一种对肥胖、脂肪肝具有保护作用的Sema7A重组蛋白

技术领域

本发明涉及一种重组蛋白，尤其涉及一种对肥胖、脂肪肝具有保护作用的Sema7A重组蛋白。

背景技术

由于人们生活方式和饮食习惯的改变，肥胖、脂肪肝及其他代谢相关疾病发病率逐年增加。

Semaphorin家族分子最早发现于神经系统，作为轴突导向分子发挥作用，最新的研究结果表明Sema7A也参与代谢疾病的进展，有可能发挥对肥胖、脂肪肝等代谢疾病的治疗作用。

发明内容

为解决以上现有问题，本发明公开了一种对肥胖、脂肪肝具有保护作用的Sema7A重组蛋白。

一种对肥胖、脂肪肝具有保护作用的Sema7A重组蛋白；

Sema7A细胞外段的蛋白序列为：

HLRSGPRIFAVWKGHVGQDRVDFGQTEPHTVLFHEPGSSSVWVGGRGKVYLFDFPEGKNASVRTDCENYITLLERRSEGLLACGTNARHPSCWNLVNGTVVPLGEMRGYAPFSPDENSLVLFEGDEVYSTIRKQEYNGKIPRFRRIRGESELYTSDTVMQNPQFIKATIVHQDQAYDDKIYYFFREDNPDKNPEAPLNVSRVAQLCRGDQGGESSLSVSKWNTFLKAMLVCSDAATNKNFNRLQDVFLLPDPSGQWRDTRVYGVFSNPWNYSAVCVYSLGDIDKVFRTSSLKGYHSSLPNPRPGKCLPDQQPIPTETFQVADRHPEVAQRVEPMGPLKTPLFHSKYHYQKVAVHRMQASHGETFHVLYLTTDRGTIHKVVEPGEQEHSFAFNIMEIQPFRRAAAIQTMSLDAERRKLYVSSQWEVSQVPLDLCEVYGGGCHGCLMSRDPYCGWDQGRCISIYSSERSVLQSINPAEPHKECPNPKPDKAPLQKVSLAPNSRYYLSCPMESRHATYSWRHKENVEQSCEPGHQSPNCILFIENLTAQQYGHYFCEAQEGSYFREAQHWQLLPEDGIMAEHLLGHACALAASLWLGVLP。

进一步的，所述Sema7A重组蛋白在代谢相关疾病中如肥胖、脂肪肝的作用。

进一步的，所述Sema7A重组蛋白作为一种减肥、保肝的候选分子。

本发明的有益效果：本发明涉及一种重组蛋白在肥胖、脂肪肝等代谢相关疾病中的作用，具体阐明了一种对肥胖、脂肪肝等具有保护作用的重组蛋白的作用，该蛋白缺失可以诱导小鼠的肥胖、脂肪肝加重及胰岛素抵抗。

附图说明

图1是Sema7A敲除加重高脂诱导的肥胖和脂肪肝对比图；

图2是Sema7A抑制脂肪间充质干细胞的脂肪分化和脂肪合成对比图；

图3是重组Sema7A改善高脂诱导的肥胖对比图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作更为详细、完整的说明。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

1.Sema7A蛋白缺失加重高脂诱导的肥胖和脂肪肝

为了检测Sema7A在肥胖中的作用，取WT和Sema7A-/-小鼠喂食高脂饮食(60％)。高脂12周后取脂肪组织称重，发现在雌性小鼠中，Sema7A敲除小鼠的SWAT和pgWAT相比WT小鼠都显著增加(图1A-B)，在雄性小鼠中，Sema7A敲除小鼠的SWAT相比WT显著增加(图1B)。HE染色显示在雌性小鼠中，Sema7A-/-小鼠的SWAT和pgWAT脂肪细胞大小显著增加(图1C,D)。

肥胖经常伴随着非酒精性脂肪肝，还检测了Sema7A敲除对非酒精性脂肪肝进展的影响。发现在Sema7A-/-小鼠肝脏体积和重量较WT小鼠显著增加(图1E-F)。油红O染色和HE染色显示，相比WT小鼠，Sema7A-/-小鼠肝脏中脂质沉积显著增加(图1G),而且Sema7A敲除增加了肝重TG的水平(图1H)。

A.WT和Sema7A-/-小鼠从8周开始高脂喂养。12周后取不同部位的脂肪。图中展示了皮下脂肪(SWAT,subcutaneous adipose tissue)和生殖器周围脂肪(pgWAT，peri-gonadal visceral adipose tissue)的代表性图片。B.高脂后，雄性和雌性WT和Sema7A-/-小鼠脂肪重量的统计图。C&D.WT和Sema7A-/-小鼠SWAT和pgWAT的代表H&E染色图片。E.高脂喂养的WT和Sema7A-/-小鼠肝脏代表图。F.雄性和雌性WT和Sema7A-/-小鼠肝重重量的统计图。G.正常饮食和高脂饮食的WT和Sema7A-/-小鼠肝脏冷冻切片经油红O染色，石蜡包埋切片经HE染色。H.高脂喂养的WT和Sema7A-/-小鼠肝脏三酯酰甘油.I-K.WT和Sema7A-/-小鼠饥饿过夜，收集血清，并测定血清中的TG(I),TC(J)和LDL-C(K)的含量.L.ELISA检测正常和高脂饮食WT和Sema7A-/-小鼠饥饿血清瘦素水平。数据以平均值±SD表示.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.****P<0.0001。

2.Sema7A细胞外段的蛋白序列

HLRSGPRIFAVWKGHVGQDRVDFGQTEPHTVLFHEPGSSSVWVGGRGKVYLFDFPEGKNASVRTDCENYITLLERRSEGLLACGTNARHPSCWNLVNGTVVPLGEMRGYAPFSPDENSLVLFEGDEVYSTIRKQEYNGKIPRFRRIRGESELYTSDTVMQNPQFIKATIVHQDQAYDDKIYYFFREDNPDKNPEAPLNVSRVAQLCRGDQGGESSLSVSKWNTFLKAMLVCSDAATNKNFNRLQDVFLLPDPSGQWRDTRVYGVFSNPWNYSAVCVYSLGDIDKVFRTSSLKGYHSSLPNPRPGKCLPDQQPIPTETFQVADRHPEVAQRVEPMGPLKTPLFHSKYHYQKVAVHRMQASHGETFHVLYLTTDRGTIHKVVEPGEQEHSFAFNIMEIQPFRRAAAIQTMSLDAERRKLYVSSQWEVSQVPLDLCEVYGGGCHGCLMSRDPYCGWDQGRCISIYSSERSVLQSINPAEPHKECPNPKPDKAPLQKVSLAPNSRYYLSCPMESRHATYSWRHKENVEQSCEPGHQSPNCILFIENLTAQQYGHYFCEAQEGSYFREAQHWQLLPEDGIMAEHLLGHACALAASLWLGVLP

实施例：

1.Sema7A体外抑制脂肪分化和合成

为了研究Sema7A影响肥胖和脂肪肝的可能分子机制，检测了Sema7A对脂肪分化的影响。从脂肪组织分离了脂肪间充质干细胞(ADSCs)，并且发现Sema7A敲除显著增加皮下脂肪组织来源的间充质干细胞(S-ADSC)的成脂分化能力(图2A)。同时，重组Sema7A(rSema7A)显著抑制ADSCs成脂分化(图2B)并且rSema7A在分化的0-2天添加具有最强的抑制分化作用(图2C)。类似的，Sema7A敲除也显著增加内脏脂肪组织来源的脂肪间充质干细胞(V-ADSCs)成脂分化(图2D)，rSema7A抑制V-ADSCs的分化(图2E)。进一步的研究表明rSema7A抑制脂肪分化过程中脂肪分化/合成相关基因，包括Srebf1、Pparg和Acc1的表达(图2F)。

A.从3-6周的WT和Sema7A-/-小鼠皮下脂肪组织分离脂肪间充质干细胞(S-ADSC)，并诱导其成脂分化。分化结束后细胞油红O染色拍照，异丙醇提取油红O，并测定518nm吸收值用于定量。B.ADSC细胞在分化的0-4天加入不同浓度的Sema7A，并进行成脂分化。C.在ADSC细胞成脂分化的不同时间分别加入Sema7A，并诱导成脂分化，分化结束后油红O染色并拍照定量。D.从3-6周的WT和Sema7A-/-小鼠内脏脂肪组织分离脂肪间充质干细胞(V-ADSC)，并诱导其成脂分化。E.Sema7A-/-V-ADSC细胞在分化的0-4天加入对照和Sema7A，并进行成脂分化。分化完成后油红O染色并定量。F.ADSC细胞在加入和不加入Sema7A的条件下成脂分化，qPCR检测分化第2、4、6天的mRNA表达水平。数据以平均值±SD表示.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001.

2.rSema7A对高脂诱导的肥胖的治疗作用

由于Sema7A敲除加重高脂诱导的脂肪肝，而红细胞、免疫细胞和内皮细胞来源的可溶性Sema7A可以释放到血浆中，检测了血浆中Sema7A的含量，发现高脂喂养的小鼠血浆中Sema7A含量显著下降(图3A)，提示可溶性Sema7A可能对肥胖具有保护作用。为了验证猜测，使用重组Sema7A治疗高脂诱导的肥胖。Sema7A-/-分别给予溶剂对照或者重组Sema7A，并同时喂食高脂饮食6周。结果显示，相对WT小鼠，Sema7A-/-小鼠体重增速更快，而给与Sema7A处理的Sema7A-/-体重增速下降(图3B,C)。Sema7A处理的小鼠生殖器周围脂肪(pgWAT)和肾周脂肪(perirenal WAT)相比对照组显著下降(图3D-F)。HE染色显示Sema7A处理组小鼠肾周脂肪(perirenal WAT)细胞大小相比对照组显著下降(图3G)。

A.Elisa检测正常饮食和高脂饮食小鼠血浆中Sema7A的含量。B&C.Sema7A-/-雌性小鼠分别给予溶剂对照和Sema7A重组蛋白，检测WT组，Sema7A-/-+control’组和‘Sema7A-/-+rSema7A’组的体重变化((n≥5))。其中*和**代表Sema7A-/-+control’组和‘Sema7A-/-+rSema7A’组的差异。D.给与对照和Sema7A治疗组生殖器周围脂肪(pgWAT)和肾周脂肪(Perirenal WAT)代表图。E&F.给与对照和Sema7A治疗组生殖器周围脂肪(E)和肾周脂肪(F)重量统计。G.各组小鼠肾周脂肪HE染色代表图及脂肪大小统计图。图B及图C中结果以平均值±SEM呈现，其他结果以平均值±SD呈现，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。

本发明主要涉及了Sema7A蛋白对肥胖和代谢性疾病的治疗及预防作用以及Sema7A在脂肪肝中的保护作用，具体阐明了一种对肥胖、脂肪肝等具有保护作用的重组蛋白的作用，该蛋白缺失可以诱导小鼠的肥胖、脂肪肝加重及胰岛素抵抗。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”，“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上所述仅为本发明专利的较佳实施例而已，并不用以限制本发明专利，凡在本发明专利的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明专利的保护范围之内。