外源性重组蛋白Adropin在制备治疗糖尿病心肌病药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体为外源性重组蛋白Adropin在制备治疗糖尿病心肌病药物中的应用。

背景技术

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是指发生于糖尿病(diabetesmellitus,DM)患者，除外冠状动脉粥样硬化性心脏病、肥厚型心肌病、高血压心脏病等疾病，以心室重构为特点，表现为心室收缩和(或)舒张功能障碍，最终进展为慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)的一种心肌疾病。每年因DM及其并发症所导致的死亡人数高达150～500万。其中，DCM是DM最重要的并发症之一，约半数以上的DM相关性致死或致残事件系由DCM所致。故而可见，DCM严重危害着人类健康，增加了全球医疗负担。因此，深入研究DCM的防治策略具有重要的临床价值和社会意义。

DCM的发病机制十分复杂。心室重构是DCM主要的结构性改变。在细胞层面上，心室重构表现在心肌细胞的减少和心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFbs)的增殖。DCM患者心肌细胞凋亡增加，心肌细胞数量减少，而CFbs明显增殖，心脏结构重构，导致心肌收缩力进行性下降。在分子层面上，心室重构的主要特点是心肌纤维化(myocardialfibrosis,MF)，表现为心肌组织结构中胶原浓度升高和(或)胶原成分发生改变。MF促使心室顺应性降低，心肌收缩不能发挥应有的射血效应，形成恶性循环。因此，减少心肌细胞凋亡，抑制CFbs增殖，从而减轻MF，有望成为DCM良好的治疗策略。

凋亡是指基因调控的细胞程序性死亡，维持着组织、器官正常功能的运转。研究发现，高糖环境可引起代谢异常、线粒体功能障碍、Ca

近年研究发现，Adropin与心血管疾病密切相关。Adropin是一种新型分泌蛋白，最初由Kumar等学者在研究下丘脑性肥胖的大鼠肝脏基因表达中分离得到。Adropin由76个氨基酸组成，分子量为4.5kD，由能量平衡相关基因编码，是一种参与能量动态平衡的调节多肽。Adropin主要表达于心脏、肝脏及大脑等组织中，除此之外，冠状动脉和脐静脉也有表达。Adropin可调节脂质代谢和胰岛素抵抗，降低动脉粥样硬化的发生；还可通过激活RISK信号转导通路减轻心肌缺血/再灌注损伤。Adropin能够激活磷脂酰肌醇3-激酶-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶通路，增加Akt的磷酸化，加强内皮型一氧化氮合酶的表达，增加NO的合成，发挥内皮保护作用。在Adropin与线粒体的相关性方面，Adropin介导的GPR19信号转导依赖于p44/42MAPK途径，可通过诱导孤儿G蛋白偶联受体(oGPCRs)从而发挥调节心脏能量代谢的作用。此外，Adropin还能促进冠状动脉内皮细胞增殖和迁移，促进心脏微血管结构形成，从而发挥心脏保护作用。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了外源性重组蛋白Adropin在制备治疗DCM药物中的应用，通过使用外源性Adropin干预能够抑制心肌细胞凋亡、改善糖尿病大鼠心肌纤维化，为DCM药物的开发提供很好的参考价值。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：外源性重组蛋白Adropin在制备治疗DCM药物中的应用，具体包括以下步骤：

S1、实验对象和实验试剂的选取：实验对象选择8周龄雄性Wistar大鼠20只，体重200-220g，购于南京大学模型动物研究中心(SCXK[Su]2015-0001)。将大鼠单独饲养在室温下，以12h：12h的光照：黑暗周期饲养，自由进食和饮水，再分别选取Adropin试剂、培哚普利PER试剂、链脲佐菌素STZ试剂、蛋白抽提试剂盒、TUNEL试剂盒、Masson试剂盒、DAPI染液、Anti-ColI抗体、Anti-ColIII抗体、Anti-Bcl2抗体、Anti-Caspase-3抗体、Anti-Bax抗体；

S2、DCM大鼠模型的构建：按照60-80mg/kg剂量一次性腹腔注射0.5-1.5％链脲佐菌素STZ试剂破坏胰岛β细胞功能，链脲佐菌素STZ试剂注射后3天和1周后取大鼠尾静脉血检测大鼠空腹血糖，当两次血糖均≥16.7mmol/L，且大鼠出现多饮、多食或多尿现象时，则建立大鼠DCM模型；

S3、实验分组：按照体重进行编号，利用计算机进行随机分组，每组大鼠5只：正常对照组(CON)、DCM模型组(DCM)、Adropin组(ADR-treated group,ADR)和培哚普利组(PER-treated group,PER)；

S4、计算左心室重量LVW和体重指数BW的比值：称量大鼠体重指数BW后，采用断头法处死大鼠，立刻取出心脏，除去残血，剔除心房、大血管和心外膜脂肪组织，滤纸吸干，电子天平称取左心室重量LVW，计算左心室重量LVW和大鼠体重指数BW的比值，计算公式具体为：LVW/BW(mg/g)＝心室重量(mg)/体质量(g)，该指数可反映大鼠心室重构情况；

S5、Masson染色：利用Masson染色三色试剂盒，进行Masson染色评价大鼠心肌纤维化情况，将心脏组织石蜡切片置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡至水后，苏木素染色，清水冲洗至切片变蓝，丽春红、酸性品红染色4-6min，蒸馏水冲洗，1％磷钼酸溶液10min，苯胺蓝液复染10-20min，0.2％的冰醋酸水溶液冲洗5min，亮绿5min，0.2％的冰醋酸水溶液冲洗5min，然后梯度酒精脱水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明切片，中性树胶封片，Masson染色使心肌染成红色，而胶原纤维则被染成蓝色，得到发光试剂A；

S6、TUNEL染色：将制好的心脏组织石蜡切片置于电热恒温干燥箱中，60℃烘烤3小时，常规二甲苯脱蜡，下行梯度乙醇水化，蒸馏水洗，滴加20ug/ml不含DNase的蛋白酶K，孵育，PBS洗3次，每次3min，滴加3％ H

S7、Western blot检测胶原蛋白及凋亡相关蛋白的表达：用Western blot检测各组大鼠心肌组织胶原蛋白(Col I、Col III)和凋亡相关蛋白(Caspase-3、cleavedCaspase-3、Bcl-2、Bax)的蛋白表达水平，各组剪取约100mg心肌组织放入预冷的EP管内，按照BCA法蛋白含量检测试剂盒步骤稀释标准样品，制作标准曲线，测定所提取蛋白浓度，制作转膜“三明治”，去除气泡后开始恒压转膜，用TBS从下向上浸湿后移至含有封闭液，用TBST将膜上的残余液体洗干净，用封口机将膜置于自封袋中，封好三边后，加入用TBST稀释至适当浓度的一抗，封闭袋口，4℃过夜，将膜置于封闭袋中，加入适量适当浓度的二抗，封闭袋口，室温下孵育1h，等体积混合化学发光试剂A液和B液，将膜蛋白面向下与此混合液充分接触，用Tanon 6600发光成像工作站进行图像采集。

优选的，所述步骤S2中链脲佐菌素STZ试剂的pH＝4-5,使用柠檬酸钠缓冲液在4℃的温度下配制。

优选的，所述步骤S2中链脲佐菌素STZ试剂注射后3天和1周后取大鼠尾静脉血检测大鼠空腹血糖前需要先禁食7-9h。

优选的，所述步骤S3中各组大鼠干预措施如下：

T1、CON组：不进行建模操作，同期给予腹腔注射等量生理盐水，之后予以生理盐水(1ml/100g/d)腹腔注射，为期4周；

T2、DCM组：按照步骤S2操作方法建立大鼠DCM模型，之后予以生理盐水(1ml/100g/d)腹腔注射，为期4周；

T3、ADR组：按照步骤S2操作方法建立大鼠DCM模型，之后予以Adropin(5μg/100g/d)腹腔注射，为期4周；⑷PER组：

T4、按照步骤S2操作方法建立大鼠DCM模型，之后予以PER(200μg/100g/d)腹腔注射，为期4周。

优选的，所述步骤S7中封闭液为5％脱脂奶粉TBST溶液。

优选的，所述步骤S5中使用苏木素染色9-11min。

优选的，所述步骤S6中滴加20ug/ml不含DNase的蛋白酶K后，在温度为20-37℃的条件下孵育15-30分钟。

优选的，所述步骤S6中滴加DAPI后使用防猝灭剂封片。

(三)有益效果

本发明提供了外源性重组蛋白Adropin在制备治疗DCM药物中的应用。与现有技术相比具备以下有益效果：该外源性重组蛋白Adropin在制备治疗DCM药物中的应用，通过使用外源性Adropin干预能够抑制心肌细胞凋亡、改善糖尿病大鼠心肌纤维化，利用Adropin可调节脂质代谢和胰岛素抵抗，降低动脉粥样硬化的发生；还可通过激活RISK信号转导通路减轻心肌缺血/再灌注损伤。Adropin能够激活磷脂酰肌醇3-激酶-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶通路，增加Akt的磷酸化，加强内皮型一氧化氮合酶的表达，增加NO的合成，发挥内皮保护作用。在Adropin与线粒体的相关性方面，Adropin介导的GPR19信号转导依赖于p44/42MAPK途径，可通过诱导孤儿G蛋白偶联受体(oGPCRs)从而发挥调节心脏能量代谢的作用。此外，Adropin还能促进冠状动脉内皮细胞增殖和迁移，促进心脏微血管结构形成，从而发挥心脏保护作用，为DCM药物的开发提供很好的参考价值。

附图说明

图1为本发明实施例中ADR对DCM大鼠LVW/BW指数的影响示意图；

图2为本发明实施例中ADR对DCM大鼠心肌纤维化的影响示意图；

图3为本发明实施例中ADR对DCM大鼠心肌组织胶原蛋白表达的影响示意图；

图4为本发明实施例中ADR对DCM大鼠心肌细胞凋亡的影响示意图；

图5为本发明实施例中ADR对DCM大鼠心肌凋亡相关蛋白表达的影响示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-5，本发明实施例提供三种技术方案：外源性重组蛋白Adropin在制备治疗DCM药物中的应用，具体包括以下实施例：

实施例1

外源性重组蛋白Adropin在制备治疗糖尿病心肌病药物中的应用，具体包括以下步骤：

S1、实验对象和实验试剂的选取：实验对象选择8周龄雄性Wistar大鼠20只，体重210g，购于南京大学模型动物研究中心(SCXK[Su]2015-0001)。将大鼠单独饲养在室温下，以12h：12h的光照：黑暗周期饲养，自由进食和饮水，再分别选取Adropin试剂、培哚普利PER试剂、链脲佐菌素STZ试剂、蛋白抽提试剂盒、TUNEL试剂盒、Masson试剂盒、DAPI染液、Anti-ColI抗体、Anti-ColIII抗体、Anti-Bcl2抗体、Anti-Caspase-3抗体、Anti-Bax抗体；

本发明实施例中，Adropin购于南京肽业生物科技有限公司；培哚普利(perindopril,PER)购于施维雅(天津)制药有限公司；链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)购于美国Sigma公司；蛋白抽提试剂盒购自上海Sangon公司；PVDF膜(0.45μm)购于德国Millipore公司；TUNEL试剂盒、Masson试剂盒、DAPI染液购于南京KeyGEN生物公司；Anti-Col I抗体(ab6308)、Anti-Col III抗体(ab184993)、Anti-Bcl2抗体(ab196465)购自英国Abcam公司；Anti-Caspase-3抗体(9662)、Anti-Bax抗体(2772)购自美国CST公司。Westernblot系统(MINI-PTET,COMP SYS,10W,1.0MM，Bio-Rad公司)，Tanon 6600发光成像工作站(Tanon公司)，奥林巴斯倒置相差显微镜(日本奥林巴斯公司)。

S2、DCM大鼠模型的构建：按照70mg/kg剂量一次性腹腔注射1％链脲佐菌素STZ试剂破坏胰岛β细胞功能，链脲佐菌素STZ试剂注射后3天和1周后取大鼠尾静脉血检测大鼠空腹血糖，当两次血糖均≥16.7mmol/L，且大鼠出现多饮、多食或多尿现象，利用心脏彩超评估大鼠出现心室重构或心脏功能降低，建立DCM大鼠模型。链脲佐菌素STZ试剂的pH＝4.5,使用柠檬酸钠缓冲液在4℃的温度下配制，链脲佐菌素STZ试剂注射后3天和1周后取大鼠尾静脉血检测大鼠空腹血糖前需要先禁食8h；

S3、实验分组：按照体重进行编号，利用计算机进行随机分组，每组大鼠5只：正常对照组(CON)、DCM模型组(DCM)、Adropin组(ADR-treated group,ADR)和培哚普利组(PER-treated group,PER)，各组大鼠干预措施如下：

T1、CON组：不进行建模操作，同期给予腹腔注射等量生理盐水，之后予以生理盐水(1ml/100g/d)腹腔注射，为期4周；

T2、DCM组：按照步骤S2操作方法建立大鼠DCM模型，之后予以生理盐水(1ml/100g/d)腹腔注射，为期4周；

T3、ADR组：按照步骤S2操作方法建立大鼠DCM模型，之后予以Adropin(5μg/100g/d)腹腔注射，为期4周；⑷PER组：

T4、按照步骤S2操作方法建立大鼠DCM模型，之后予以PER(200μg/100g/d)腹腔注射，为期4周；

S4、计算左心室重量LVW和体重指数BW的比值：称量大鼠体重指数BW后，采用断头法处死大鼠，立刻取出心脏，除去残血，剔除心房、大血管和心外膜脂肪组织，滤纸吸干，电子天平称取左心室重量LVW，计算左心室重量LVW和大鼠体重指数BW的比值，计算公式具体为：LVW/BW(mg/g)＝心室重量(mg)/体质量(g)，该指数可反映大鼠心室重构情况；

S5、Masson染色：利用Masson染色三色试剂盒，进行Masson染色评价大鼠心肌纤维化情况，将心脏组织石蜡切片置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡至水后，使用苏木素染色10min，清水冲洗至切片变蓝，丽春红、酸性品红染色5min，蒸馏水冲洗，1％磷钼酸溶液10min，苯胺蓝液复染15min，0.2％的冰醋酸水溶液冲洗5min，亮绿5min，0.2％的冰醋酸水溶液冲洗5min，然后梯度酒精脱水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明切片，中性树胶封片，Masson染色使心肌染成红色，而胶原纤维则被染成蓝色，得到发光试剂A；

S6、TUNEL染色：将制好的心脏组织石蜡切片置于电热恒温干燥箱中，60℃烘烤3小时，常规二甲苯脱蜡，下行梯度乙醇水化，蒸馏水洗，滴加20ug/ml不含DNase的蛋白酶K，在温度为29℃的条件下孵育22分钟，PBS洗3次，每次3min，滴加3％ H

S7、Western blot检测胶原蛋白及凋亡相关蛋白的表达：用Western blot检测各组大鼠心肌组织胶原蛋白(Col I、Col III)和凋亡相关蛋白(Caspase-3、cleavedCaspase-3、Bcl-2、Bax)的蛋白表达水平，各组剪取约100mg心肌组织放入预冷的EP管内，按照BCA法蛋白含量检测试剂盒步骤稀释标准样品，制作标准曲线，测定所提取蛋白浓度，制作转膜“三明治”，去除气泡后开始恒压转膜，用TBS从下向上浸湿后移至含有封闭液，封闭液为5％脱脂奶粉TBST溶液，用TBST将膜上的残余液体洗干净，用封口机将膜置于自封袋中，封好三边后，加入用TBST稀释至适当浓度的一抗，封闭袋口，4℃过夜，将膜置于封闭袋中，加入适量适当浓度的二抗，封闭袋口，室温下孵育1h，等体积混合化学发光试剂A液和B液，将膜蛋白面向下与此混合液充分接触，用Tanon 6600发光成像工作站进行图像采集。

实施例2

外源性重组蛋白Adropin在制备治疗糖尿病心肌病药物中的应用，具体包括以下步骤：

S1、实验对象和实验试剂的选取：实验对象选择8周龄雄性Wistar大鼠20只，体重200，购于南京大学模型动物研究中心(SCXK[Su]2015-0001)。将大鼠单独饲养在室温下，以12h：12h的光照：黑暗周期饲养，自由进食和饮水，再分别选取Adropin试剂、培哚普利PER试剂、链脲佐菌素STZ试剂、蛋白抽提试剂盒、TUNEL试剂盒、Masson试剂盒、DAPI染液、Anti-ColI抗体、Anti-ColIII抗体、Anti-Bcl2抗体、Anti-Caspase-3抗体、Anti-Bax抗体；

本发明实施例中，Adropin购于南京肽业生物科技有限公司；培哚普利(perindopril,PER)购于施维雅(天津)制药有限公司；链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)购于美国Sigma公司；蛋白抽提试剂盒购自上海Sangon公司；PVDF膜(0.45μm)购于德国Millipore公司；TUNEL试剂盒、Masson试剂盒、DAPI染液购于南京KeyGEN生物公司；Anti-Col I抗体(ab6308)、Anti-Col III抗体(ab184993)、Anti-Bcl2抗体(ab196465)购自英国Abcam公司；Anti-Caspase-3抗体(9662)、Anti-Bax抗体(2772)购自美国CST公司。Westernblot系统(MINI-PTET,COMP SYS,10W,1.0MM，Bio-Rad公司)，Tanon 6600发光成像工作站(Tanon公司)，奥林巴斯倒置相差显微镜(日本奥林巴斯公司)。

S2、DCM大鼠模型的构建：按照60mg/kg剂量一次性腹腔注射0.5％链脲佐菌素STZ试剂破坏胰岛β细胞功能，链脲佐菌素STZ试剂注射后3天和1周后取大鼠尾静脉血检测大鼠空腹血糖，当两次血糖均≥16.7mmol/L，且大鼠出现多饮、多食或多尿现象，利用心脏彩超评估大鼠出现心室重构或心脏功能降低，建立DCM大鼠模型。链脲佐菌素STZ试剂的pH＝4,使用柠檬酸钠缓冲液在4℃的温度下配制，链脲佐菌素STZ试剂注射后3天和1周后取大鼠尾静脉血检测大鼠空腹血糖前需要先禁食7h；

S3、实验分组：按照体重进行编号，利用计算机进行随机分组，每组大鼠5只：正常对照组(CON)、DCM模型组(DCM)、Adropin组(ADR-treated group,ADR)和培哚普利组(PER-treated group,PER)，各组大鼠干预措施如下：

T1、CON组：不进行建模操作，同期给予腹腔注射等量生理盐水，之后予以生理盐水(1ml/100g/d)腹腔注射，为期4周；

T2、DCM组：按照步骤S2操作方法建立大鼠DCM模型，之后予以生理盐水(1ml/100g/d)腹腔注射，为期4周；

T3、ADR组：按照步骤S2操作方法建立大鼠DCM模型，之后予以Adropin(5μg/100g/d)腹腔注射，为期4周；⑷PER组：

T4、按照步骤S2操作方法建立大鼠DCM模型，之后予以PER(200μg/100g/d)腹腔注射，为期4周；

S4、计算左心室重量LVW和体重指数BW的比值：称量大鼠体重指数BW后，采用断头法处死大鼠，立刻取出心脏，除去残血，剔除心房、大血管和心外膜脂肪组织，滤纸吸干，电子天平称取左心室重量LVW，计算左心室重量LVW和大鼠体重指数BW的比值，计算公式具体为：LVW/BW(mg/g)＝心室重量(mg)/体质量(g)，该指数可反映大鼠心室重构情况；

S5、Masson染色：利用Masson染色三色试剂盒，进行Masson染色评价大鼠心肌纤维化情况，将心脏组织石蜡切片置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡至水后，使用苏木素染色9min，清水冲洗至切片变蓝，丽春红、酸性品红染色4min，蒸馏水冲洗，1％磷钼酸溶液10min，苯胺蓝液复染10min，0.2％的冰醋酸水溶液冲洗5min，亮绿5min，0.2％的冰醋酸水溶液冲洗5min，然后梯度酒精脱水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明切片，中性树胶封片，Masson染色使心肌染成红色，而胶原纤维则被染成蓝色，得到发光试剂A；

S6、TUNEL染色：将制好的心脏组织石蜡切片置于电热恒温干燥箱中，60℃烘烤3小时，常规二甲苯脱蜡，下行梯度乙醇水化，蒸馏水洗，滴加20ug/ml不含DNase的蛋白酶K，在温度为20℃的条件下孵育15分钟，PBS洗3次，每次3min，滴加3％ H

S7、Western blot检测胶原蛋白及凋亡相关蛋白的表达：用Western blot检测各组大鼠心肌组织胶原蛋白(Col I、Col III)和凋亡相关蛋白(Caspase-3、cleavedCaspase-3、Bcl-2、Bax)的蛋白表达水平，各组剪取约100mg心肌组织放入预冷的EP管内，按照BCA法蛋白含量检测试剂盒步骤稀释标准样品，制作标准曲线，测定所提取蛋白浓度，制作转膜“三明治”，去除气泡后开始恒压转膜，用TBS从下向上浸湿后移至含有封闭液，封闭液为5％脱脂奶粉TBST溶液，用TBST将膜上的残余液体洗干净，用封口机将膜置于自封袋中，封好三边后，加入用TBST稀释至适当浓度的一抗，封闭袋口，4℃过夜，将膜置于封闭袋中，加入适量适当浓度的二抗，封闭袋口，室温下孵育1h，等体积混合化学发光试剂A液和B液，将膜蛋白面向下与此混合液充分接触，用Tanon 6600发光成像工作站进行图像采集。

实施例3

外源性重组蛋白Adropin在制备治疗糖尿病心肌病药物中的应用，具体包括以下步骤：

S1、实验对象和实验试剂的选取：实验对象选择8周龄雄性Wistar大鼠20只，体重220g，购于南京大学模型动物研究中心(SCXK[Su]2015-0001)。将大鼠单独饲养在室温下，以12h：12h的光照：黑暗周期饲养，自由进食和饮水，再分别选取Adropin试剂、培哚普利PER试剂、链脲佐菌素STZ试剂、蛋白抽提试剂盒、TUNEL试剂盒、Masson试剂盒、DAPI染液、Anti-ColI抗体、Anti-ColIII抗体、Anti-Bcl2抗体、Anti-Caspase-3抗体、Anti-Bax抗体；

本发明实施例中，Adropin购于南京肽业生物科技有限公司；培哚普利(perindopril,PER)购于施维雅(天津)制药有限公司；链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)购于美国Sigma公司；蛋白抽提试剂盒购自上海Sangon公司；PVDF膜(0.45μm)购于德国Millipore公司；TUNEL试剂盒、Masson试剂盒、DAPI染液购于南京KeyGEN生物公司；Anti-Col I抗体(ab6308)、Anti-Col III抗体(ab184993)、Anti-Bcl2抗体(ab196465)购自英国Abcam公司；Anti-Caspase-3抗体(9662)、Anti-Bax抗体(2772)购自美国CST公司。Westernblot系统(MINI-PTET,COMP SYS,10W,1.0MM，Bio-Rad公司)，Tanon 6600发光成像工作站(Tanon公司)，奥林巴斯倒置相差显微镜(日本奥林巴斯公司)。

S2、DCM大鼠模型的构建：按照80mg/kg剂量一次性腹腔注射1.5％链脲佐菌素STZ试剂破坏胰岛β细胞功能，链脲佐菌素STZ试剂注射后3天和1周后取大鼠尾静脉血检测大鼠空腹血糖，当两次血糖均≥16.7mmol/L，且大鼠出现多饮、多食或多尿现象，利用心脏彩超评估大鼠出现心室重构或心脏功能降低，建立DCM大鼠模型。链脲佐菌素STZ试剂的pH＝5,使用柠檬酸钠缓冲液在4℃的温度下配制，链脲佐菌素STZ试剂注射后3天和1周后取大鼠尾静脉血检测大鼠空腹血糖前需要先禁食9h；

S3、实验分组：按照体重进行编号，利用计算机进行随机分组，每组大鼠5只：正常对照组(CON)、DCM模型组(DCM)、Adropin组(ADR-treated group,ADR)和培哚普利组(PER-treated group,PER)，各组大鼠干预措施如下：

T1、CON组：不进行建模操作，同期给予腹腔注射等量生理盐水，之后予以生理盐水(1ml/100g/d)腹腔注射，为期4周；

T2、DCM组：按照步骤S2操作方法建立大鼠DCM模型，之后予以生理盐水(1ml/100g/d)腹腔注射，为期4周；

T3、ADR组：按照步骤S2操作方法建立大鼠DCM模型，之后予以Adropin(5μg/100g/d)腹腔注射，为期4周；⑷PER组：

T4、按照步骤S2操作方法建立大鼠DCM模型，之后予以PER(200μg/100g/d)腹腔注射，为期4周；

S4、计算左心室重量LVW和体重指数BW的比值：称量大鼠体重指数BW后，采用断头法处死大鼠，立刻取出心脏，除去残血，剔除心房、大血管和心外膜脂肪组织，滤纸吸干，电子天平称取左心室重量LVW，计算左心室重量LVW和大鼠体重指数BW的比值，计算公式具体为：LVW/BW(mg/g)＝心室重量(mg)/体质量(g)，该指数可反映大鼠心室重构情况；

S5、Masson染色：利用Masson染色三色试剂盒，进行Masson染色评价大鼠心肌纤维化情况，将心脏组织石蜡切片置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡至水后，使用苏木素染色11min，清水冲洗至切片变蓝，丽春红、酸性品红染色6min，蒸馏水冲洗，1％磷钼酸溶液10min，苯胺蓝液复染20min，0.2％的冰醋酸水溶液冲洗5min，亮绿5min，0.2％的冰醋酸水溶液冲洗5min，然后梯度酒精脱水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明切片，中性树胶封片，Masson染色使心肌染成红色，而胶原纤维则被染成蓝色，得到发光试剂A；

S6、TUNEL染色：将制好的心脏组织石蜡切片置于电热恒温干燥箱中，60℃烘烤3小时，常规二甲苯脱蜡，下行梯度乙醇水化，蒸馏水洗，滴加20ug/ml不含DNase的蛋白酶K，在温度为37℃的条件下孵育30分钟，PBS洗3次，每次3min，滴加3％ H

S7、Western blot检测胶原蛋白及凋亡相关蛋白的表达：用Western blot检测各组大鼠心肌组织胶原蛋白(Col I、Col III)和凋亡相关蛋白(Caspase-3、cleavedCaspase-3、Bcl-2、Bax)的蛋白表达水平，各组剪取约100mg心肌组织放入预冷的EP管内，按照BCA法蛋白含量检测试剂盒步骤稀释标准样品，制作标准曲线，测定所提取蛋白浓度，制作转膜“三明治”，去除气泡后开始恒压转膜，用TBS从下向上浸湿后移至含有封闭液，封闭液为5％脱脂奶粉TBST溶液，用TBST将膜上的残余液体洗干净，用封口机将膜置于自封袋中，封好三边后，加入用TBST稀释至适当浓度的一抗，封闭袋口，4℃过夜，将膜置于封闭袋中，加入适量适当浓度的二抗，封闭袋口，室温下孵育1h，等体积混合化学发光试剂A液和B液，将膜蛋白面向下与此混合液充分接触，用Tanon 6600发光成像工作站进行图像采集。

研究结果

ADR对DCM大鼠LVW/BW指数的影响：与CON组相比，DCM组LVW(543.26±19.44mgvs.849.05±58.91mg,P<0.001)、LVW/BW(1.62±0.11mg/gvs.2.93±0.06mg/g,P<0.001)指数显著升高；经ADR治疗后，LVW(668.71±85.86mg vs.849.05±58.91mg,P＝0.004)、LVW/BW(2.23±0.37mg/gvs.2.93±0.06mg/g,P＝0.005)指数较DCM大鼠明显降低，差异有统计学意义。与DCM组相比，PER组LVW(634.63±94.85mg vs.849.05±58.91mg,P＝0.001)、LVW/BW(1.98±0.42mg/g vs.2.93±0.06mg/g,P＝0.001)指数亦明显降低(图1)。

ADR对DCM大鼠心肌纤维化的影响：如图2所示，CON组大鼠心肌组织细胞排列整齐，可见少许胶原纤维均匀分布；DCM组大鼠心肌细胞排列紊乱，组织胶原纤维表达量增加；经ADR或PER治疗后，大鼠心肌组织胶原纤维表达量较DCM减少，纤维化程度减轻。

ADR对DCM大鼠心肌胶原蛋白I、III表达的影响：与CON组相比，DCM组I型(1.01±0.13vs.3.61±0.23,P<0.001)和III型胶原蛋白(1.03±0.15vs.3.00±0.30,P<0.001)表达显著增加；经ADR治疗后，I型(1.55±0.41vs.3.61±0.23,P<0.001)和III型胶原蛋白(1.71±0.06vs.3.00±0.30,P<0.001)表达量较DCM大鼠明显降低。与DCM组相比，PER组I型(1.37±0.15vs.3.61±0.23,P<0.001)和III型胶原蛋白(1.45±0.14vs.3.00±0.30,P<0.001)表达量亦明显降低，差异有统计学意义(图3)。

ADR对DCM大鼠心肌细胞凋亡的影响：用TUNEL法检测大鼠心肌细胞凋亡情况。结果发现，与CON组相比，DCM组TUNEL阳性心肌细胞比例明显增加(4.98±0.89％vs.37.64±1.84％,P<0.001)；与DCM组相比，ADR组(14.74±2.77％vs.37.64±1.84％,P<0.001)和PER组(13.84±2.06％vs.37.64±1.84％,P<0.001)TUNEL阳性心肌细胞比例均显著降低，差异有统计学意义(图4)。

ADR对DCM大鼠心肌凋亡相关蛋白表达的影响：与CON组相比，DCM组Bcl-2蛋白(1.00±0.11vs.0.34±0.10,P<0.001)表达量减少，而Bax(1.00±0.12vs.2.53±0.41,P<0.001)和Cleaved Caspase-3蛋白(1.00±0.11vs.2.03±0.11,P<0.001)表达量显著增加。与DCM组相比，ADR和PER组Bcl-2蛋白(0.84±0.09vs.0.34±0.10,P＝0.001；0.75±0.15vs.0.34±0.10,P＝0.002)表达量增加，且Bax(1.25±0.15vs.2.53±0.41,P<0.001；1.29±0.09vs.2.53±0.41,P<0.001)和Cleaved Caspase-3蛋白(1.44±0.05vs.2.03±0.11,P<0.001；1.22±0.20vs.2.03±0.11,P<0.001)表达量明显降低，差异有统计学意义(图5)。

同时本说明书中未作详细描述的内容均属于本领域技术人员公知的现有技术。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。