一株卷曲乳杆菌及其在预防或治疗女性阴道炎中的应用

技术领域

本发明涉及益生菌筛选与应用技术领域，具体涉及一株卷曲乳杆菌，其具有预防或治疗女性阴道炎的作用。

背景技术

阴道菌群对维护阴道内环境的稳定和调节发挥着不可替代的作用。阴道菌群非常复杂，除原虫、真菌外，尚包括很多需氧菌及厌氧菌，如乳链球菌、肠杆菌、变形杆菌、加夫基球菌、韦永球菌等细菌，这些微生物可分为共栖的及病理性的，都生长在这个共同的环境内，各微生物之间可能有拮抗作用。在pH3.8～4.2时，有利于共栖益生菌的繁殖，尤其是乳酸杆菌，这是健康阴道中的主要益生菌种，阴道液中的密度可达10

益生菌最早由俄国微生物学家在20世纪初发现，发展至今已有一个多世纪。在这一个多世纪中，益生菌的概念以及功效已经被科学家和消费者所认同。益生菌不仅能够在人体肠道或皮肤上形成优势菌群而且能够紧密结合在肠粘膜或皮肤上构成一道天然生物屏障，使得整个人体肠道或皮肤处在“健康”状态。益生菌主要是通过细菌拮抗粘附或者产生抗菌肽等方式来调节肠道健康与身体健康。阴道中乳酸杆菌类型较为复杂，至今报道的阴道乳酸杆菌大约有25种，以卷曲乳酸杆菌、格氏乳酸杆菌、惰性乳酸杆菌、詹氏乳酸杆菌为优势菌居多。体外研究表明，从健康妇女阴道分离出来的乳杆菌可以抑制阴道加德纳氏菌的黏附，甚至能够代替已经黏附于阴道上皮的加德纳氏菌。KremLeva等研究发现，产H

发明内容

本发明的目的是提供一株卷曲乳杆菌（

本发明首先提供了一株卷曲乳杆菌（

所述的卷曲乳杆菌VHProbi E04株，其16s rDNA序列为SEQ ID NO:1。

所述的卷曲乳杆菌VHProbi E04株，其MALDI-TOF-MS蛋白质指纹图谱如图3所示；其rep-PCR指纹图谱如图4所示；其RAPD指纹图谱如图5所示。

本发明还提供了所述卷曲乳杆菌VHProbi E04株在制备抑菌剂中的应用。

本发明还提供了所述卷曲乳杆菌VHProbi E04株在制备用于预防或治疗由细菌或霉菌引发的阴道炎的药品中的应用。

所述细菌为加德纳氏菌或金黄色葡萄球菌。

所述霉菌为白色念珠菌。

本发明还提供了一种用于阴道炎症的组合物，包含所述卷曲乳杆菌VHProbi E04株的活菌、灭活菌体或其发酵产物。

所述组合物为非治疗性的阴道用健康产品，包括阴道保健用品、阴道清洁用品、阴道护理用品、阴道用化妆品及阴道卫生用品。

所述组合物为治疗性的阴道用健康产品，包括阴道用药品。

所述组合物为阴道用医疗器械。

本发明提供的卷曲乳杆菌VHProbi E04可以产抑菌物质H

本发明提供的卷曲乳杆菌VHProbi E04对常见抗生素敏感，生物安全性良好；能够耐受较高的盐度，最大耐受盐浓度为3%；能在45℃生长，具有一定的耐热性。该菌株具备较强的抗氧化功能，其中对DPPH和HRS自由基的清除率分别为24.28%±1.03%和24.19%±4.63%；其上清液、菌体和胞内提取物的抗脂质过氧化抑制率分别为39.18%±0.17%、10.71%±0.19%和15.40%±0.19%，效果显著。

本发明提供的卷曲乳杆菌VHProbi E04可制成抑菌剂、药物或是女性卫生产品，将有助于缓解细菌性阴道炎和霉菌性阴道的不适症状和保持女性阴道的健康。

附图说明

图1为卷曲乳杆菌VHProbi E04产过氧化氢图；

图2为卷曲乳杆菌VHProbi E04的菌落形态图；

图3为卷曲乳杆菌VHProbi E04的MALDI-TOF-MS蛋白质指纹图谱；

图4为卷曲乳杆菌VHProbi E04的rep-PCR指纹图谱；

图5为卷曲乳杆菌VHProbi E04的RAPD指纹图谱；

图6为卷曲乳杆菌VHProbi E04对人阴道上皮细胞的粘附图。

具体实施方式

实施例只是对本发明的说明，并不是对本发明保护范围的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1 卷曲乳杆菌VHProbi E04的分离筛选

1、乳酸菌的初筛

依据2019版《人类遗传资源库伦理规范》，与样本提供者签订项目承诺书和知情同意书后，按照生物样本库标准操作规范，搜集半年内未食用益生菌制剂的健康女性阴道分泌物；将分泌物进行系列稀释，取10

2、抗阴道加德纳氏菌株和产过氧化氢菌株复筛

（1）准备哥伦比亚血琼脂平板

提前准备好哥伦比亚血琼脂平板，晾干。

（2）阴道加德纳氏菌菌液制备

分别在哥伦比亚血琼脂平板上划线活化阴道加德纳氏菌BNCC337545和BNCC354890，然后挑取单菌落到改良BHI肉汤培养基（BHI加5%的血清）中，37℃有氧培养24h，然后按照1%的比例转接到新的改良BHI肉汤培养基中，37℃有氧培养24h，得到新鲜菌液，新鲜菌液按照1：1等体积混匀，即得到阴道加德纳氏菌菌液。

以下实施例中所述的阴道加德纳氏菌菌液均与本实施例相同。

采用两株不同的阴道加德纳氏菌作为指示菌株，更能体现筛选的乳酸菌对加德纳氏菌的抑菌能力。

（3）牛津杯抑菌实验

提前准备哥伦比亚血平板，然后取50μL阴道加氏乳杆菌液涂布到血平板上，放上牛津杯，在孔里分别加入100μL初筛乳酸杆菌的发酵菌液，37℃培养48h，观察有无抑菌圈。

结果显示，本发明初筛获得的18株乳酸杆菌中，E01、E04和E11菌株对加德纳氏菌有明显的抑制作用，其发酵液产生的抑菌圈直径分别是1.23±0.03cm，1.38±0.05cm和1.28±0.02cm。

3、产过氧化氢能力的测定

四甲基苯胺用乙醇配制成浓度0.1g/100mL，然后0.22μm滤膜过滤；辣根过氧化酶溶于水，配制成0.01g/100mL，0.22μm滤膜过滤。

在MRS培养基中加1%（w/v）葡萄糖，然后121℃高压灭菌，等降到50℃时，加入四甲基苯胺和辣根过氧化酶，得到四甲基苯胺终浓度为25mg/100mL、辣根过氧化酶终浓度为1mg/100mL的固体培养基。

然后分别将E01、E04和E11的新鲜菌液进行稀释，各取50μL涂布到上述固体培养基平板上，37℃培养48h, 观察是否产蓝色菌落。

结果如图1所示，E04菌落周边产蓝色菌落，即产过氧化氢，其他两株菌没有蓝色菌落产生。从而说明，E04菌株能产过氧化氢。

实施例2 卷曲乳杆菌VHProbi E04的鉴定

2.1 菌落形态鉴定

E04菌株的菌落形态如图2所示，单菌落半透明，无光泽，边缘不规则不平整，菌落直径在2-3mm，显微镜下菌体呈杆状。

2.2 生理生化特性鉴定

本实施例中接种液的准备如下：在无菌条件下，取适量新鲜菌液，5000rpm/min离心5min ，用PBS缓冲液洗2次，再用同体积PBS缓冲液重悬后稀释50倍，作为接种液。

1、温度生长范围实验

在无菌条件下，将接种液按10% 的接种量接种到10mL MRS液体培养基中，不接菌的10mL MRS液体培养基作为对照，分别置于15℃恒温振荡培养箱培养7天和45℃恒温振荡培养箱中培养2天，观察培养液是否变浑浊。

结果显示：15℃恒温培养7天后，培养基仍澄清；45℃恒温培养2天后，培养基变浑浊。从而说明，E04菌株在15℃条件下不能生长，在45℃条件下能正常生长。

2、碳源代谢实验

利用API 50CHL试剂条测定E04菌株对49种碳源的代谢作用。

在无菌条件下，取适量E04菌株的新鲜菌液，5000rpm离心5min，用pH7.0磷酸缓冲液洗涤2次，再用同体积缓冲液重悬后，制得菌悬液。将菌悬液按照10%的添加量加到API试剂盒的培养基中，然后按照试剂盒的操作，把培养基加到试纸条的孔里面，石蜡封口，然后把试纸条放到一个盒子里面，盒子底物加大约10mL的无菌去离子水，盖上盖子，放置到37℃培养箱中培养24-48h，观察颜色变化，若菌生长则颜色由蓝色变成黄色，不生长颜色维持不变。记录试验结果，上传到鉴定软件API web。

结果显示，E04菌株能利用半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺、黄柏素、七叶苷、水杨苷、纤维二糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉；不能利用甘油、甘露糖醇、山梨糖醇、海藻糖和D-阿拉伯糖醇；赤藓糖醇、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、L-木糖、核糖、D-侧金盏花醇、β-甲基-D-木糖苷、山梨糖、α-甲基-D-葡萄糖苷、卫矛醇、苦杏仁苷、鼠李糖、肌醇、α-甲基-甘露糖苷、乳糖、蜜二糖、糖原、木糖醇、D-来苏糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、菊粉、松三糖、龙胆二糖、土伦糖、D-塔格糖、葡萄糖酸盐、L-阿拉伯糖醇、2-酮葡萄糖酸盐和5-酮葡糖酸盐。

API鉴定结果：E04菌株为卷曲乳杆菌，ID=99.6%，T值=0.87。

3、葡萄糖产酸产气试验

本实施例中所用的培养基配方如下：

蛋白胨 0.5g；酵母提取物 0.3g；吐温80 0.1mL；盐溶液A 0.5mL；盐溶液B 0.5mL；乙酸钠 0.5g；葡萄糖 2.5g；2%溴甲酚绿（w/v） 0.05mL；蒸馏水100mL；pH6.8～7.0。

将配制好的培养基分装至含有倒置小试管的大试管中，3mL/管，121℃，高压灭菌15min。

盐溶液A成分：KH

盐溶液B成分：MgSO

在无菌条件下，将菌悬液按10%的接种量接种培养基，不接菌的培养基作为对照，然后用2mL无菌液体石蜡封住顶部，置于37℃培养。连续培养6d，每天观察培养基颜色有无变化。

结果显示：37℃培养6d后，培养基由绿色变为黄色，小倒管内无气体，说明E04菌株发酵葡萄糖产酸，不产气。

综上所述，E04菌株的生理生化鉴定结果如下：在15℃条件下不能生长，在45℃条件下能正常生长；发酵葡萄糖产酸，不产气；碳源代谢鉴定为卷曲乳杆菌。

2.3 分子生物学鉴定

挑取平板上E04菌株的单菌落于MRS肉汤培养基中，37℃培养24小时，然后取500μL发酵液，参照天根细菌基因组DNA提取试剂盒（目录号：DP302）操作得到该菌株的基因组，该基因组用于后面的分子生物学鉴定。

2.3.1蛋白质谱鉴定

用牙签沾取平板上E04菌株的单菌落于蛋白质谱板上，然后用牙签把菌泥涂布均匀在质谱板上的圆盘内，涂布菌泥不需要太厚，然后按照蛋白质谱试剂盒说明书要求加入1μL质谱样本预处理盒中的基质溶液覆盖样品，室温下自然晾干。晾干后的质谱板放置到Motitof蛋白质谱仪上进行鉴定。

MALDI-TOF-MS蛋白质指纹图谱如图3所示，经过鉴定E04菌株为卷曲乳杆菌。

2.3.1 16s rDNA 基因序列鉴定

（1）16s rDNA 基因扩增

引物序列：

27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCA；

1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT。

表1 16s rDNA PCR扩增体系（50μL）

（2）电泳验证PCR扩增产物的大小为1500bp左右，符合要求。

（3）PCR产物测序

测序结果显示，E04菌株的16s rDNA序列为SEQ ID NO:1。将该序列在NCBI 数据库中进行BALST比对，其与卷曲乳杆菌（

SEQ ID NO:1如下所示：

GACGGCTCCTTCCCGAAGGTTAGGCCACCGGCTTTGGGCATTGCAGACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCGTGCAGTCGAGTTGCAGACTGCAGTCCGAACTGAGAACAGCTTTCAGAGATTCGCTTGCCTTCGCAGGCTCGCTTCTCGTTGTACTGCCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCATTAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTAATAACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGTCTTAGCGTCCCCGAAGGGAACTTTGTATCTCTACAAATGGCACTAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAGAGGCGGAAACCTCCCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTGCAGACCAGAGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTCCACCGCTACACATGGAGTTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGAAAAACAGTTTCCGATGCAGTTCCTCGGTTAAGCCGAGGGCTTTCACATCAGACTTATTCTTCCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGACTTTCTGGTTGATTACCGTCAAATAAAGGCCAGTTACTACCTCTATCCTTCTTCACCAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTGCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATCAGTCTCTCAACTCGGCTATGCATCATCGCCTTGGTAAGCCTTTACCTTACCAACTAGCTAATGCACCGCGGGGCCATCCCATAGCGACAGCTTACGCCGCCTTTTAAAAGCTGATCATGCGATCTGCTTTCTTATCCGGTATTAGCACCTGTTTCCAAGTGGTATCCCAGACTATGGGGCAGGTTCCCCACGTGTTACTCACCCATCCGCCGCTCGCTTTCCTAACGTCATTACCGAAGTAAATCTGTTAGTTCCGCTCGCTCGACTGC。

2.3.3 RAPD指纹图谱鉴定

1、RAPD指纹图谱鉴定

1）引物序列：M13（5’- GAGGGTGGCGGTTCT-3’）。

2）RAPD反应体系

表2 RAPD反应体系

3）电泳

制备1.5%的琼脂糖凝胶板， DL2000 DNA Marker作为结果对照，稳压100V电泳80min，最后利用凝胶成像系统检测电泳图，E04菌株的 RAPD指纹图谱如图4所示。

经比对，现有公开报道中并未发现有与图4吻合的RAPD指纹图谱，从而说明E04菌株是一株新的卷曲乳杆菌菌株。

2.3.4 rep-PCR指纹图谱鉴定

1）rep-PCR引物

GTGGTGGTGGTGGTG。

2）rep-PCR的反应体系

表3 rep-PCR的反应体系

3）电泳

DL2000 DNA Marker作为结果对照。电压100 V，电泳时间80min检测扩增结果，E04菌株rep-PCR指纹图谱如图5所示。

经比对，现有公开报道中并未发现有与图5吻合的rep-PCR指纹图谱，从而说明本发明筛选到的E04菌株是一株新的卷曲乳杆菌菌株。

2.3.5全基因组测序

把E04菌株的菌液按照1%的体积比例接种到500mLMRS肉汤培养基中，37℃培养22h，然后8000rpm离心10min，收集菌体。菌体送到测序中心，得到该菌的全基因序列，基因序列上传至NCBI基因数据库，登录号为CP128800，整个基因组长2133556bp, GC含量占36.59%，基因总数量为2055个。

将E04菌株的菌落形态以及生理生化特性结果进行比对，并综合分子生物学的鉴定结果，确定E04菌株为一株新型的卷曲乳杆菌，并命名为卷曲乳杆菌（

实施例3 卷曲乳杆菌VHProbi E04盐度耐受性试验

在无菌条件下，将接种液按10%的接种量接种到盐浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%的5mL MRS液体培养基中，不接菌的5mL MRS液体培养基作为对照，置于37℃恒温振荡培养，观察培养基是否变浑浊。

结果显示：卷曲乳杆菌VHProbi E04在1%～3%盐浓度下生长，在4%～8%盐浓度下不生长，卷曲乳杆菌 VHProbi E04的最适耐受盐浓度为3%。

实施例4 卷曲乳杆菌VHProbi E04的抗生素耐受性试验

1、抗生素配制：氨苄青霉素、庆大霉素、克林霉素、红霉素、链霉素、四环素均配制成2048μg/mL的贮存液，-20℃保存备用。使用时将贮存液用MRS液体培养基进行2倍系列梯度稀释成使用液，梯度稀释浓度为1～1024μg/mL共11个梯度。

2、接种液制备：接种液的准备：取适量新鲜菌液（24～48h，40℃培养），5000rpm 离心5min ，用无菌生理盐水洗一次，再用同体积生理盐水重悬后稀释50倍，作为接种液。

3、微量肉汤稀释法测定抗生素对卷曲乳杆菌VHProbi E04的最小抑菌浓度MIC。

（1）96孔板第1列次加入不含抗生素的MRS液体培养基，作为阴性对照，向第2～12列依次加入190μL含不同浓度抗生素的MRS液体培养基，然后分别接种10μL上述接种液，做3个平行孔，并以1个孔不加菌液作为空白。

（2）加入50μL石蜡油覆盖防止水分蒸发。

（3）将96孔板于40℃振荡培养48h后取出，测定OD

表4 卷曲乳杆菌VHProbi E04的抗生素MIC值

注：MIC单位μg/mL。

从表4的结果可以看出，本发明提供的卷曲乳杆菌VHProbi E04对红霉素、氨苄西林、四环素和克林霉素等常见抗生素敏感，对链霉素和庆大霉素略敏感，整体生物安全性良好。

实施例5 卷曲乳杆菌 VHProbi E04的疏水性细胞表面测试

1、待测菌液制备：挑取纯化好的卷曲乳杆菌VHProbi E04菌落接种于新配制的MRS液体培养基中，于40℃振荡培养24～48h。再按1%(V/V)的接种量接至MRS液体培养基中于37℃继续振荡培养24～48h后6000×g离心10min，收集菌体后用无菌生理盐水冲洗2次，再用灭菌0.1M KNO

2、表面疏水性测定：吸取50μL上述菌悬液加入2450μL的0.1M KNO

结果显示：本发明提供的卷曲乳杆菌VHProbi E04细胞表面疏水性为50.61%。

实施例6 卷曲乳杆菌VHProbi E04抗氧化功能测定

1、菌株清除DPPH和羟基自由基（HRS）能力测定

1）PBS菌悬液制备

将生长状态优良的单菌落接种于3mL的MRS液体培养基中，37℃条件下培养18-20h，以此培养液为接种液，按照2%的接种量接种于50mL的MRS液体培养基中，静置培养18h，获得菌株的培养液。吸取1mL菌液收集菌体后用1mL PBS缓冲液洗涤菌体2遍后再加入2mLPBS溶液重悬菌体备用。

2）菌株清除DPPH自由基能力的测定

取1mL待测菌株的PBS菌悬液，加入1mL 0.4 mM的现配的DPPH自由基溶液，混合均匀后然后置于室温温度下遮光反应30min，然后测定样品在波长 517nm处的吸光度A

清除率按下列公式计算：清除率=[1-（A

结果显示：本发明提供的卷曲乳杆菌VHProbi E04对DPPH自由基的清除率高达24.28%±1.03%。

3）菌株清除羟基自由基HRS能力的测定

将100μL 5mM的水杨酸钠-乙醇溶液，100μL 5mM的硫酸亚铁，500μL去离子水和200μL卷曲乳杆菌VHProbi E04菌悬液混匀后加入100μL过氧化氢溶液（3mM），37℃水浴15min后在510nm波长处测量样品吸光度。

羟自由基清除率按照下列公式进行计算：清除率=（A

其中：A

结果显示：本发明提供的卷曲乳杆菌VHProbi E04对HRS自由基的清除率高达24.19%±4.63%。

2、菌株抗脂质过氧化能力测定

1）菌株培养及发酵上清液、菌体、胞内提取物的制备：

菌株在MRS液体培养基中37℃培养24h，传3代后，6000 r/min，4℃离心10min，收集上清液即为发酵上清液。收集的菌体用PBS缓冲液（pH 7.4）于6000 r/min 离心10min，洗涤3次。将菌体重悬于PBS缓冲液，调整菌体浓度为1.0×10

2）亚油酸乳化液的制备：0.1mL亚油酸，0.2mL Tween 20，19.7mL去离子水。

3） 0.5mL的PBS溶液（pH 7.4）中加入1 mL亚油酸的乳化液， 1mLFeSO

抑制率＝(A

结果显示：本发明提供的卷曲乳杆菌VHProbi E04的上清液抗脂质过氧化抑制率为39.18%±0.17%；菌体抗脂质过氧化抑制率为10.71%±0.19%；胞内提取物的脂质过氧化抑制率为15.40%±0.19%。

实施例8 卷曲乳杆菌VHProbi E04对加德纳氏菌的抑制效果

取100μL卷曲乳杆菌菌液（10

取100μL MRS液体培养基和100μL加德纳氏菌菌液接种于装有5mL改良BHI培养基的试管中，震荡均匀，将试管在37℃培养箱培养24h，得到对照组培养液。

将各组培养液用灭菌的PBS缓冲液梯度稀释后用移液器吸取100μL涂布于哥伦比亚血琼脂固体培养基，于37℃培养箱倒置培养48h后进行平板计数，获得各组培养液中加德纳氏菌的菌落数。

结果显示，对照组培养液中的加德纳氏菌浓度为2.15×10

实施例9 卷曲乳杆菌VHProbi E04对白色念珠菌的抑制效果

取50μL卷曲乳杆菌菌液(10

取50μL MRS液体培养基和50μL白色念珠菌菌液接种于装有5mL MRS液体培养基的试管中，作为对照组培养液。

将对照组和实验组培养液在37℃培养箱培养24h；用灭菌的PBS缓冲液梯度稀释后用移液器吸取100μL涂布于沙氏葡萄糖固体培养基，于37℃培养箱倒置培养48h后进行平板计数，获得各组培养液中白色念珠菌的菌落数。

结果显示，对照组培养液中的白色念珠菌菌浓度为5.05×10

实施例10 卷曲乳杆菌VHProbi E04对金黄色葡萄球菌的抑菌效果

取出金黄色葡萄球菌的甘油管，用接种环挑取少许菌液在营养琼脂平板上划线，待长出菌落后，挑取单菌落于营养肉汤中培养24小时，菌液备用。

参照实施例1中所述牛津杯抑菌试验方法，检测卷曲乳杆菌VHProbi E04发酵液对引起细菌性阴道炎的金黄色葡萄球菌的抑制效果。

结果显示，该菌株对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径达到2.15±0.21cm。从而说明卷曲乳杆菌VHProbi E04能有效抑制金黄色葡萄球菌。

实施例11 卷曲乳杆菌VHProbi E04对人阴道上皮细胞的粘附性

1、细胞预培养

将人阴道上皮细胞液氮中复苏，培养至所需量，待细胞密度生长至80%左右时，胰酶消化成单细胞悬液，血球计数板计数，细胞数为5×10

2、菌悬液制备

将卷曲乳杆菌VHProbi E04新鲜菌液用pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤两次，然后用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液同体积重悬，调整吸光度，使OD

3、细胞培养

在已准备好的含人阴道上皮细胞的24孔板内加入菌悬液500μL，于二氧化碳培养箱中共生培养2h；用pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤3次，去除未粘附的菌。

4、计数

将细胞爬片用甲醇固定 15 min，然后吉姆萨染液染色5 min，pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤冲洗干净后，取出细胞爬片到载玻片上。在显微镜下观察。

结果如图6所示，卷曲乳杆菌VHProbi E04对人阴道上皮细胞具有一定的粘附性，因此可以有效定植在阴道中。

卷曲乳杆菌VHProbi E04筛选自健康女性阴道分泌物，是阴道正常菌株之一，能够粘附到阴道上皮细胞表面定植，而且该菌株具有较广的抑菌谱，不仅能够抑制加德纳氏菌和白色念珠菌，还能有效抑制金黄色葡萄球菌，因此可制成菌剂、药物或是女性卫生产品，将有助于预防或治疗细菌性阴道炎和霉菌性阴道炎，保持女性阴道的健康。