一种复合光催化抑菌剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种复合光催化抑菌剂及其制备方法，属于水产病害技术领域。

背景技术

嗜水气单胞菌广泛分布于淡水环境中，是感染鱼类的主要病原体，会导致疖病、溃疡、出血性败血症等鱼类疾病。这些疾病具有流行区域广，流行周期长，死亡率高等特点，每年造成的经济损失高达几百亿元。

在水产养殖中，通常使用抗生素来治疗嗜水气单胞菌的感染，但是，抗生素的过度使用甚至滥用不仅会污染环境，还会诱发抗生素耐药性。因此，开发一种新型的绿色的具有显著抑菌效果的抑菌剂具有重要意义。

中药天然产物大黄素含有大π共轭蒽醌结构而具有优秀的光学性能，在可见光照射下可以产生ROS，具有高效、无耐药性和副作用的优点，可以作为光催化抑菌剂。现有技术中专利CN115590062A披露了将大黄素作为光催化抑菌剂用于灭活大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌，其中对于不同菌种的灭活效果存在差异。现有技术中没有披露以大黄素制备复合光催化抑菌剂，进一步增强大黄素光催化抑菌效果，并用于灭活嗜水气单胞菌的研究。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种复合光催化抑菌剂，通过将大黄素(Em)负载到海藻酸钠(SA)中，制备复合光催化抑菌剂Em/SA。所述复合光催化抑菌剂Em/SA可以显著增强大黄素的光催化抑菌效果。

本发明提供了一种复合光催化抑菌剂，所述复合光催化抑菌剂由海藻酸钠和以下(a)-(b)至少一种物质组成：

(a)作为活性成分的大黄素；

(b)具有蒽醌结构的大黄素衍生物；

在本发明的一种实施方式中，所述大黄素衍生物包括芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄酚或大黄酸。

本发明还提供了一种复合光催化抑菌剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将大黄素或大黄素衍生物与海藻酸钠水溶液混合，搅拌；

(2)将步骤(1)所得溶液与氯化钙溶液混合；

(3)将步骤(2)所得混合液冲洗，预冷，冷冻干燥，得到复合光催化抑菌剂。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中，大黄素与或大黄素衍生物海藻酸钠的质量比为1：5或更多，或为1：(5-100)，或为1：(5-20)。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中，海藻酸钠水溶液为将海藻酸钠与水混合，搅拌溶解得到，所述海藻酸钠水溶液的浓度为5-20g/L，优选为10g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中搅拌时间为6-10h，优选为8h。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中混合方式为，将步骤(1)滴加至氯化钙溶液中，或将步骤(1)所得溶液以5-20mL/min的速度滴加至氯化钙溶液中；优选的，将步骤(1)所得溶液以10mL/min的速度滴加至氯化钙溶液中。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中氯化钙溶液的浓度为0.05-0.2mol/L，优选为0.1mol/L。

本发明还提供一种灭活嗜水气单胞菌的方法，所述方法为将所述复合光催化抑菌剂与嗜水气单胞菌混合，在光源照射下灭活嗜水气单胞菌。

在本发明的一种实施方式中，所述光源包括可见光。

在本发明的一种实施方式中，所述光源包括白色荧光灯。

在本发明的一种实施方式中，所述光源的功率为5-45W。

在本发明的一种实施方式中，所述光源的照射时间为10-60min。

在本发明的一种实施方式中，所述复合光催化抑菌剂的添加量为0.2-4mg/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为将复合光催化抑菌剂加入至嗜水气单胞菌中，避光培养后，光照培养。

在本发明的一种实施方式中，所述避光培养时间为1-3h，优选为2h。

在本发明的一种实施方式中，所述光照培养时间为不小于10min，优选为10-60min，或优选为30min。

本发明还提供含有所述复合光催化抑菌剂，或所述方法制备得到的复合光催化抑菌剂的产品。

本发明还提供所述复合光催化抑菌剂，或所述产品在不以疾病治疗诊断为目的的灭活嗜水气单胞菌中的应用。

有益效果：

(1)本发明通过将大黄素负载到海藻酸钠中，制备复合光催化抑菌剂Em/SA，相较于单独使用大黄素，复合光催化抑菌剂Em/SA可以实现对嗜水气单胞菌细胞灭活效果的进一步提升。对于菌浓为10

(2)方法简单，环境友好：负载型光催化抑菌剂Em/SA的制备方法简单绿色，且光灭活嗜水气单胞菌过程使用的复合光催化抑菌剂Em/SA中只含有中草药天然产物大黄素和海藻酸钠，反应在光照下进行，不会对环境造成二次污染。

(3)高效省时：本发明只需将Em/SA投入到嗜水气单胞菌细胞悬液中，用白光灯光照30min，可以高效实现嗜水气单胞菌的光灭活，使得存活率下降至低于21.65％。

附图说明

图1：大黄素对嗜水气单胞菌的最低抑菌浓度实验结果图。

图2：(a)和(b)为在黑暗条件下256mg/L的大黄素对嗜水气单胞菌的抑制效果，(c)和(d)为在光照条件下256mg/L的大黄素对嗜水气单胞菌的抑制效果。

图3：不同大黄素浓度对嗜水气单胞菌的抑制效果。

图4：不同光源对嗜水气单胞菌的抑制效果。

图5：海藻酸钠、大黄素和Em/SA的红外光谱。

图6：复合光催化抑菌剂Em/SA的对嗜水气单胞菌的抑制效果。

具体实施方式

下面通过实施例进一步说明本发明

下述实施例中材料购买自上海国药，菌株嗜水气单胞菌购买自美国细胞培养物收藏中心，菌种编号为：ATCC35654。

培养基配方：

NB培养基配方：1g/L牛肉浸膏、2g/L酵母提取物、5g/L胰蛋白胨、5g/L氯化钠。

NB固体培养基配方：1g/L牛肉浸膏、2g/L酵母提取物、5g/L胰蛋白胨、5g/L氯化钠、15g/L琼脂粉。

本发明所用到的培养器皿与培养基等均在121℃条件下灭菌15min。

嗜水气单胞菌悬浮液制备：

从-80℃冰箱中取出冻存的嗜水气单胞菌，在NB固体培养基上划线后于28℃培养箱中培养16h。随后，将NB培养基上的一个单克隆接种到5mL NB培养基中，并在28℃摇床中培养过夜。第二天，将嗜水气单胞菌的过夜菌接种至50mL NB培养基中，在28℃摇床中培养2h。收集菌体，将菌浓稀释至10

实施例1复合光催化抑菌剂Em/SA的制备

(1)取1g海藻酸钠(SA)溶解在100mL水中，搅拌均匀后，加入10mg大黄素(Em)，继续搅拌8h。

(2)利用1mL注射器将步骤(1)所得溶液逐滴滴加到0.1M的CaCl

对本实施例中的海藻酸钠、大黄素和复合光催化抑菌剂Em/SA进行红外测试，如图5所示，复合光催化抑菌剂Em/SA同时含有海藻酸钠和大黄素的特征峰，表明本发明的方法成功合成了复合光催化抑菌剂Em/SA。

实施例2复合光催化抑菌剂Em/SA在光照下对嗜水气单胞菌的灭活效果

(1)复合光催化抑菌剂的制备

制备方法同实施例1，区别在于，步骤(1)中海藻酸钠加入量为50mg，大黄素加入量为0.5mg。

(2)复合光催化抑菌剂在光照下对嗜水气单胞菌的灭活效果

取步骤(1)得到的复合光催化抑菌剂50.5mg(大黄素活性成分为0.5mg)，加入到50mL的嗜水气单胞菌细胞悬浮液中，然后在32W可见光光照下反应30min，反应结束后取100μL样品到离心管中，用0.9％ NaCl溶液稀释10

对比例1大黄素的单独使用在光照下对嗜水气单胞菌的灭活效果

将0.5mg大黄素加入到50mL的嗜水气单胞菌细胞悬浮液中，然后在32W可见光光照下反应30min，反应结束后取100μL样品到离心管中，用0.9％ NaCl溶液稀释10

将50mg海藻酸钠加入到50mL的嗜水气单胞菌细胞悬浮液中，然后在32W可见光光照下反应30min，反应结束后取100μL样品到离心管中，用0.9％ NaCl溶液稀释10

对比例3大黄素与海藻酸钠联合使用在光照下对嗜水气单胞菌的灭活效果

将50mg海藻酸钠与0.5mg大黄素直接加入到50mL的嗜水气单胞菌细胞悬浮液中，然后在32W可见光光照下反应30min，反应结束后取100μL样品到离心管中，用0.9％ NaCl溶液稀释10

对比例4复合光催化抑菌剂Em/CNF在光照下对嗜水气单胞菌的灭活效果

(1)复合光催化抑菌剂Em/CNF的制备

制备方法同实施例1，区别在于，步骤(1)中海藻酸钠变为纤维素纳米纤维(CNF)，添加量为50mg，大黄素的添加量为0.5mg。

(2)复合光催化抑菌剂在光照下对嗜水气单胞菌的灭活效果

取步骤(1)得到的复合光催化抑菌剂50.5mg(大黄素活性成分为0.5mg)，加入到50mL的嗜水气单胞菌细胞悬浮液中，然后在32W可见光光照下反应30min，反应结束后取100μL样品到离心管中，用0.9％ NaCl溶液稀释10

实施例3不同大黄素添加量制备的复合光催化抑菌剂Em/SA在光照下对嗜水气单胞菌的灭活效果

(1)复合光催化抑菌剂Em/SA-1的制备

制备方法同实施例1，区别在于，步骤(1)中的海藻酸钠加入量为1g，大黄素加入量为50mg。制备得到复合光催化抑菌剂为Em/SA-1。

(2)不同大黄素添加量的复合光催化抑菌剂Em/SA的制备

按照上述步骤(1)的方法，区别在于，大黄素的加入量为100mg。制备得到复合光催化抑菌剂Em/SA-2。

按照上述步骤(1)的方法，区别在于，大黄素的加入量为150mg。制备得到复合光催化抑菌剂Em/SA-3。

按照上述步骤(1)的方法，区别在于，大黄素的加入量为200mg。制备得到复合光催化抑菌剂Em/SA-4。

(3)分别取步骤(2)制备得到的复合光催化抑菌剂为Em/SA-1、Em/SA-2、Em/SA-3、Em/SA-4 50.5mg，加入到50mL的嗜水气单胞菌细胞悬浮液中，然后在32W可见光光照下反应30min，反应结束后取100μL样品到离心管中，用0.9％ NaCl溶液稀释10

对比例4大黄素对嗜水气单胞菌的最低抑菌浓度

(1)配制浓度分别为2048、1024、512、256、128、64、32、16、8mg/L的大黄素溶液；

(2)取保菌管中嗜水气单胞菌接种于100μLNB培养基(此时初始OD

(3)向步骤(2)的培养基中并分别加入100μL步骤(1)得到的不同浓度的大黄素溶液，并在28℃，150rpm的条件下培养24h，在600nm处测定其吸光值。如图1所示，当大黄素添加量小于256mg/L时，嗜水气单胞菌OD

对比例5大黄素在黑暗下对嗜水气单胞菌的灭活效果

将12.8mg大黄素加入到50mL的嗜水气单胞菌细胞悬浮液中，然后在黑暗下分别培养15、30、60min，反应结束后取100μL样品到离心管中，用0.9％ NaCl溶液稀释10

对比例6大黄素在不同光照时间下对嗜水气单胞菌的灭活效果

将12.8mg大黄素加入到50mL的嗜水气单胞菌细胞悬浮液中，然后在32W可见光光照下分别培养15、30、60min，反应结束后取100μL样品到离心管中，用0.9％ NaCl溶液稀释10

对比例7不同添加量大黄素在光照下对嗜水气单胞菌的灭活效果

将6.4mg、3.2mg、1.6mg、0.8mg大黄素分别加入到50mL的嗜水气单胞菌细胞悬浮液中，然后在32W可见光光照下反应30min，反应结束后取100μL样品到离心管中，用0.9％NaCl溶液稀释10

对比例8大黄素在不同功率光照下对嗜水气单胞菌的灭活效果

将6.4mg大黄素加入到50mL的嗜水气单胞菌细胞悬浮液中，然后分别在5W、15W、23W、32W、45W可见光光照下反应30min，反应结束后取100μL样品到离心管中，用0.9％ NaCl溶液稀释10