一种促进番茄果实成熟的基因及其方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及到一种调控番茄果实成熟的基因及其方法，特别涉及一种AP2/ERF家族转录因子SlERF.D3，该基因在调控番茄果实成熟中的应用。

背景技术

番茄（

早熟番茄由于生长周期短，可以提早上市，有效缓解由于果蔬菜季节性生产而带来的需求问题，延长供应期，具有较好的销售前景和经济效益。同时由于生长周期变短，可相应减少病虫害对果实的侵袭，提高产品的质量。因此找寻一种可以促进番茄早熟的转录因子对于未来提高番茄的经济效益和产品质量具有重要的意义。

AP2/ERF转录因子作为植物体内最大的转录因子家族之一，曾被人们认为是植物界特有的一类转录因子，具有重要的调节功能。AP2/ERF转录因子可以通过响应乙烯信号参与果实的发育过程、调控果实的颜色及风味变化等调控果实成熟；可以通过某些激素信号通路参与病虫害信号的传导，促进相应抗性基因的表达。鉴于该类转录因子的重要调控功能，在番茄中寻找新的ERF转录因子仍然是园艺领域的重要任务。

在水稻中过表达AP2/ERF家族转录因子OsRPH1导致水稻株高、节间和叶鞘长度降低，表明该转录因子负调控植株的生长。玉米AP2基因sid1和ids1可以对花序分生组织和小穗分生组织进行调控（Chunk G,Meeley R,Hake S.2008,Development,135(18):3013-3019）。在植物体中，作为生物反应原料以及提供反应环境的水分，在平衡条件之下参与多种生理调节过程，如光合作用、蒸腾以及呼吸作用等，因此水分平衡对植物生长起着至关重要的作用，若发生水分胁迫，将严格限制植物的生长。有研究表明，AP2/ERF转录因子在抵抗水分胁迫中发挥重要调节作用，如ZmERE180可以增强不定根的形成和提高抗氧化剂的水平延长玉米在水分胁迫下的生长期（Yu F,Liang K,Fang T,et al.2019,Plant BiotechnolJ,17(12):2286-2298）。但是在番茄中对于AP2/ERF家族转录因子可以调控果实成熟衰老的研究还鲜有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种促进番茄果实成熟的基因及其方法。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种促进番茄果实成熟的基因，所述进番茄果实成熟的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种促进番茄果实成熟的方法，包括下列步骤：

步骤1：gRNA靶点接头引物的制备；

步骤2：gRNA表达盒构建：配制包含步骤1中靶点接头引物的酶切连接反应液，采用边切边连法使靶点接头与gRNA表达盒连接，扩展gRNA表达盒；

步骤3：以步骤2的产物为模板，进行第一轮PCR扩增；再以第一轮PCR产物为模板进行第二轮PCR扩增，利用琼脂糖凝胶电泳检测产物浓度，随后对第二轮PCR产物使用DNA纯化试剂盒进行纯化回收；

步骤4：采用边切边连的方法对步骤3的纯化产物与CRISPR-CAS9质粒进行连接，获得连接好的质粒；

步骤5：将步骤4连接好的质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；

步骤6：挑取步骤5获得的阳性单克隆菌落进行PCR鉴定，对所得的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，获得

步骤7：将

步骤8：将构建好的SlERF.D3-CRISPR-CAS9载体的农杆菌单菌落对番茄进行遗传转化。

优选的技术方案为：gRNA靶点引物接头的制备是先将靶点接头引物溶解成100µM的母液，再分别将靶点一正向引物-F1和R1引物和靶点一反向引物-R1混合稀释到1 µM得到第一混合引物，靶点二正向引物-F2和靶点二反向引物-R2混合稀释到1 µM得到第二混合引物；80-100℃ 30S，随后转移至室温冷却完成退火；

靶点接头引物的核苷酸序列如下：

靶点一正向引物-F1：5’-gtcaCAGCAGCAACCAAGGCTTAC-3’；

靶点一反向引物-R1：5’-aaacGTAAGCCTTGGTTGCTGCTG-3’；

靶点二正向引物-F2：5’-gtcaTTCTTCAGCGCCTGCTGCTG-3’；

靶点二反向引物-R2：5’-aaacCAGCAGCAGGCGCTGAAGAA-3’。

优选的技术方案为：步骤2中，

为确保

靶点接头与gRNA表达盒采用边切边连的方法，包括：

gRNA-U#质粒1 µL，第一混合引物0.5 µL，

gRNA-U#质粒1 µL，第二混合引物0.5 µL，

优选的技术方案为：步骤3中，

每个gRNA表达盒含2轮PCR反应，在第一轮轮PCR中，共含4个反应，反应总体系为50μL；

靶点一的反应一为：取1 μL第一连接产物为模板，2 µL U-F，2 µL 靶点一反向引物-R1，1 µL Super-Fidelity DNA Polymerase，10 µL 5×Super-Fidelity DNAPolymerase buffer，1 µL dNTPs，ddH

靶点一的反应二为：取1 μL第一连接产物为模板，2 µL gRNA-R，2 µL靶点一正向引物-F1，1 µL Super-Fidelity DNA Polymerase，10 µL 5×Super-Fidelity DNAPolymerase buffer，1 µL dNTPs，ddH

靶点二的反应一为：取1 μL第二连接产物为模板，2 µL U-F，2 µL 靶点二反向引物-R1，1 µL Super-Fidelity DNA Polymerase，10 µL 5×Super-Fidelity DNAPolymerase buffer，1 µL dNTPs，ddH

靶点二的反应二为：取1 μL第二连接产物为模板，2 µL gRNA-R，2 µL靶点二正向引物-F1，1 µL Super-Fidelity DNA Polymerase，10 µL 5×Super-Fidelity DNAPolymerase buffer，1 µL dNTPs，ddH

PCR程序设置为：95℃预变性1min，95℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸15s，25个循环；最后72℃延伸10min。扩增结束后取5 μl产物用2%琼脂糖胶电泳进行检测；

U-F：5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’；

gRNA-R：5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’；

进行第二轮PCR反应之前，预先将位置特异引物对混合成10×工作液，每种1.5 µM：引物组合工作液PT1=1.5 µL B1’+1.5 µL B2+7 µLddH

靶点一反应体系为：第一轮PCR扩增的第三连接产物和第四连接产物各1 µL，3 µL引物组合工作液PT1，0.6 µL的dNTPs，0.6 µL的Super-Fidelity DNA Polymerase，6 µL的5×Super-Fidelity DNA Polymerase buffer，17.8 µL的ddH

靶点二反应体系为：第一轮PCR扩增的第五连接产物和第六连接产物各1 µL，3 µL引物组合工作液PT

PCR反应条件为：95℃，1 min；95℃，10s，60℃，15s，72℃，15 s，18个循环；72℃，10min；4℃，∞；

B1’：5’-TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’；

B2：5’-AGCGTGGGTCTCGTCAGGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3；

B2’：5’-TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3；

BL：5’-AGCGTGGGTCTCGACCGACGCGTCCATCCACTCCAAGCTC-3。

优选的技术方案为：步骤4中，

使用边切边连的方法进行PCR反应；反应体系为：步骤3的纯化产物0.2µL，CRISPR-CAS9质粒1µL，

优选的技术方案为：步骤5中，取5µL连接好的质粒转入50µL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用手拨打离心管底部使其均匀，冰浴25min，42℃热激45s，冰浴2min；向其中加入350µL液体LB培养基，于37℃、200rmp的摇床中摇菌1 h；对培养得到的菌液进行6000rmp离心1min，留取100µL上清，将菌液吹吸混匀后涂布于含有卡那霉素的固体LB中，倒置于37℃培养箱过夜培养。

优选的技术方案为：步骤6中，鉴定体系为25µL：其中，步骤5获得的菌液2µL，SP-L/SP-R引物各1µL，2×Taq酶12.5µL，ddH

SP-L序列：GTCGTGCTCCACATGTTG；

SP-R序列：CCCGACATAGATGCAATAACTTC。

优选的技术方案为：步骤7中，取100 µL EHA105农杆菌感受态细胞，将其分为两管，在冰浴中待其融化，加入1µL

优选的技术方案为：步骤8中，将构建好的SlERF.D3-CRISPR-CAS9载体的农杆菌单菌落，溶于10µL无菌水中制成菌液，将菌液加入3 mL含Kana和Rif的液体LB培养基中，200rpm，28℃培养过夜，随后取400 µL于30 mL含Kana和Rif的液体LB培养基中，200 rpm，28℃震荡培养6-7 h，用分光光度计检测，直到菌液OD

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：

本发明从番茄中获得SlERF.D3基因的编码序列，设计了CRISPR-CAS9载体的引物，并构建了相应载体，借助农杆菌感受态细胞成功侵染番茄，获得了番茄的SlERF.D3-CRISPR-CAS9的基因编辑植株，发现与野生型番茄植株相比，SlERF.D3-CRISPR-CAS9植株的果实表现出明显的早熟现象，结果表明SlERF.D3基因可以调控番茄果实的成熟衰老进程。

附图说明

图1 为SlERF.D3基因编辑番茄植株的鉴定；A：erfd3测序结果；B：WT和erfd3序列峰图比较。

图2 野生型（WT）、

图3 野生型（WT）、

图4 野生型（WT）、

图5 野生型（WT）、

图6 野生型（WT）、

图7 野生型（WT）、

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

请参阅图1-7。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。

实施例1：一种促进番茄果实成熟的基因及其方法

一种促进番茄果实成熟的方法，包括如下步骤：

SlERF.D3 -CRISPR-CAS9缺失载体的构建

（1）获取SlERF.D3基因序列并设计gRNA靶点引物。

（2）gRNA靶点接头的制备。

（3）gRNA表达盒构建与连接：对gRNA载体酶切，采用边切边连法使靶点接头与gRNA表达盒连接，扩展gRNA表达盒。

（4）以上述步骤（3）的产物为模板，进行一轮PCR扩增。以一轮PCR产物为模板进行二轮PCR扩增，跑胶观察产物浓度。并对二轮PCR产物使用DNA纯化试剂盒进行纯化回收。

（5）采用边切边连的方法对gRNA表达盒与Cas9质粒连接。

（6）将步骤（5）连接好的的产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。

（7）挑取阳性单克隆菌株进行鉴定，对所得的产物进行琼脂糖凝胶检测。

（8）将SlERF.D3-CRISPR-CAS9质粒转化EHA105农杆菌感受态细胞。

（9）将含有SlERF.D3-CRISPR-CAS9质粒的农杆菌感受态细胞对番茄进行遗传转化。

优选的实施方式为：步骤（1）中，从NCBI数据库查得番茄SlERF.D3的基因序列，通过http://crispr.dbcls.jp/网址进行gRNA靶点引物设计，各设计两对靶点引物F1/F2，R1/R2，使其GC含量不低于50%，不高于70%，Tm值在55-70℃。

优选的实施方式为：步骤（2）中，将接头引物溶解成100 µM母液，并混合稀释到1 µM。约90℃ 30 S，随后转移至室温冷却完成退火，并检测浓度。

优选的实施方式为：步骤（3）中，为确保Bsal酶的活性，首先配制10µLBsal酶切反应液，含有5U Bsal酶切100ngRNA-U#载体，37℃，15min后进行琼脂糖凝胶电泳检查是否切出目标条带。gRNA载体酶切总反应体系为25µL，包括gRNA-U#质粒1µL，10U Bsa l，在PCR仪中反应20min，最后70℃，5min使酶失活。靶点接头与gRNA表达盒连接反应为：1µL 10x T4DNA ligase buffer，20 ng gRNA-U#质粒,0.5 µL靶点接头，ddH

优选的实施方式为：步骤（4）中，一轮PCR中包括两个反应，PCR体系共计50µL。反应一中含有1µL 连接产物，1µL引物U-F，1µL反向引物R，5µL dNTP，3µLMgSO4，1µL KOD酶，5µL10×KOD buffer，33µL ddH2O。反应二只是将引物对换成gRNA-R和正向引物F1，其他与反应一相同。PCR反应条件为：95℃预变性1min，95℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸14s，共35个循环，72℃后延伸10min，对产物跑琼脂糖凝胶电泳检测。

优选的实施方式为：步骤（5）中，使用边切边连的方法，进行PCR反应。反应体系为步骤（4）的纯化产物0.2µL，CRISPR-CAS9质粒1µL，BsaI 0.5µL，10xBsaI buffer 1.5µL，ddH2O 11.8µL，37 ℃酶切10min。加10x NEB T4DNA ligase buffer 0.4 µL, T4DNAligase 0.1µL。在PCR仪中设置37℃ 2 min，10℃ 3 min，20℃ 5min，13个循环，最后37℃ 2min。

优选的实施方式为：步骤（6）中，取5µL连接好的质粒转入50µL大肠杆菌DH5α大肠杆菌感受态细胞中，用手轻轻拨打离心管底部使其均匀，冰浴25min，42℃热激45s，冰浴2min。向其中加入350µL液体LB，于37℃、200rmp的摇床中摇菌1 h。对培养得到的菌液进行6000rmp离心1min，留取100µL上清，将菌液吹吸混匀后涂布于含有kana的固体LB中（每100mL加入µL），倒置于37℃培养箱过夜培养。

优选的实施方式为：步骤（7）中，鉴定体系为25µL，其中菌液2µL，SP-L/SP-R引物各1µL，2×Taq酶12.5µL，ddH2O 8.5µL。PCR仪中进行反应的条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸14s，共35个循环，72℃后延伸5min。PCR仪中进行反应的条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸3 s，共35个循环，72℃后延伸5min。待PCR反应结束后，取8µL样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，看电泳条带大小是否符合理论值，将条带正确的菌液转移至3mL含卡那霉素的液体LB中进行扩大培养，37℃、200rmp振荡培养16 h，使用质粒提取试剂盒提取质粒并跑琼脂糖凝胶电泳检测，将提取的质粒送往生工公司进一步测序；

SP-L序列：GTCGTGCTCCACATGTTG；

SP-R序列：CCCGACATAGATGCAATAACTTC。

优选的实施方式为：步骤（8）中，取100 μL 在-80℃保存的农杆菌感受态，将其分为两管，在冰浴中待其融化，加入2μL测序正确的质粒DNA，用手轻轻拨打离心管底部使其混匀，依次在冰上静置5 min、液氮5 min、37℃水浴5 min、冰浴5 min；加入700 μL无抗生素的LB液体培养基，于28℃振荡培养3 h；5000 rpm 离心5 min收菌，留取200 μL左右上清，吹吸混匀重悬菌体，涂布于LB-Kana/Rif固体LB培养基上，倒置于28℃培养箱培养2-3天。

优选的实施方式为：步骤（9）中，将构建好的SlERF.D3-CRISPR-CAS9载体的农杆菌单菌落，溶于10µL无菌水中制成菌液，将菌液加入3 mL含Kana和Rif的液体LB培养基中，200rpm，28℃培养过夜，随后取400 µL于30 mL含Kana和Rif的液体LB培养基中，200 rpm，28℃震荡培养6-7 h，用分光光度计检测菌液OD600为0.6-0.8。5000-6000 rpm室温离心5 min收集菌体，弃上清，用无菌水稀释菌体沉淀至OD600为0.1-0.15，现配现用。将番茄子叶和茎段黑暗预培养2 d后浸泡于稀释好的农杆菌侵染液中，震荡侵染5 min后倒掉侵染液，将子叶和茎段分别置于含不同植物激素的培养基上发芽、芽伸长、生根，将生根的外植体转移至营养土中进行后续测序鉴定，进而得到转化的番茄植株。随后通过设计靶点上下游引物，提取转基因番茄植株DNA，进行PCR扩增，并进行测序鉴定，分析SlERF.D3基因是否发生编辑。

实施例2：一种促进番茄果实成熟的基因及其方法

一种促进番茄果实成熟的基因，所述进番茄果实成熟的基因的核苷酸序列如SEQID No.1所示。

Seq No.1：

ATGCATTGGTTAAATAAAAGATTTAGACAAGAAGCAGGAATGAATTCGAATTCGAATTCCCTCCAAAATAACAATCAATTTCAACAGCAGCAACCAAGGCTTACTGGAGATGAAGAGTACTCTGTTATGGTTGCAACTCTGAAAAATGTGATCAATGGTAATATTCCAACGCAAAATTATCAAGAATTCAATGTCTTTTCGCCATATAATTATTCTACTGCCACCACAACCACGAATGTTACTTCTTCTTCTTCGCCTTCTACTAGTATGTCTACTAGTTTCGAACAAGTATTGGGTGTCTCTGCTGAACAAGAACCTTGTCAATTTTGCAGAATTCAAGGTTGTTTAGGCTGTGACATTTTTGGTACCACATTTTCTTCTTCTTCTTCAGCGCCTGCTGCTGTGGCTGCTCCTGTTGCTGATAATAAGAAGAAGAGTAGTAGTAGTAGTACAGCTACAGTCGCAATCGCGAAGAAAAAGAAGAAGAATTACAGAGGAGTGAGACAGAGGCCATGGGGGAAATGGGCAGCAGAAATTCGTGATCCTCGAAAAGCTGCACGTGTTTGGCTGGGAACTTTCACTACGGCAGAAGAAGCAGCTAGAGCTTATGATAAAGCCGCCATTGAATTCAGGGGTCCACGAGCTAAATTGAATTTTTCATTTGCGGATTATACCGTTGACACTCAAGAACAACAGAGCACTTTATCTTCTTCACCACAACAATTACCAGAAGAGCCTCAGCAATCCCAGACAGCGAATAATAATTCCGATTATGGAAATGAAATTTGGGATCAATTGATGGGTGACAATGAAATTCAAGATTGGTTGACCATGATGAATTTCAATGGCGACTCTTCTGATTCTGGCGGGAATGTTCACAGCTTTTAA。

一种促进番茄果实成熟的方法，包括下列步骤：

步骤1：gRNA靶点接头引物的制备；

步骤2：gRNA表达盒构建：配制包含步骤1中靶点接头引物的酶切连接反应液，采用边切边连法使靶点接头与gRNA表达盒连接，扩展gRNA表达盒；

步骤3：以步骤2的产物为模板，进行第一轮PCR扩增；再以第一轮PCR产物为模板进行第二轮PCR扩增，利用琼脂糖凝胶电泳检测产物浓度，随后对第二轮PCR产物使用DNA纯化试剂盒进行纯化回收；

步骤4：采用边切边连的方法对步骤3的纯化产物与CRISPR-CAS9质粒进行连接，获得连接好的质粒；

步骤5：将步骤4连接好的质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；

步骤6：挑取步骤5获得的阳性单克隆菌落进行PCR鉴定，对所得的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，获得

步骤7：将

步骤8：将构建好的SlERF.D3-CRISPR-CAS9载体的农杆菌单菌落对番茄进行遗传转化。

优选的实施方式为：gRNA靶点引物接头的制备是先将靶点接头引物溶解成100µM的母液，再分别将靶点一正向引物-F1和R1引物和靶点一反向引物-R1混合稀释到1 µM得到第一混合引物，靶点二正向引物-F2和靶点二反向引物-R2混合稀释到1 µM得到第二混合引物；80-100℃ 30S，随后转移至室温冷却完成退火；

靶点接头引物的核苷酸序列如下：

靶点一正向引物-F1：5’-gtcaCAGCAGCAACCAAGGCTTAC-3’；

靶点一反向引物-R1：5’-aaacGTAAGCCTTGGTTGCTGCTG-3’；

靶点二正向引物-F2：5’-gtcaTTCTTCAGCGCCTGCTGCTG-3’；

靶点二反向引物-R2：5’-aaacCAGCAGCAGGCGCTGAAGAA-3’。

优选的实施方式为：步骤2中，

为确保

靶点接头与gRNA表达盒采用边切边连的方法，包括：

gRNA-U#质粒1 µL，第一混合引物0.5 µL，

gRNA-U#质粒1 µL，第二混合引物0.5 µL，

优选的实施方式为：步骤3中，

每个gRNA表达盒含2轮PCR反应，在第一轮轮PCR中，共含4个反应，反应总体系为50μL；

靶点一的反应一为：取1 μL第一连接产物为模板，2 µL U-F，2 µL 靶点一反向引物-R1，1 µL Super-Fidelity DNA Polymerase，10 µL 5×Super-Fidelity DNAPolymerase buffer，1 µL dNTPs，ddH

靶点一的反应二为：取1 μL第一连接产物为模板，2 µL gRNA-R，2 µL靶点一正向引物-F1，1 µL Super-Fidelity DNA Polymerase，10 µL 5×Super-Fidelity DNAPolymerase buffer，1 µL dNTPs，ddH

靶点二的反应一为：取1 μL第二连接产物为模板，2 µL U-F，2 µL 靶点二反向引物-R1，1 µL Super-Fidelity DNA Polymerase，10 µL 5×Super-Fidelity DNAPolymerase buffer，1 µL dNTPs，ddH

靶点二的反应二为：取1 μL第二连接产物为模板，2 µL gRNA-R，2 µL靶点二正向引物-F1，1 µL Super-Fidelity DNA Polymerase，10 µL 5×Super-Fidelity DNAPolymerase buffer，1 µL dNTPs，ddH

PCR程序设置为：95℃预变性1min，95℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸15s，25个循环；最后72℃延伸10min。扩增结束后取5 μl产物用2%琼脂糖胶电泳进行检测；

U-F：5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’；

gRNA-R：5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’；

进行第二轮PCR反应之前，预先将位置特异引物对混合成10×工作液，每种1.5 µM：引物组合工作液PT1=1.5 µL B1’+1.5 µL B2+7 µLddH

靶点一反应体系为：第一轮PCR扩增的第三连接产物和第四连接产物各1 µL，3 µL引物组合工作液PT1，0.6 µL的dNTPs，0.6 µL的Super-Fidelity DNA Polymerase，6 µL的5×Super-Fidelity DNA Polymerase buffer，17.8 µL的ddH

靶点二反应体系为：第一轮PCR扩增的第五连接产物和第六连接产物各1 µL，3 µL引物组合工作液PT

PCR反应条件为：95℃，1 min；95℃，10s，60℃，15s，72℃，15 s，18个循环；72℃，10min；4℃，∞；

B1’：5’-TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’；

B2：5’-AGCGTGGGTCTCGTCAGGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3；

B2’：5’-TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3；

BL：5’-AGCGTGGGTCTCGACCGACGCGTCCATCCACTCCAAGCTC-3。

优选的实施方式为：步骤4中，

使用边切边连的方法进行PCR反应；反应体系为：步骤3的纯化产物0.2µL，CRISPR-CAS9质粒1µL，

优选的实施方式为：步骤5中，取5µL连接好的质粒转入50µL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用手拨打离心管底部使其均匀，冰浴25min，42℃热激45s，冰浴2min；向其中加入350µL液体LB培养基，于37℃、200rmp的摇床中摇菌1 h；对培养得到的菌液进行6000rmp离心1min，留取100µL上清，将菌液吹吸混匀后涂布于含有卡那霉素的固体LB中，倒置于37℃培养箱过夜培养。

优选的实施方式为：步骤6中，鉴定体系为25µL：其中，步骤5获得的菌液2µL，SP-L/SP-R引物各1µL，2×Taq酶12.5µL，ddH

优选的实施方式为：步骤7中，取100 µL EHA105农杆菌感受态细胞，将其分为两管，在冰浴中待其融化，加入1µL

优选的实施方式为：步骤8中，将构建好的SlERF.D3-CRISPR-CAS9载体的农杆菌单菌落，溶于10µL无菌水中制成菌液，将菌液加入3 mL含Kana和Rif的液体LB培养基中，200rpm，28℃培养过夜，随后取400 µL于30 mL含Kana和Rif的液体LB培养基中，200 rpm，28℃震荡培养6-7 h，用分光光度计检测，直到菌液OD

一：

通过CRISPR/CAS9技术和组织培养技术构建

二：

通过记录WT和

三：

在番茄的整个成熟进程中，

四：

为了揭示

以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。