一种高效降解木质纤维素的菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体地说是涉及一种高效降解木质纤维素的菌株及其应用。

背景技术

植物生物质中含有丰富的有机质，主要由纤维素(30％-50％)、半纤维素(20％-40％)和木质素(10％-30％)组成，是植物通过光合作用产生的次生代谢产物。木质纤维素的物理化学结构复杂多样，其中纤维素分子排列规则紧密，是植物细胞壁的主要结构；半纤维素是戊糖和己糖等单糖构成的多聚体；木质素是含氧代苯丙醇及其衍生物构成的芳香高聚物。这些成分通过氢键以及共价键相互纠缠连接，形成了复杂致密的天然网络结构，是抵抗酶攻击的天然屏障。

甘蔗渣生物质的主要成分是木质纤维素，是一种可再生的、丰富的资源，适合生产生物燃料和化学品等生物基产品，不仅可以作为传统石油基燃料的理想替代品，也是未来生物炼制概念的支柱。甘蔗渣资源除了极少部分用于生物炼制和制浆造纸外，主要还是被用作甘蔗制糖厂和生物乙醇厂的燃料以产生热量和电力，使用附加值低且易造成二次污染，有必要开发新的途径实现对甘蔗渣的废物利用。生物法酶解木质纤维素是一种高效环保的技术，该方法具有条件温和、能耗低、化学添加剂少等诸多优势。因此发掘与功能调控分解和转化木质纤维素的微生物资源，针对性地驱使微生物发挥专一功能利用木质纤维素，是资源化利用植物生物质的关键。

在之前的研究中，Jian Pang等(2017)在牛瘤胃中分离出了一株可以降解纤维素的大肠杆菌ZH-4，ZH-4的内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的活性分别为5.31U/mL、9.13U/mL和7.27U/mL。Jinfei Mei等(2020)得到一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens SL-7)，该菌株具有很强的木质素降解性能，漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶酶活性最高分别为55.95U/L、258.57U/L和422.68U/L。Lei Wu等(2023)在土壤中筛选到Cellulomonas iranensis ZJW-6，ZJW-6的木聚糖酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶和内切葡聚糖酶活性分别为13.87U/mL、2.18U/mL、5.57U/mL、10U/mL和48.27U/mL。

当前研究所报道的菌株存在酶活性低、酶系不完全等问题，还需进一步筛选木质纤维素降解能力较强的菌株，为提高对木质纤维素类物质的利用提供理论基础与技术支持。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种高效降解木质纤维素的菌株及其应用，该菌株具有较强的产纤维素酶和木质降解酶的能力，能够有效降解甘蔗渣中的木质纤维素。

为实现上述目的，本发明采用了以下的技术方案：

本发明所述一种高效降解木质纤维素的菌株，所述菌株命名为Trichodermasp.LH-413，分类命名为木霉属Trichoderma sp.；该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2023749，保藏日期为2023年5月15日。

所述具有木质纤维素降解功能木霉菌的筛选方法，包括以下步骤：

(1)富集：取腐木样品置于样品瓶中振荡培养，取5mL悬液接种在100mL羧甲基纤维素钠液体培养基和碱性木质素液体培养基中，28℃，130rpm培养5天，使其富集；

(2)涂布培养：将富集培养的样品悬液进行梯度稀释，于羧甲基纤维素钠和碱性木质素固体培养基中进行涂布培养；

(3)分离纯化：根据培养后的菌株形态初步区分细菌和真菌，将真菌和细菌分别于PDA和LB固体培养基上进行分离纯化，挑选培养3天后的单个菌落，分别在PDA和LB固体培养基上进行划线纯化5-8次，直到获得纯培养；

(4)筛选：将纯化后的单菌株分别接种在羧甲基纤维素钠和碱性木质素固体培养基上，培养3天后，用1mg/mL刚果红溶液对羧甲基纤维素钠固体培养基的菌株染色约30min，之后倒掉染液，再用1mol/L的NaCI溶液脱色30min，分离出有透明圈出现的菌株，表明该菌株可能产生纤维素酶；取30mL95％(v/v)的乙醇溶液，加入0.5g愈创木酚，滴加至碱性木质素固体培养基上纯化后的菌落边缘，若滴定区显红褐色或浅红色，表示该菌株可产生漆酶；取0.1％联苯胺(v/v)和0.4％H

步骤(1)所述振荡培养条件是：28℃，180rpm震荡培养1h。

步骤(2)所述涂布培养按以下方法进行：将富集培养的样品悬液，梯度稀释成10

所述的木质纤维素降解菌在发酵产纤维素酶和/或木质素酶中的应用。

所述纤维素酶和/或木质素酶包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、滤纸酶、漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶。

所述的木质纤维素降解菌在降解木质纤维素中的应用。

所述木质纤维素为甘蔗渣中的木质纤维素。

本发明获得的有益效果是：本发明所获得的木霉菌，通过酶活性测定，结果发现其内切葡聚糖酶活性为65.36U/mL、外切葡聚糖酶活性为1.75U/mL、β-葡萄糖苷酶活性为14.12U/mL、滤纸酶活性为28.04U/mL、漆酶活性为388.89U/L、木质素过氧化物酶活性为14247.31U/L、锰过氧化物酶的活性为9567.90U/L。通过与现有的研究相比，木霉菌明显优于现有技术中的菌株，其产木质纤维素降解酶的能力更强，可以在木质纤维素酶活力优化的进一步研究中发挥积极作用。其中纤维素酶中内切葡聚糖酶酶活力最高，木质素酶中木质素过氧化物酶活力最高。此外木霉菌的酶系较为完全，生长势好，具备与其他菌株配制成复合菌剂的良好基础条件，在发酵工业具有重大的应用前景。

附图说明

图1是所述的木霉菌的形态特征。

图2是所述的木霉菌滤纸条崩解试验与对照组对比结果图。

图3是所述木霉菌的PCR产物电泳图。

图4是所述木霉菌的系统发育树图。

图5为所述木霉菌纤维素相关酶活图。

图6为所述木霉菌木质素相关酶活图。

图7是所述木霉菌的滤纸失重率图。

图8是所述木霉菌甘蔗渣降解率图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例是本发明所述菌株的筛选、鉴定实施例。

本实施例使用到的培养基，按以下方法制备。羧甲基纤维素钠培养基：CMC-Na10g，(NH

(1)富集：取腐木样品置于样品瓶中振荡培养，取5mL悬液接种在100mL羧甲基纤维素钠液体培养基和碱性木质素液体培养基中，28℃，130rpm培养5天，使其富集。

样品采集自广西大学常年堆积的腐木上。将木屑样品置于250mL加有玻璃珠的无菌锥形瓶中，摇床中28℃，180rpm震荡培养1h。取5mL悬液接种在100mL羧甲基纤维素钠液体培养基和碱性木质素液体培养基中，28℃，130rpm培养5天，使其富集。

(2)涂布培养：将富集培养的样品悬液进行梯度稀释，于羧甲基纤维素钠和碱性木质素固体培养基中进行涂布培养。

将富集培养的样品悬液，梯度稀释成10

(3)分离纯化：根据培养后的菌株形态初步区分细菌和真菌，将真菌和细菌分别于PDA和LB固体培养基上进行分离纯化。挑选培养3天后的单个菌落，分别在PDA和LB固体培养基上进行划线纯化6次，获得纯培养的单菌株。

(4)筛选：将纯化后的菌株分别接种在羧甲基纤维素钠和碱性木质素固体培养基上，培养3天后，用1mg/mL刚果红溶液对羧甲基纤维素钠固体培养基的菌株染色约30min，之后倒掉染液，再用1mol/L的NaCI溶液脱色30min，分离出有透明圈出现的菌株，表明该菌株可能产生纤维素酶；取30mL 95％(v/v)的乙醇溶液，加入0.5g愈创木酚，滴加至碱性木质素固体培养基上纯化后的菌落边缘，若滴定区显红褐色或浅红色，表示该菌株可产生漆酶；取0.1％联苯胺(v/v)和0.4％H

实施例2

本实施例是对菌株LH-413进行分子生物学鉴定的实施例。

将菌株LH-413在马铃薯葡萄糖肉汤培养基中震荡培养3天，离心得到菌丝体，使用Ezup柱式真菌基因组DNA抽取试剂盒提取LH-413的基因组DNA，进行PCR扩增、测序。将菌株LH-413的测序结果在NCBI数据库中进行Blast比对，选择序列相似性较高的菌株，用MEGA11构建系统发育树。结果证实：菌株LH-413是木霉菌Trichoderma sp.，将其命名Trichodermasp.LH-413。

实施例3

本实施例是将菌株LH-413进行发酵产酶特性实验的实施例。

Trichoderma sp.LH-413木质纤维素相关酶活性的测定

本实施例使用到的培养基，按以下方法制备。发酵产酶培养基：甘蔗渣5g、(NH

将Trichoderma sp.LH-413摇床震荡培养制成菌悬液，以5％的量接种到发酵产酶培养基，于28℃、180rpm条件下震荡培养5天，取5mL发酵液在4℃，6000r/min离心10min，上清液即为粗酶液。

A、内切葡聚糖酶活性测定：通过DNS(3,5-dinitrosalicylic acid)比色法测定水解过程中释放的还原糖量，计算得到纤维素酶活性。以1.0mL 1％羧甲基纤维素钠为基质，加入适当稀释的0.5mL酶液，混匀，将混合物在50℃下孵育30min后取出试管，立即加入3mLDNS显色剂并混合，停止酶反应。将处理过的样品煮沸10min，在水中冷却以保持颜色稳定，使用灭活的酶液做空白，用紫外分光光度计在540nm测量吸光值，每个试验样品做3次平行。

B、外切葡聚糖酶活性测定：通过DNS(3,5-dinitrosalicylic acid)比色法测定水解过程中释放的还原糖量，计算得到纤维素酶活性。以50mg脱脂棉为基质，加入适当稀释的酶液，混匀，将混合物在50℃下孵育30min后取出试管，立即加入3mL DNS显色剂并混合，停止酶反应。将处理过的样品煮沸10min，在水中冷却以保持颜色稳定，使用灭活的酶液做空白，用紫外分光光度计在540nm测量吸光值，每个试验样品做3次平行。

C、β-葡萄糖苷酶活性测定：通过DNS(3,5-dinitrosalicylic acid)比色法测定水解过程中释放的还原糖量，计算得到纤维素酶活性。以1％的水杨苷为基质，加入适当稀释的0.5mL酶液，混匀，将混合物在50℃下孵育30min后取出试管，立即加入3mL DNS显色剂并混合，停止酶反应。将处理过的样品煮沸10min，在水中冷却以保持颜色稳定，使用灭活的酶液做空白，用紫外分光光度计在540nm测量吸光值，每个试验样品做3次平行。

D、滤纸酶活性测定：通过DNS(3,5-dinitrosalicylic acid)比色法测定水解过程中释放的还原糖量，计算得到纤维素酶活性。以50mg无淀粉滤纸为基质，加入适当稀释的酶液，混匀，将混合物在50℃下孵育30min后取出试管，立即加入3mL DNS显色剂并混合，停止酶反应。将处理过的样品煮沸10min，在水中冷却以保持颜色稳定，使用灭活的酶液做空白，用紫外分光光度计在540nm测量吸光值，每个试验样品做3次平行。

E、漆酶活性测定：以0.5mL 0.5mol/L的ABTS作为底物，加入2mL pH为5.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，加入1mL粗酶液在25℃下启动反应，在420nm下测量吸光值，进而计算漆酶酶活性。其中，漆酶催化ABTS形成的产物在420nm的摩尔吸光系数为36000mol

F、木质素过氧化物酶活性测定：依次加入0.1mol/L的酒石酸缓冲液(pH3.0)1.5mL；10mmol/L藜芦醇1.0mL；粗酶液0.4mL；添加0.1mL，10mmol/L的H

G、锰过氧化物酶活性测定：依次加入0.05mol/L琥珀酸缓冲液(PH 4.5)2.0mL；15mmol/L MnSO

酶活性测试结果证实本发明的Trichoderma sp.LH-413木质纤维素相关酶系完全，在28℃条件下培养能分泌纤维素酶和木质素相关酶。Trichodermasp.LH-413的内切葡聚糖酶活性为65.36U/mL、外切葡聚糖酶活性为1.75U/mL、β-葡萄糖苷酶活性为14.12U/mL、滤纸酶活性为28.04U/mL、漆酶活性为388.89U/L、木质素过氧化物酶活性为14247.31U/L、锰过氧化物酶的活性为9567.90U/L。

实施例4

Trichoderma sp.LH-413在滤纸和甘蔗渣降解中的应用

1.液态发酵降解滤纸

首先处理滤纸中可能存在的淀粉，将滤纸用1％稀醋酸浸泡一夜后，进行碘液检查，若淀粉已完全去除，则用2％苏打水冲洗至中性，恒重后于121℃灭菌20min后备用。利用干燥后恒重的滤纸作为酶解介质，将Trichoderma sp.LH-413接种到滤纸条培养基(滤纸条培养基：KH

滤纸失重率(％)＝[(恒重滤纸重量-恒重残余滤纸重量)/恒重滤纸重量]×100％

2.液态发酵降解甘蔗渣

将Trichoderma sp.LH-413接种到100mL的木质纤维素降解液体培养基(木质纤维素降解液体培养基：甘蔗渣10.0g/L、蛋白胨10.0g/L、牛肉膏5.0g/L、(NH

甘蔗渣降解率(％)＝[(恒重甘蔗渣重量-恒重残余甘蔗渣重量)/恒重甘蔗渣重量]×100％

液态发酵降解试验发现本发明Trichoderma sp.LH-413的滤纸失重率为56％，甘蔗渣的降解率为40％。因此本发明所筛选的Trichoderma sp.LH-413具有高效降解木质纤维素的能力，在发酵工业具有重大的应用前景，为提高对木质纤维素类物质的利用提供理论基础与技术支持。