一种交联羊膜材料及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物医学材料技术领域，涉及眼部疾病的治疗材料，具体涉及一种交联羊膜材料及其制备方法与应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

目前羊膜材料已经广泛应用于翼状胬肉、青光眼、角膜损伤等多种眼部疾病的手术治疗。羊膜中基底膜和致密层的结构较为致密，海绵层结构疏松，为凝胶状薄层，在处理中易与羊膜主体分离脱落，因此一般制备羊膜材料的过程需要将海绵层去除，但是传统方法制备的羊膜材料比较薄、易卷曲，手术操作时展平困难且缝合易撕裂。据发明人研究了解，为克服这一缺点，目前可以采用交联技术制备羊膜制品，因为羊膜本身机械性能较差，往往需采用较高浓度的交联剂才能起到较好的改善作用，从而提高羊膜组织机械性能；但是该方法交联后的降解时间大大延长，对于眼科等一些需要羊膜起到临时覆盖、隔离作用的应用场景，降解时间过长可能引起异物反应，不利于自身组织愈合。另外，也可以将羊膜与其他材料天然或合成材料(如动物心包膜、丙烯酰胺水凝胶、PCL纤维膜等)复合以改善其机械性能，但引入粘合剂、交联剂、其他高分子材料等多种成分，且处理过程复杂，严重影响了羊膜本身优良生物学性能的发挥，同样存在降解时间延长的问题。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种交联羊膜材料及其制备方法与应用，本发明制备的交联羊膜材料不仅具有合适的机械性能，有利于眼科手术的操作，而且具有较快的降解速度，避免引起异物反应，还能避免对羊膜活性物质的破坏。本发明的制备方法简单同时能够避免交联剂残留的毒性作用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

一方面，一种交联羊膜材料的制备方法，包括如下步骤：

采用机械法将胎膜绒毛膜层剥离，保留海绵层和羊膜层，记为羊膜/海绵层，并对羊膜/海绵层进行清洗；

采用羊膜/海绵层置于15～40℃条件下进行烘干，使烘干后的羊膜/海绵层的含水量为10～20％；

将烘干后的羊膜/海绵层置于低浓度交联剂溶液中进行交联，即得；所述低浓度交联剂溶液中含有交联剂，且交联剂的质量浓度不高于0.5％。

本发明在制备羊膜材料时，通过保留海绵层提高羊膜材料的厚度，然后通过在低浓度的交联剂溶液中进行交联，从而提高交联羊膜材料的机械性能，同时降低了交联剂的使用浓度。然而，研究发现，当保留海绵层后，进行交联时，会导致形成的材料吸水膨胀、厚度大大增加且透明性变差，从而不利于作为眼科手术的治疗材料。本发明在交联前控制温度进行烘干，通过控制羊膜/海绵层的含水量，从而控制海绵层与羊膜层紧密连接，从而避免交联时导致的吸水膨胀、厚度大大增加且透明性变差的问题。烘干时控制温度的目的在于避免对羊膜活性物质的破坏。

另一方面，一种交联羊膜材料，由上述制备方法获得。

第三方面，一种上述交联羊膜材料在制备手术治疗眼科疾病的材料中的应用。

第四方面，一种手术治疗眼科疾病的方法，采用上述交联羊膜材料对疾病处进行修补、临时覆盖和/或隔离。

本发明的有益效果为：

本发明通过将羊膜和海绵层复合在一起，只需较低浓度的交联剂交联，即可获得机械性能良好的羊膜样品，柔软且夹持不卷曲，易于展平，便于手术操作，且具有与天然羊膜接近的降解速度，同时避免了使用高剂量交联剂后反复清洗对羊膜活性物质的破坏，以及交联剂残留的毒性作用。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例1制备的交联羊膜材料夹持时的外观图；

图2为本发明实施例2制备的交联羊膜材料夹持时的外观图；

图3为本发明对比例1制备的交联羊膜材料夹持时的外观图；

图4为本发明对比例2制备的交联羊膜材料夹持时的外观图；

图5为本发明对比例3制备的交联羊膜材料夹持时的外观图；

图6为本发明对比例4制备的交联羊膜材料夹持时的外观图；

图7为本发明对比例5制备的交联羊膜材料平放时的外观图；

图8为本发明对比例5制备的交联羊膜材料夹持时的外观图；

图9为未交联羊膜夹持时的外观图；

图10为本发明实施例1、2制备的交联羊膜材料的生长因子含量柱状图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

为了解决现有羊膜材料无法兼顾机械性能、降解时间以及生物学性能发挥的问题，本发明提出了一种交联羊膜材料及其制备方法与应用。

本发明的一种典型实施方式，提供了一种交联羊膜材料的制备方法，包括如下步骤：

采用机械法将胎膜绒毛膜层剥离，保留海绵层和羊膜层，记为羊膜/海绵层，并对羊膜/海绵层进行清洗；

采用羊膜/海绵层置于15～40℃条件下进行烘干，使烘干后的羊膜/海绵层的含水量为10～20％；

将烘干后的羊膜/海绵层置于低浓度交联剂溶液中进行交联，即得；所述低浓度交联剂溶液中含有交联剂，且交联剂的质量浓度不高于0.5％。

在一些实施例中，获得胎膜的供体的HbsAg、HIV、HBV、BCV及梅毒检查均为阴性。能够从原材料的层面保证制备的交联羊膜材料的安全性。

在一些实施例中，采用生理盐水对羊膜/海绵层进行清洗。该方式能够更好地清除羊膜上带的血细胞和杂质，避免血细胞和杂质对制备的交联羊膜材料影响。

在一些实施例中，烘干时间为10～40小时。该条件能够更好的保证羊膜/海绵层的含水量为10～20％。

在一些实施例中，交联剂溶液中采用的交联剂为环氧化物交联剂、双醛交联剂、EDC/NHS或京尼平。双醛交联剂可以是戊二醛、双醛淀粉、双醛透明质酸、双醛葡聚糖、双醛羧甲基纤维素。环氧化物交联剂可以是1,4-丁二醇双缩水甘油醚、环氧氯丙烷、乙二醇二缩水甘油醚、聚甘油聚缩水甘油醚。研究表明采用环氧化物交联剂，尤其是1,4-丁二醇双缩水甘油醚，进行交联时，效果更好。

对于不同的交联体系，适宜的交联pH不同，例如EDC/NHS、戊二醛，适宜的交联pH为酸性如3.5～6.0；再例如双醛淀粉，适宜的交联pH为中性；等等。在一些实施例中，交联剂溶液的pH为8～11。该条件下更有利于1,4-丁二醇双缩水甘油醚发挥交联作用。

每平方厘米羊膜/海绵层添加低浓度交联剂溶液的体积为5～15mL，优选为9～11mL。能够更好的保证交联充分。

本发明中将烘干后的羊膜/海绵层置于低浓度交联剂溶液中进行交联，以充分交联为准，对于不同的交联体系，采用的交联时间不同，例如EDC/NHS交联时间12h～30h；再例如双醛淀粉交联时间10min～60min；再例如戊二醛交联时间12h～36h；等等。在一些实施例中，交联时间为60h～80h。该条件下更有利于1,4-丁二醇双缩水甘油醚充分交联。

在一些实施例中，交联后采用生理盐水进行洗涤。去除未反应的交联剂。

在一些实施例中，将交联后的交联羊膜材料进行γ射线辐照灭菌。

本发明的另一种实施方式，提供了一种交联羊膜材料，由上述制备方法获得。

本发明的第三种实施方式，提供了一种上述交联羊膜材料在制备手术治疗眼科疾病的材料中的应用。

本发明的第四种实施方式，提供了一种手术治疗眼科疾病的方法，采用上述交联羊膜材料对疾病处进行修补、临时覆盖和/或隔离。

例如：采用所述交联羊膜材料进行角膜重建、结膜缺损修补、角膜溃疡、翼状胬肉的治疗等眼科手术的治疗。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

在无菌条件下获取HbsAg、HIV、HBV、BCV及梅毒检查均为阴性的健康产妇剖腹产得到的胎膜，钝性机械剥离绒毛膜层，保留海绵层和羊膜层，用生理盐水清洗1h。15℃下将羊膜/海绵层烘干10小时，经干燥失重法检测，含水量为20％，使二者紧密贴合。常温下，将羊膜/海绵层放入0.05％(w/w)的1,4-丁二醇双缩水甘油醚水溶液中进行交联，交联剂溶液体积与羊膜/海绵层的面积比例为10mL：1cm

实施例2

在无菌条件下获取HbsAg、HIV、HBV、BCV及梅毒检查均为阴性的健康产妇剖腹产得到的胎膜，钝性机械剥离绒毛膜层，保留海绵层和羊膜层，用生理盐水清洗1h。30℃下将羊膜/海绵层烘干15小时，经干燥失重法检测，含水量为15％，使二者紧密贴合。常温下，将羊膜/海绵层放入0.1％(w/w)的1,4-丁二醇双缩水甘油醚水溶液中进行交联，交联剂溶液体积与羊膜/海绵层的面积比例为10mL：1cm

对比例1

在无菌条件下获取HbsAg、HIV、HBV、BCV及梅毒检查均为阴性的健康产妇剖腹产得到的胎膜，钝性机械去除绒毛膜层，用细胞刮铲刮除海绵层，用生理盐水清洗1h。常温下，将羊膜放入0.1％(w/w)的1,4-丁二醇双缩水甘油醚水溶液中进行交联，交联剂溶液体积与羊膜的面积比例为10mL：1cm

对比例2

在无菌条件下获取HbsAg、HIV、HBV、BCV及梅毒检查均为阴性的健康产妇剖腹产得到的胎膜，钝性机械去除绒毛膜层，用细胞刮铲刮除海绵层，用生理盐水清洗1h。常温下，将羊膜放入1％(w/w)的1,4-丁二醇双缩水甘油醚水溶液中进行交联，交联剂溶液体积与羊膜的面积比例为10mL：1cm

对比例3

在无菌条件下获取HbsAg、HIV、HBV、BCV及梅毒检查均为阴性的健康产妇剖腹产得到的胎膜，钝性机械去除绒毛膜层，用细胞刮铲刮除海绵层，用生理盐水清洗1h。常温下，将羊膜放入2％(w/w)的1,4-丁二醇双缩水甘油醚水溶液中进行交联，交联剂溶液体积与羊膜的面积比例为10mL：1cm

对比例4

在无菌条件下获取HbsAg、HIV、HBV、BCV及梅毒检查均为阴性的健康产妇剖腹产得到的胎膜，钝性机械去除绒毛膜层，用细胞刮铲刮除海绵层，用生理盐水清洗1h。常温下，将羊膜放入10％(w/w)的1,4-丁二醇双缩水甘油醚水溶液中进行交联，交联剂溶液体积与羊膜的面积比例为10mL：1cm

对比例5

在无菌条件下获取HbsAg、HIV、HBV、BCV及梅毒检查均为阴性的健康产妇剖腹产得到的胎膜，钝性机械剥离绒毛膜层，保留海绵层和羊膜层，用生理盐水清洗1h。常温下，将羊膜/海绵层放入0.1％(w/w)的1,4-丁二醇双缩水甘油醚水溶液中进行交联，交联剂溶液体积与羊膜/海绵层的面积比例为10mL：1cm

性能检测试验：

1、样品外观：

本发明实施例1、2以及对比例1～5制备的交联羊膜材料的外观如图1～8所示，未交联的羊膜外观如图9所示。实施例1～2制备的交联羊膜材料具有良好的机械性能，夹持不易卷曲，易展平，用于眼科手术可操作性良好。

对比例1～4仅采用羊膜层制备的交联羊膜材料需要在高浓度条件下才能实现与实施例1～2制备的交联羊膜材料相同的性能。

对比例5得到的样品浸泡后羊膜和海绵层有一定的分离，吸水膨胀，厚度大大增加且透明性变差，不利于用于眼科手术。

2、体外降解时间：

将实施例1、2和对比例1～4得到的交联羊膜材料和新鲜羊膜分别裁成10mm×10mm的膜片置于锥形瓶中，加入100ml预热到37℃的1％胃蛋白酶盐酸溶液(c(HCL)＝0.1mol/L)，37℃振荡培养箱中振摇，记录消化时间。结果如表1所示。

表1各样品的完全消化降解时间

表1结果表明实施例1～2制备的交联羊膜材料降解时间与新鲜羊膜接近，对比例1得到的样品在0.1％交联剂浓度下降解时间与新鲜羊膜接近，但机械性能差，可操作性差。对比例2～4制备的交联羊膜材料降解时间均较长甚至长时间未降解，不利于用于眼科手术。

3、细胞因子含量：

使用人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)检测试剂盒(名称：QuantiCyto HumanbFGF ELISA kit，厂家：欣博盛生物科技有限公司)、人表皮生长因子(EGF)检测试剂盒(名称：QuantiCyto Human EGF ELISA kit，厂家：欣博盛生物科技有限公司)、人肝细胞生长因子(HGF)检测试剂盒(名称：QuantiCyto Human HGF ELISA Kit，厂家：欣博盛生物科技有限公司)进行样品bFGF、EGF、HGF含量检测。

将实施例1～2制备的交联羊膜材料和新鲜羊膜冷冻干燥后各取20mg，剪碎，加入1ml裂解液，用均质机均质2min后，4℃13000转离心15min，取上清，按照各生长因子检测试剂盒说明书规定的方法进行检测。

结果如图10所示，图10表明，实施例1～2得到的交联羊膜材料的活性因子含量为新鲜羊膜的90％左右，能够较好地保存羊膜的生物活性物质。

4、动物试验：

将实施例1～2制备的交联羊膜与未交联羊膜用于兔角膜浅层缺损的临时覆盖手术，与未交联羊膜相比，实施例1～2制备的交联羊膜夹持不卷曲、易于展平，可操作性好，缩短了手术操作时间。经宏观观察和病理组织切片观察，各样品降解时间如表2所示。

表2各样品降解时间

实施例3

在无菌条件下获取HbsAg、HIV、HBV、BCV及梅毒检查均为阴性的健康产妇剖腹产得到的胎膜，钝性机械剥离绒毛膜层，保留海绵层和羊膜层，用生理盐水清洗1h。20℃下将羊膜/海绵层烘干20小时，经干燥失重法检测，含水量为15％，使二者紧密贴合。常温下，将羊膜/海绵层放入0.5％(w/w)的双醛淀粉水溶液中进行交联，交联剂溶液体积与羊膜/海绵层的面积比例为10mL：1cm

经过样品外观、体外降解时间及细胞因子含量的性能检测表明，本实施例制备的交联羊膜材料机械性能良好，夹持不易卷曲，易展平，降解时间适宜，能够较好的保存羊膜的生物活性物质，有利于眼科手术。

实施例4

在无菌条件下获取HbsAg、HIV、HBV、BCV及梅毒检查均为阴性的健康产妇剖腹产得到的胎膜，钝性机械剥离绒毛膜层，保留海绵层和羊膜层，用生理盐水清洗1h。40℃下将羊膜/海绵层烘干10小时，经干燥失重法检测，含水量为18％，使二者紧密贴合。常温下，将羊膜/海绵层放入0.1％(w/w)的戊二醛水溶液中进行交联，交联剂溶液体积与羊膜/海绵层的面积比例为10mL：1cm

经过样品外观、体外降解时间及细胞因子含量的性能检测表明，本实施例制备的交联羊膜材料机械性能良好，夹持不易卷曲，易展平，降解时间适宜，能够较好的保存羊膜的生物活性物质，有利于眼科手术。

实施例5

在无菌条件下获取HbsAg、HIV、HBV、BCV及梅毒检查均为阴性的健康产妇剖腹产得到的胎膜，钝性机械剥离绒毛膜层，保留海绵层和羊膜层，用生理盐水清洗1h。25℃下将羊膜/海绵层烘干15小时，经检测，含水量为15％，使二者紧密贴合。常温下，将羊膜/海绵层放入0.15％(w/w)EDC/0.2％(w/w)NHS水溶液中进行交联，交联剂溶液体积与羊膜/海绵层的面积比例为10mL：1cm

经过样品外观、体外降解时间及细胞因子含量的性能检测表明，本实施例制备的交联羊膜材料机械性能良好，夹持不易卷曲，易展平，降解时间适宜，能够较好的保存羊膜的生物活性物质，有利于眼科手术。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。