与绵羊繁殖性状相关的分子标记、特异性引物及应用

技术领域

本发明涉及绵羊繁殖鉴定、育种领域，具体而言，涉及一种与绵羊繁殖性状相关的分子标记、特异性引物及应用。

背景技术

中国是养羊大国之一，羊肉营养丰富，容易消化，具有蛋白质含量高、胆固醇低等特点，深受消费者喜爱。皮山红羊是新疆地区新发现的绵羊品种，其性情温顺，耐粗饲，能很好地适应当地生态环境，高繁殖率是其养殖优势。BMPR1B(骨形态发生蛋白受体1B)位于绵羊6号染色体，是多种骨形态发生蛋白的膜受体，广泛存在于机体各组织中，主要在卵巢组织中表达。FecB是BMPR1B基因上的一个突变位点，对排卵有促进作用。

但是，目前还尚未有任何报道是关于FecB位点与绵羊繁殖性状相关的分子标记。

鉴于以上原因，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种与绵羊繁殖性状相关的分子标记、特异性引物及应用，旨在通过对BMPR1B基因进行测序分析，探讨其不同基因型与绵羊繁殖性状的关联性，旨在为提高绵羊高繁的遗传改良方面提供理论基础，加快培育出高繁殖力的优质肉羊新品种，缩短培育进程。

本发明的第二目的在于提供一种包括上述特异性引物组合的试剂盒，该试剂盒使用方便，可以通过相应的检测方法提炼出试剂。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明提供了一种与绵羊繁殖性状相关的分子标记，所述分子标记位于皮山红羊的第6号染色体上的BMPR1B基因第29382188位碱基FecB位点，该位点为T/C多态性位点。

在NCBI上公布的绵羊BMPR1B基因mRNA序列，给序列基因号为：NM_001009431.1，序列如SEQ ID NO.4所示。

其中，SEQ ID NO.4:

本发明还提供了用于检测上述分子标记的特异性引物组，由上游引物、下游引物以及延伸引物组成，所述上游引物具有SEQ ID No.1所示碱基序列，所述下游引物具有SEQID No.2所示碱基序列，所述延伸引物具有SEQ ID No.3所示碱基序列。

其核苷酸序列为：

SEQ ID NO.1:ACGTTGGATGCCAAGATGTTTTCATGCCTC；

SEQ ID NO.2:ACGTTGGATGTTCTTCACTACAGAGGAGGC；

SEQ ID NO.3:CCTCATCAACACCGTC。

通常说来，每增加一个核苷酸引物特异性会提高4倍，这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。

一般引物的序列中，G+C含量一般为40％-60％，一对引物的GC含量和Tm值应该协调。本发明的引物组合中的引物G+C含量均控制在适宜的范围内，且碱基分布随机，因而具有适中的解链温度，便于扩增。

总之，本发明的引物组合特异性好，扩增效率高，可以很好的应用于检测与绵羊繁殖性状相关的分子标记。通过过利用上述的引物组对绵羊的基因组DNA中进行扩增和检测，确定待测样品的BMPR1B基因的基因型，从而可以从中选育出产多羔的绵羊品种。

本发明还提供了一种筛选多产的绵羊的方法，具体包括如下步骤：

提取待检样本的DNA作为模板，用引物组合对绵羊BMPR1B基因进行PCR扩增，扩增反应结束后将PCR扩增产物进行分析，判断扩增产物中的FecB位点的具体基因型，选择基因型为CC或CT的个体作为种羊进行繁殖。因为CC型产羔数均极显著高于CT型，CT型又极显著高于TT型。说明该位点可用做产羔数的辅助标记，说明FecB位点可用用本研究皮山红羊群体多羔性状的选育。

优选地，上述筛选多产的绵羊方法中，PCR扩增反应程序为：94℃预变性120s，94℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸60s，48个循环，72℃延伸180s。

随着反应的逐渐进行，酶会逐渐失活，dNTP等原料会逐渐消耗掉，此外有一些非特异产物的扩增也会相应增加。因此虽然随着反应循环数的增加，产物会增多，但循环次数依然不宜过多，因而本发明限定为48个循环。

本发明还包含有包括上述引物组合的的试剂盒，该试剂盒在绵羊群体多羔性状的筛选方面具有很好的应用。

总之，本发明通过对皮山红羊的BMPR1B基因进行PCR扩增和测序，发现在扩增片段的FecB位点存在一个T/C多态性位点，并通过检测376只皮山红羊多态性和建立的一般线性模型，确定了与绵羊繁殖性状相关的分子标记，该分子标记可以用于培育多产的绵羊，为绵羊繁殖性状的遗传改良提供了有效的基因工程手段，具有重大的实际应用价值，在辅助绵羊群体多羔性状的选育方面具有很好的应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明中用于作为分子标记的绵羊BMPR1B基因片段的凝胶电泳图；

图2为本发明中绵羊BMPR1B基因突变位点SNP分型结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下实施例所使用试剂及耗材为：DNA提取试剂盒、5×TBE Buffer、6×LoadingBuffer、D2000，北京天根生物公司；核酸染料，博迈德生物；琼脂糖，北京孚博生物科技有限公司；冰无水乙醇、75％无水乙醇，天津市鑫铂特化工有限公司。

以下实施例中所采用的仪器为：移液器，德国Eppendorf公司(单道可调移液器0.5-10ul；10-100ul；20-200ul；100-1000ul)；超微量分光光度计、NanoDrop2000，Themro公司；电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；DYY-6C型电泳仪、WD-9403F紫外分析仪，北京市六一仪器厂；涡旋混合器，江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司(QL 901型)；ABIveriti-384PCR仪，Applied Biosystems；高速低温离心机，德国Eppendorf公司；干燥箱、立式压力蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司；Galanz微波炉，格兰仕微波炉(广东格兰仕公司)；低温冰箱、冰柜，广东美的制冷设备有限公司；DK-8D数显恒温水浴锅，江苏金怡仪器科技公司。

本实施例中选用的所有试剂、仪器、材料都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例1BMPR1B基因的扩增

(1)引物设计

以绵羊BMPR1B基因DNA(GenBank收录号：Oar_v3.1)为模板，利用MassARRAY AssayDesign 3.1软件设计一对引物，引物序列如下：

上游引物:ACGTTGGATGCCAAGATGTTTTCATGCCTC

下游引物:ACGTTGGATGTTCTTCACTACAGAGGAGGC

(2)BMPR1B基因的扩增和测序

提取绵羊耳组织的基因组DNA作为DNA模板进行PCR扩增，具体扩增、延伸反应体系如下表1-6所示。

表1PCR反应体系

表2PCR反应体系循环参数

表3SAP消化反应体系

表4SAP消化反应体系循环参数

表5延伸反应体系

表6延伸反应条件

树脂纯化：将树脂铺平放置在孔板上，待其风干大于等于10min后，在各个孔中加入16ul水后离心。将样本在空中慢慢翻转，把它放在孔板上，再一起翻转，树脂落入孔中即可。用膜把板封好，用旋转器混合均匀。

上机检测：将9uL反应产物稀释3倍后，使用树脂进行脱盐；将脱盐处理后的样品点在样品靶上，使其自然结晶；进行质谱检测，收集检测出的基因型数据。

(3)DNA序列同源性检索鉴定

通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for BiotechnologyInformation，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic Local AlignmentSearch Tool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。检索结果表明所测序列与绵羊BMPR1B基因DNA(GenBank收录号：Oar_v3.1)的部分序列同源性达99％。

实施例2基因分型检测方法的建立

(1)引物序列设计

针对实施例1中扩增片段的T/C多态性位点设计引物对，从而用于该多态性位点的特异性检测，设计好的引物交给北京康普森农业科技有限公司合成，设计的引物对的核苷酸序列为：

正向引物：ACGTTGGATGCCAAGATGTTTTCATGCCTC

反向引物：ACGTTGGATGTTCTTCACTACAGAGGAGGC

(2)DNA质控

将提取基因组DNA中吸取5uL的DNA样，使用1％的琼脂糖电泳检测，提取结果如图1所示。DNA电泳条带完整清晰，无前后拖尾现象，表明无降解和RNA污染，Nano drop 2000检测浓度发现，OD260/280值为1.8-2.0左右，无蛋白质或酚类等污染，试验所提DNA完整且纯度较高可用于后续目的基因的扩增。

(3)基因分型

利用飞行质谱技术对提取合格DNA的376个份皮山红羊样本的28个SNPs进行基因型分型，通过质谱软件统计分析得到分型结果，具体见图2所示。

(4)本发明的分子标记在绵羊繁殖性状关联分析中的应用

使用SPSS27.0一般线性模型对本研究中的皮山红羊群体产羔数与基因型的关联性分析，模型构建如下：

Y＝μ+G+e；

其中：Y为产羔数记录值；μ为群体平均值；G为基因型效应，e为随机残差效应，假设e相互独立，服从N(0，σ2)分布。

表7BMPR1B基因1个位点各基因型产羔数的关联分析

注：同列数据中肩标小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，肩标大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)，肩标字母相同或无肩标表示差异不显著(P>0.05)。

产羔数关联分析表明，该位点各基因型之间产羔数差异极显著(P<0.01)，CC型产羔数均极显著高于CT型(P<0.01)，CT型又极显著高于TT型(P<0.01)。说明该位点可用做产羔数的辅助标记，说明FecB位点可用用本研究皮山红羊群体多羔性状的选育。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。