6倍，粪便钙卫水平与炎症程度成正相关，且粪便不需要任何侵入性操作。由于钙卫蛋白是一种非侵入性、无创、敏感、特异的炎症标志物，所以一直被广泛用于指导炎症性肠病(IBD)或感染性结肠炎等肠道疾病的诊断和治疗决策。目前尚无青光眼与粪便钙卫蛋白关系的研究。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明提供了钙卫蛋白在制备青光眼辅助诊断或诊断、产品中的用途，青光眼辅助诊断或诊断产品以钙卫蛋白为辅助诊断标志物或诊断标志物。

发明人通过对青光眼和正常健康对照人群粪便钙卫蛋白含量的检测，发现粪便钙卫蛋白含量与青光眼有较显著的联系，借助该原理开发出的检测试剂盒，能够对青光眼进行无创、方便、简单、快速、准确的检测，具有较好的诊断效能，具有较好的临床应用价值。

本发明的提出，可以用于开发青光眼辅助诊断、诊断、预后检测、疗效评估或复发监测产品，从而分别实现青光眼辅助诊断、诊断、预后检测、疗效评估和复发监测。

上述辅助诊断或诊断的用途包括不限于与其他的辅助诊断或诊断的方法联合进行联合辅助诊断或诊断，其他的辅助诊断或诊断的方法包括不限于：对于眼压、视野和视网膜结构成像检查。本领域的技术人员可以知晓，通过联合多种辅助诊断或诊断的方法以提高辅助诊断或诊断准确率、灵敏度、特异性。本领域的技术人员可以知晓，通过多种联合多种辅助诊断或诊断的方法进行方法上的互补(以弥补其中一种辅助诊断或诊断方法上的缺陷或不足)或替代均在本发明的保护范围之内。

在本发明应用较佳的实施方式中，青光眼辅助诊断、诊断、预后检测、疗效评估或复发监测产品选自如下产品中的至少一种：

试剂、试剂盒、芯片和测序文库。

在一种可选的实施方式中，上述试剂盒包括载体，且载体带有抗钙卫蛋白的抗体或其抗原结合片段；在一种可选的实施方式中，载体为纳米颗粒、磁珠、琼脂糖凝胶微球、硅胶微球、乳胶微球或多孔材料。载体与抗体的连接方式为偶联和/或物理连接。物理连接包括不限于静电吸附等。

在一种可选的实施方式中，带有抗钙卫蛋白的抗体或其抗原结合片段标记有可被检测的标记物。

在其他实施方式中，多孔材料选自ELISA板或其他的固相支持物。

例如将活化后的磁珠与抗钙卫蛋白的抗体进行孵育，使得磁珠上包被抗体。例如将琼脂糖凝胶微球或硅胶微球上偶联抗体，制得相应的免疫亲和吸附材料。

在一种可选的实施方式中，纳米颗粒选自有机纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。

磁珠也称磁性微球，磁性微球是指通过适当的方法使有机高分子和无机磁性纳米粒子结合起来形成特殊结构的具有一定磁性复合微球。磁珠包括不限于纳米磁珠和微米磁性微球。在一种可选的实施方式中，磁珠包括不限于：羧基磁珠、氨基磁珠、油胺修饰磁珠、硅羟基磁珠、磺酸基磁性微球、巯基磁性微球、PEG修饰磁珠、无修饰四氧化三铁磁珠、单分散硅包磁、环氧基磁珠、单分散介孔硅包磁、金包磁性纳米颗粒、链霉亲和素修饰磁珠、多聚赖氨酸修饰磁珠、镍磁珠、磁性聚苯乙烯微球、二氧化硅磁性微球。

乳胶微球是由无定形聚合物(通常是聚苯乙烯)形成的胶体尺寸范围内的球形聚合物颗粒，例如直径小于100nm的颗粒，或者粒径为0.3-0.5μm的颗粒，或者粒径超过1μm的颗粒。

乳胶微球包括不限于表面修饰有羟基、羧基或Toysal中至少一种功能基团的乳胶微球。

在一种可选的实施方式中，上述试剂盒还包括缓冲液、阳性对照、清洗液。

在一种可选的实施方式中，可被检测的标记物选自荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和胶体中的至少一种。

荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)。

在可选的实施方式中，催化底物显色的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。

在可选的实施方式中，放射性同位素包括但不限于

在一种可选的实施方式中，化学发光试剂选自吖啶酯、鲁米诺、光泽精、甲壳动物荧光素、联吡啶钌、二氧环乙烷、洛粉碱、异鲁米诺和过氧草酸盐中的至少一种。

胶体包括但不限于胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。

在可选的实施方式中，胶体金属包括但不限于胶体金、胶体银和胶体硒。

在本发明应用较佳的实施方式中，产品用于：

若受试样本中的钙卫蛋白水平高于阈值，则判断受试体患有青光眼，阈值为94.513μg/g。

在本发明应用较佳的实施方式中，受试样本为受试者的粪便样本。粪便样本具有非侵入性(无创)、获取简单的天然优势。

第二方面，本发明提供了钙卫蛋白在制备青光眼预后检测产品中的用途，青光眼预后检测产品以钙卫蛋白为预后检测标志物。

通过检测受试体样本的钙卫蛋白的水平，可以诊断目标样本是否患有青光眼或评估青关眼的风险，也可为青关眼的不良预后提供参考。

在本发明应用较佳的实施方式中，青光眼预后检测产品选自如下产品中的至少一种：

试剂、试剂盒、芯片和测序文库。

在本发明应用较佳的实施方式中，受试样本为受试者的粪便样本。

第三方面，本发明提供了钙卫蛋白在制备青光眼疗效评估或复发监测产品中的用途，青光眼疗效评估或复发监测产品以钙卫蛋白为疗效评估或复发监测标志物。

钙卫蛋白的变化也可了解患者病情进展状态。治疗后病人粪便中钙卫蛋白浓度的下降预示着治疗的成功，而浓度上升提示青光眼的治疗效果不佳或复发。因此，本发明提供的钙卫蛋白的标志物可以用于青光眼的疗效评估或复发监测。

在本发明应用较佳的实施方式中，青光眼疗效评估或复发监测产品选自如下产品中的至少一种：

试剂、试剂盒、芯片和测序文库。

在本发明应用较佳的实施方式中，受试样本为受试者的粪便样本本发明具有以下有益效果：

发明人通过对青光眼和正常健康对照人群粪便钙卫蛋白含量的检测，发现粪便钙卫蛋白含量与青光眼有较显著的联系，借助该原理开发出的检测试剂盒，能够对青光眼进行无创、方便、简单、快速、准确的检测，具有较好的诊断效能，具有较好的临床应用价值。

本发明的提出，可以用于开发青光眼辅助诊断、诊断、预后检测、疗效评估或复发监测产品，从而分别实现青光眼辅助诊断、诊断、预后检测、疗效评估和复发监测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为青光眼(Glaucoma)、原发性开角型青光眼(PACG)、原发性闭角型青光眼(PACG)的粪便样本分别与健康对照粪便样本中钙卫蛋白水平对比结果图；

图2为粪便钙钙卫蛋白区分青光眼患者和健康对照的ROC曲线图。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

一、样本的采集

本实施例招募青光眼患者以及与之匹配的健康对照，并留取粪便样本，具体如下。

1.本实施例招募了144名青光眼患者。所有参与研究的人都收到了相关信息，并填写了知情同意书。眼科医生基于视神经损伤和视野缺失等全面的眼科检查来诊断青光眼。参与者必须过去3个月内没有使用任何抗生素药品、益生菌或益生元产品；没有急性胃肠病或慢性胃肠疾病史；没有胃肠手术史(阑尾切除术除外)；没有其他神经退行性疾病，如帕金森病和阿尔茨海默病等。

2.招募了66名健康体检者，健康对照组既没有青光眼临床证据，也没有青光眼家族史。排除标准包括:有任何眼部不适，眼压(≥21mmHg)，最近做过任何手术，任何胃肠道疾病，任何神经退行性疾病，在过去3个月内服用任何抗生素药品，益生菌或益生元产品。并确保健康对照组与青光眼患者群体的性别和年龄无统计学差异。

3.在医院内为每位受试者提供无菌容器，收集粪便样本(5-10克)。粪便样本送往实验室，立即在-80℃冷冻，直至分析。

表1.病例临床信息表

正态分布的数据以平均值±标准差表示。通过非配对t检验(双尾)对患者和健康对照的年龄进行统计学差异，通过卡方检验对性别进行统计学差异(表1)。P<0.05为组间差异有统计学意义。缩写：PACG，原发性闭角型青光眼；POAG，原发性开角型青光眼；SG，继发性青光眼。

二、检测患者和对照人群粪便样本的钙卫蛋白浓度水平，方法如下：

1.洗涤液的配制

先用量筒量取720ml ddH

2.标准品的配制

取出7个新EP管，分别标记为1/2，1/4，1/8，1/16，1/32，1/64，0，在每个试管中加入500μl标准品&样品稀释液。将装有粉末的标准品管放入提前预冷好的离心机中，配平并调整参数为10000rpm，4℃，1min。离心完成后取出，用1000μl移液枪吸取1ml标准品&样品稀释液于标准品管中，静置2min后用涡旋仪充分混匀。吸取标准品管中500μl的标准品溶液(货号；EH4140,武汉，菲恩)加到第一个EP管中，充分混匀，然后再吸取第一个EP管已混匀的标准品溶液于第二个EP管，充分混匀，以此类推。标记为0的EP管中仅有标准品&样品稀释液。

3.生物素抗体工作液的制备

将装有粉末的生物素抗体标记管放入提前预冷好的离心机中，配平并调整参数为10000rpm，4℃，1min。离心完成后取出并用200μl移液枪吸取130μl的纯化水，加入生物素抗体标记管中，静置2min后用涡旋仪充分混匀。确定样本量后计算所需工作溶液总体积，计算方法为(检测样本数+2)×100μl得到所需工作溶液总体积。用抗体稀释液稀释按照1：100稀释已经配制好的抗体，并充分混合。(如将100μl的生物素抗体加入到9900μl的生物素抗体稀释液中)

4HRP-链霉亲和素偶联物(SABC)的制备

首先计算实验所需工作溶液总体积，然后进行配制。配制方法参照生物素抗体工作液的配制。

5.测定步骤

5.1在实验前1h左右提前取出样品和试剂盒(货号；EH4140,武汉，菲恩)，恢复至室温左右。提前规划好样本以及标准品孔的数量及位置，按照实验需要取出酶标板(酶标板上预包被有抗钙卫蛋白的抗体)，若有剩余的酶标板则放入密封袋中放于-20℃冰箱保存。

5.2向对应孔中加入100μl样品和标准品，覆膜，然后放置于37℃恒温箱中孵育90min。加样时应注意悬空操作，不要打出气泡，并尽量避免枪头触碰到孔底或孔壁。

5.3在下一步操作前10min配置好生物素抗体工作液。孵育时间到后，取下覆膜，甩去孔内液体，用300μl排枪吸取洗涤液从左到右加入酶标孔中进行洗涤操作，加入完成后甩去洗涤液重复一次，第二次洗涤结束后将酶标板倒扣于吸水纸上中力度拍打，除去所有洗涤液。然后向酶标孔中加入100μl生物素抗体工作液，覆膜，置于37℃恒温箱中孵育60min。

5.4在下一步操作前10min配制好HRP-链霉亲和素偶联物(SABC)工作液。孵育时间到后，取下覆膜，甩干孔内液体，用300μl排枪吸取洗涤液加入酶标孔中进行洗板操作，加入完成后静置1min，然后甩去孔内洗涤液后再次加入洗涤液，重复3次。最后一次洗涤完成后将酶标板倒扣于吸水纸上中力度拍打，除去所有洗涤液。然后向酶标孔中加入100μl HRP-链霉亲和素偶联物(SABC)工作液，覆膜，置于37℃恒温箱中孵育30min。

5.5孵育时间到后，取下覆膜，按照步骤4的操作方法洗板5次，最后一次洗涤后将酶标板倒扣于吸水纸上中力度拍打，除去所有洗涤液。然后向每孔加入90μl TMB底物溶液，覆膜，置于恒温箱中孵育15min左右，时间可根据实际情况进行缩短或延长，但不可超过30min。当标准品前四孔出现明显的蓝色梯度时，即可终止反应。

5.6向每孔中加入50μl反应终止液，可见蓝色变为黄色，注意加入反应终止液的顺序应当与加入TMB底物溶液的顺序相同。

5.7提前15min打开酶标仪预热。加入终止液后，立即在酶标仪的450nm吸光度处测定吸光度，读取OD

根据上述步骤可以得出患者和对照人群粪便样本的钙卫蛋白浓度水平。

三、利用上述步骤二测出的患者和对照健康人群的粪便钙卫蛋白浓度，进行差异分析。

使用R语言(版本号：4.1.3)进行统计分析，用**进行数据正态分布检验。

结果参照图1所示，分析后发现本次数据为非正态分布。需使用非参数检验进行差异分析，P<0.01表示结果有差异。两两比较使用Mann-Whitney U检验分析，青光眼和对照相比P＝0.00027，青光眼粪便钙卫蛋白水平明显高于健康对照。三者比较使用Kruskal-Wallis检验分析，原发性闭角型青光眼(PACG)和对照相比P＝0.00056，原发性开角型青光眼(POAG)和对照相比P＝0.016，且PACG和POAG均明显高于健康对照。以上结果证实粪便钙卫蛋白青光眼、青光眼亚型和健康对照比较具有显著性差异。

实施例2

本实施例对粪便钙卫蛋白对青光眼的诊断效能进行分析。

采用受试者工作特征(ROC)曲线分析和ROC曲线下面积(AUC)来确定诊断能力。通过(敏感性+特异性-1)计算约登指数来评估诊断的准确性。

基于以上实施例1的检测方法，发明人评估了粪便钙钙卫蛋白区分青光眼患者和健康对照的能力。

如图2所示，青光眼(AUC＝0.656，特异＝0.806，敏感性＝0.451，最大约登指数＝0.257，阈值＝94.513μg/g)，皆具有较好的诊断效能。

综上所述，本发明实施例首次证实了粪便钙卫蛋白在青光眼中的表达差异，粪便钙卫蛋白对于青光眼具有较好的区分能力。提示粪便钙卫蛋白可用于青光眼的辅助诊断，为青光眼的辅助诊断提供了一种新型的无创检测方法。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。