一种室内简化驯养暗纹东方鲀和红鳍东方鲀人工快速杂交授精的方法

技术领域

本发明属于珍稀特有鱼类的人工杂交授精技术领域，具体涉及一种室内简化驯养暗纹东方鲀和红鳍东方鲀人工快速杂交授精的方法。

背景技术

暗纹东方鲀（

红鳍东方鲀（

杂交育种技术可以结合双亲物种的优势性状，改善杂交子代的外观、生长发育、育性、口感、抗逆性、抗病能力以及营养价值等方面，并挑选杂交优势种生产养殖从而提升经济效益。红鳍东方鲀生长速度更快，体型更大，具备更强抗低温能力，但因其无法淡水养殖推广受到限制，为了取得生长速度快、抗逆性强、肉质鲜美、淡水化养殖的河鲀，兼备不同特性的杂交新品种孕育而生。

养殖亲鱼的物理促熟、人工催产授精等工作，多需要固定的亲鱼种质资源培育、催产场地设施建设、专职人员长期维护等多项适宜。实验室或中小型场地难以长期室内养殖亲本条件，养殖基地又缺乏实验相关器械和科研人员，因此众多有关亲鱼催产、杂交授精、卵子基因编辑等相关课题开展大大受阻，为解决该问题简化设置了实验室或中小型场地杂交河鲀亲本驯养催产授精方法。

发明内容

解决的技术问题：针对上述技术问题，本发明提供一种室内简化驯养暗纹东方鲀和红鳍东方鲀人工快速杂交授精的方法，能有效解决实验室内或中小型场地因亲本种质资源缺乏、亲鱼性腺发育不成熟、不同步、运输应激反应抑制性腺、种间杂交授精率低等不足之处。

技术方案：一种室内简化驯养暗纹东方鲀和红鳍东方鲀人工快速杂交授精的方法，包括以下步骤：

S1、抗应激环境模拟阶段：包括红鳍东方鲀雄鱼环境模拟和暗纹东方鲀雌鱼洄游模拟，所述红鳍东方鲀雄鱼环境模拟通过亲鱼选择、维生素抗应激、环境模拟设置和性腺营养维护的理化刺激完成对红鳍东方鲀雄鱼环境抗应激驯养，所述暗纹东方鲀雌鱼洄游模拟通过亲鱼选择、维生素抗应激、洄游模拟设置和性腺营养维护的理化刺激完成对暗纹东方鲀雌鱼洄游环境抗应激驯养；

S2、同步药物催产阶段：对完成环境抗应激驯养的红鳍东方鲀雄鱼和暗纹东方鲀雌鱼的催产；

S3、人工授精阶段：包括渗透控制杂交授精和氯化钠溶液脱粘。

优选的，步骤S1中红鳍东方鲀雄鱼环境模拟的具体操作为：每年2~6月，使用10~20ppm高锰酸钾溶液浸泡驯养装置完成杀菌消毒，模拟红鳍东方鲀2~6月繁殖季节温度，添加维生素药品影响鱼体应激反应，营养强化稳定性腺发育，短期内完成催产前场地驯养工作。

优选的，步骤S1中暗纹东方鲀雌鱼洄游模拟的具体操作为：每年2~6月，使用10~20ppm高锰酸钾溶液浸泡驯养装置完成杀菌消毒，模拟暗纹东方鲀2~6月繁殖季节洄游环境，添加维生素药品影响鱼体应激反应，营养强化稳定性腺发育，短期内完成催产前场地驯养工作。

进一步的，所述驯养装置包括驯养池，所述驯养池的进水口与进水管连接，所述进水管上依次串联水泵、三级净水装置和调温池，所述驯养池的排水口与水泵的进水口连接，所述驯养池的进气口与曝气系统连接，所述曝气系统包括气管和设置在气管上的气泵。

优选的，步骤S2的具体操作为：亲鱼抗应激驯养1~2周后，抓取暗纹东方鲀雌鱼注射鲤鱼鲫鱼脑垂体和绒毛膜促性腺激素，24~36 h后注射鲤鱼鲫鱼脑垂体、绒毛膜促性腺激素和促黄体素释放激素类似物，同时抓取红鳍东方鲀雄鱼注射鲤鱼鲫鱼脑垂体、绒毛膜促性腺激素和促黄体素释放激素类似物；注射后24~72 h内密切观察亲鱼是否进入效应时间。

进一步的，亲鱼进入效应时间的判断标准为：临产红鳍东方鲀雄鱼，轻压腹部精巢部位，泻殖孔处有乳白色精液溢出，且精液遇水即散；临产暗纹东方鲀雌鱼，腹部柔软，生殖孔松弛变大且常伴有红肿现象，用手轻压腹部卵巢部位，可见少量淡黄色卵子溢出。

优选的，步骤S3的具体操作为：通过预制的氯化钠溶液，控制渗透效果增强授精效率，并利用海水晶预制的质量分数5‰微咸水激活增强精子活力，受精卵吸水膨胀后，使用氯化钠溶液搅拌脱粘，最终完成提升杂交河鲀鱼卵的授精率和孵化率，所述氯化钠溶液中氯化钠与水的质量比为7：1000。

有益效果：本发明提供的杂交河鲀双亲简化同步催产及人工授精方法，是深入研究杂交河鲀遗传背景后，对红鳍东方鲀和暗纹东方鲀性腺发育规律、杂交授精关键激素因子进行人为控制，通过对杂交河鲀亲本抗应激驯养后对药物同步催产和杂交授精改进方法，实现红鳍东方鲀和暗纹东方鲀的简化快速杂交授精工作；本发明方法实现操作简单、过程快速、管理容易、授精率高等特点。为该特有鱼种的规模化孵化和养殖产业提供技术支持，为今后杂交领域进一步展开科学研究提供思路。有利于实验室内或中小型场地杂交繁育及受精孵化相关领域的科学发展，也有利于促进河鲀杂交繁育和杂交河鲀养殖产业的蓬勃发展。

附图说明

图1是本发明的人工授精流程示意图；

图2是本发明的驯养装置结构示意图；

图中序号：1、驯养池，2、排水口，3、进水口，4、曝气系统，5、气泵，6、水泵，7、三级净水装置，8、调温池。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作详细说明：

实施例1

一种室内简化驯养暗纹东方鲀和红鳍东方鲀人工快速杂交授精的方法，包括以下步骤：

S1、抗应激环境模拟阶段：结合亲本可以外地养殖，使用时长途运输获取的背景条件，设置了简化雌雄亲本抗应激环境模拟驯养场地，实现快速降低亲本转移环境后的生理应激反应，并提供亲本简化驯养场地支持。该阶段包括红鳍东方鲀雄鱼环境模拟和暗纹东方鲀雌鱼洄游模拟：

(1) 红鳍东方鲀雄鱼环境模拟：红鳍东方鲀雄鱼抗应激环境模拟驯养过程包括：亲鱼选择、维生素抗应激、环境模拟设置和性腺营养维护等理化刺激完成红鳍东方鲀雄鱼环境抗应激驯养。每年2~6月，使用10~20 ppm高锰酸钾溶液浸泡驯养装置完成杀菌消毒，模拟红鳍东方鲀2~6月繁殖季节温度，添加维生素药品影响鱼体中枢神经调节和抗氧化酶活性等相关应激反应，营养强化稳定性腺发育，短期内完成催产前场地驯养工作，驯养装置如图2所示，其包括驯养池1，所述驯养池1的进水口3与进水管连接，所述进水管上依次串联水泵6、三级净水装置7和调温池8，所述驯养池1的排水口2与水泵6的进水口连接，所述驯养池1的进气口与曝气系统4连接，所述曝气系统4包括气管和设置在气管上的气泵5。具体过程为：

①亲鱼选择：每年2~6月份，挑选体质健壮、体表光滑无伤痕、近期无病症发生，且对外界刺激反应灵敏的家化2~4龄的红鳍东方鲀雄鱼，挑选其中精巢成熟Ⅲ~Ⅴ期个体作为亲本，运输袋或水车运输后实验室内或中小型场地驯养池驯养；

②维生素抗应激：亲鱼运输完成后，驯养池1中加入维生素抗应激药物（水产用Vc）10~15 mg/L，避免应激源产生，同时有效调节鱼体皮质醇、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH）等应激相关物，从而提升运输存活率、降低第二阶应激反应产生的性腺不可逆破坏、提升亲鱼催产效果；提前准备含10~15 mg/L水产用Vc抗应激药物的驯养水体，亲本过水驯养，驯养初24 h内关闭水循环系统，停止投喂，使用维生素增强自身抗氧化能力，提高SOD的活性，增强机体抗应激能力；24 h后开起水循环系统，开始投喂，环境模拟驯养；

③环境模拟设置：驯养期间雄鱼水缸密度≤4尾/m

④性腺营养维护：避免抗应激驯养期间营养不良引起性腺退化，驯养期间采用蛋白含量30~35%商业饲料，加以河蚌、鱼虾等鲜活饵料提供营养强化；营养强化根据亲鱼性腺发育后进食情况实时调整，并在催产药物注射后停止投喂；每天投喂亲鱼总体重1~2%食物（50%商业配合饲料和50%鲜活饵料），投喂2次/天，分别是早上8：00~8：30和下午4：00~4：30，早晚投喂量分别占日投喂量30%~50%和50%~70%，每次投喂进食时间不超过30min，根据20min内进食情况适当调整日投喂量。

(2)暗纹东方鲀雌鱼洄游模拟：暗纹东方鲀雌鱼抗应激洄游环境模拟驯养过程包括：亲鱼选择、维生素抗应激、洄游模拟设置和性腺营养维护等理化刺激完成暗纹东方鲀雌鱼洄游环境抗应激驯养。每年2~6月，使用10~20 ppm高锰酸钾溶液浸泡驯养装置完成杀菌消毒，模拟暗纹东方鲀2~6月繁殖季节洄游环境，添加维生素药品影响中枢神经调节和抗氧化酶活性等相关应激反应，营养强化稳定性腺发育，短期内完成催产前场地驯养工作。具体过程为：

①亲鱼选择：每年2~6月份，挑选体质健壮、体表光滑无伤痕、近期无病症发生，且对外界刺激反应灵敏的家化3~4龄的暗纹东方鲀雌鱼，挑选其中卵巢成熟Ⅲ~Ⅳ期个体作为亲本，运输袋或水车运输后实验室内或中小型场地驯养池驯养；

②维生素抗应激：亲鱼运输完成后，驯养池1中加入维生素抗应激药物（水产用Vc）10~15 mg/L，避免应激源产生，同时有效调节鱼体皮质醇、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH）等应激相关物，从而提升运输存活率、降低第二阶应激反应产生的性腺不可逆破坏、提升亲鱼催产效果；提前准备含10~15 mg/L水产用Vc抗应激药物驯养水体，亲本过水驯养，驯养初24h内关闭水循环系统，停止投喂，使用维生素增强自身抗氧化能力，提高SOD的活性，增强机体抗应激能力；24h后开起水循环系统，开始投喂，模拟洄游环境驯养；

③洄游模拟设置：驯养期间雌鱼水缸密度减半≤2尾/ m

④性腺营养维护：考虑暗纹东方鲀雌鱼卵子为一次排卵方式生殖，维持卵巢发育需更多营养物质，避免抗应激驯养期间营养不良引起性腺退化，驯养期间采用蛋白含量30~45%商业饲料，加以河蚌、鱼虾等鲜活饵料提供营养强化；营养强化根据亲鱼性腺发育后进食情况实时调整，并在药物注射后停止投喂；每天投喂亲鱼总体重1~2%食物（20%商业配合饲料和80%鲜活饵料），投喂2次/天，分别是早上8：00~8：30和下午4：00~4：30，早晚投喂量分别占日投喂量30%~50%和50%~70%，每次投喂进食时间不超过30min，根据20min内进食情况适当调整日投喂量。

S2、同步药物催产阶段：亲鱼抗应激驯养1~2周后，抓取暗纹东方鲀雌鱼注射鲤鱼鲫鱼脑垂体（PG）和绒毛膜促性腺激素（HCG）；24~36h后注射鲤鱼鲫鱼脑垂体（PG）、绒毛膜促性腺激素（HCG）和促黄体素释放激素类似物（LHRH-A），同时抓取红鳍东方鲀雄鱼注射鲤鱼鲫鱼脑垂体（PG）、绒毛膜促性腺激素（HCG）和促黄体素释放激素类似物（LHRH-A）；催产药物注射后24~72h内密切观察亲鱼的行为、体色变化等，判断亲鱼是否进入效应时间。当亲鱼腹部膨大、游动迟缓、长时间卧底和体色变淡时，应及时检查性腺状况，避免错过最佳排卵排精时机。临产红鳍东方鲀雄鱼，轻压腹部精巢部位，泻殖孔处有乳白色精液溢出，且精液遇水即散；临产暗纹东方鲀雌鱼，腹部柔软，生殖孔松弛变大且常伴有红肿现象，用手轻压腹部卵巢部位，可见少量淡黄色卵子溢出，取卵子放入河鲀卵子固定液中，显微镜检查卵子发育情况。及时完成人工杂交催产，避免错过最佳授精时间，导致授精率下降或暗纹东方鲀雌鱼自行排卵等。该阶段包括红鳍东方鲀雄鱼催产和暗纹东方鲀雌鱼催产：

(1) 红鳍东方鲀雄鱼药物催产：抗应激环境模拟后，无需转移亲鱼，直接捞取红鳍东方鲀雄鱼，擦拭体表水分，根据解剖学结构使用已消毒的1 mL医用注射器在红鳍东方鲀雄鱼左侧胸鳍无皮刺区域或腹部胸腔无皮刺区域注射脑垂体（PG）、绒毛膜促性腺激素（HCG）和促黄体素释放激素类似物（LHRH-A）催产药物（其中PG的剂量为2~5 mg/kg、HCG的剂量为200-300 IU/kg和LHRH-A的剂量为100-300 μg/kg），进针深度5~15 mm，红鳍东方鲀雄鱼第一针注射与暗纹东方鲀雌鱼第二针注射同步进行，注射后使用碘伏溶液（碘伏与水的质量比为1:100~2:100）擦拭注射区域消毒；

(2) 暗纹东方鲀雌鱼药物催产：抗应激洄游环境模拟后，无需转移亲鱼，捞取暗纹东方鲀雌鱼，擦拭体表水分，根据解剖学结构使用已消毒的1 mL医用注射器在暗纹东方鲀雌鱼左侧胸鳍无皮刺区域或腹部胸腔无皮刺区域，第一针先注射低浓度脑垂体（PG）和促黄体素释放激素类似物（LHRH-A）催产药物（其中PG的剂量为1-2 mg/kg和LHRH-A的剂量为50-100 μg/kg）预催产，进针深度5~10 mm，注射后使用碘伏溶液（碘伏与水的质量比为1:100~2:100）擦拭注射区域消毒；第一针注射24~36 h后，再次捞取亲鱼，第二针注射高浓度鲤鱼鲫鱼脑垂体（PG）、绒毛膜促性腺激素（HCG）和促黄体素释放激素类似物（LHRH-A）催产药物（其中PG的剂量为2~5 mg/kg、HCG的剂量为200-300 IU/kg和LHRH-A的剂量为100-300 μg/kg），进针深度5~10 mm，注射后使用碘伏溶液（碘伏与水的质量比为1:100~2:100）擦拭注射区域消毒。

S3、人工授精阶段：通过预制的氯化钠溶液，控制渗透效果增强授精效率，并利用海水晶预制的质量分数5‰微咸水激活增强精子活力，受精卵吸水膨胀后，使用氯化钠溶液（氯化钠与水的质量比为7:1000）搅拌脱粘，最终完成提升杂交河鲀授精率和孵化率。该阶段包括渗透控制杂交授精和氯化钠溶液脱粘：

(1) 渗透控制杂交授精：利用氯化钠和不含氯的纯水配制质量比为7:1000的氯化钠溶液；向授精器皿（瓷器盆、不锈钢盆或玻璃皿等）加入刚好盖过皿底的生理盐水；抓取腹部紧质，轻压腹部生殖孔出现生殖突起，挤压腹部有乳白色精液流出的待产红鳍东方鲀雄鱼，擦拭水分，收集精子加入授精器皿，混匀精液与氯化钠溶液；再抓取腹部膨大，生殖孔外突具有充血症状的待产暗纹东方鲀雌鱼，擦拭水分，收集卵子加入授精器皿，混匀；雌雄授精比例保持1：1；授精期间使用柔软羽毛，顺时针缓慢搅拌混匀精卵混合液，整个混匀过程不超过5min；混匀后向授精器皿中加入利用海水晶和不含氯的纯水配制质量分数5‰微咸水，微咸水加入量以刚好水溶液盖过卵子为准，继续缓慢搅拌混匀，整个混匀过程不超过5min，搅拌结束再加入受精卵体积2~3倍的质量分数5‰微咸水，搅拌均匀，完成授精过程；

(2) 氯化钠溶液脱粘：上述授精后的受精卵混合液静置1~2 min，倒去上层浑浊液（注意勿使受精卵与空气接触、人工授精避免阳光直射）；加入受精卵体积2~3倍的氯化钠溶液（氯化钠与水的质量比为7:1000），使用柔软的羽毛，顺时针缓慢搅拌混匀搅拌受精卵混合液10 min，再静置2 min，倒去上层浑浊液，重复3~5次加液、混匀搅拌和去液操作，完成脱粘。

实施例2

2022年2 月10日选取3~4龄红鳍东方鲀雄鱼6尾，暗纹东方鲀雌鱼6尾。将选出红鳍东方鲀雄鱼和暗纹东方鲀雌鱼放置在上述已消毒驯养池中，控制密度。通过观察控制驯养过程，调节水质、保持水温、水流、曝气系统。

经过40天养殖，3月22日按照规定注射暗纹东方鲀雌鱼催产药剂第一针；3月25日按照规定注射暗纹东方鲀雌鱼第二针，红鳍东方鲀雄鱼第一针注射；3月27日对6尾雌鱼收集卵子，共获得671g卵子；对雄鱼收集精子，进行人工授精工作，完成获得杂交671g受精卵。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。