一种一体化数字PCR微流控芯片

技术领域

本发明涉及数字PCR技术领域，特别涉及一种一体化数字PCR微流控芯片。

背景技术

数字PCR也叫Digital PCR（dPCR），是近几年发展起来的一种核酸定量分析技术。相较于传统荧光定量PCR来说，数字PCR对结果的判定不依赖于扩增曲线循环Ct值，不受扩增效率的影响，能够直接读出DNA的分子个数，能够对起始样本核酸分子绝对定量。数字PCR基本原理是将一个样本分成几十到几万份，然后再将其分配到不同的反应单元中，使每个微滴单元包含一个或多个拷贝的核酸分子（即DNA模板），每个单元都会对目标分子进行扩增，然后再对每个单元进行荧光信号的统计并计算。相对而言，传统PCR或qPCR反应都是发生于同一体系当中，这也是数字PCR与其最大的区别。目前dPCR样本稀释分配的主要实现方式包括：基于液滴微流控的微滴数字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)和基于芯片式微流控的微阵列芯片式PCR。

基于芯片式微流控的微阵列芯片式PCR在实际使用过程中存在诸多问题,首先微阵列芯片制作工艺复杂，昂贵，不利于大规模普及使用；其次是分析样品的通量受限于微阵列的数量，不适用于临床高通量分析的要求；最后，微阵列芯片通常在开放环境下进行操作，存在较大的污染风险，不符合临床诊断分析的要求。相对而言，微滴数字PCR微流控芯片则可以提供更封闭的体系，更多数量的液滴，但目前的微滴生成装置所生成的微滴的体积均匀一致性还有待改善，且现有微滴数字PCR微流控芯片多采用分体式技术路线，即液滴生成，PCR反应，液滴检测等步骤分别在不同的仪器上进行，操作流程复杂，不利于临床诊断的快速进行。

发明内容

为了解决上述现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种一体化数字PCR微流控芯片。所述芯片可以用于实现数万甚至数百万液滴的均匀生成，液滴储存，PCR反应，液滴检测等操作流程。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：提供一种一体化数字PCR微流控芯片。所述芯片包括玻璃上层；PDMS芯片层，所述PDMS芯片层的上表面与所述玻璃上层的下表面贴合；玻璃基底，所述玻璃基底的上表面与所述PDMS芯片层的下表面贴合。

其中，所述芯片设置有样品进入区、连续相进入区、液滴生成区、液滴平铺区和废液排出区，所述样品进入区、连续相进入区和废液排出区贯穿所述玻璃上层及所述PDMS芯片层，所述液滴生成区、液滴平铺区设于所述PDMS芯片层的下表面。

在一些实施例中，所述玻璃上层与所述PDMS芯片层设有贯穿玻璃上层上下表面与PDMS芯片层上下表面的样品进入孔、连续相进入孔和废液排出孔。

在一些实施例中，所述PDMS芯片层的下表面设有微通道功能区，所述功能区包括样品进入区、连续相进入区、液滴生成区、液滴平铺区和废液排出区。所述样品进入区、连续相进入区、液滴生成区、液滴平铺区和废液排出区之间均通过微通道连通。

在一些实施例中，所述玻璃上层与所述玻璃基底的厚度均小于1mm，且两者均具有高透光性。

在一些实施例中，所述微通道设有离散相流动通道与连续相流动通道，所述离散相流动通道的宽度小于所述连续相流动通道的宽度。

在一些实施例中，所述液体平铺区的高度设为小于液滴的直径大小，其中，所述液体平铺区为矩形形状，并且所述液体平铺区内设有微柱结构。

相较于现有技术，本发明具有以下有益效果：

1.该芯片集成了液滴生成、PCR反应、液滴平铺、液滴检测等功能，在芯片上实现了核酸分析的全部流程，减少分析步骤以及人工操作，降低操作难度的同时减少了人工操作带来的误差，满足临床诊断的需求；

2.样品在芯片上以油包水或水包油的液滴形式存在，避免了样品与环境的相互污染，减少了假阳性的可能；

3.该芯片的结构皆可通过软光刻工艺加工，因此加工简单，且其加工出来的结构可以稳定的生成均一液滴。

附图说明

图1是本发明微流控芯片示意图；

图2是微流控芯片的组成示意图；

图3是微流控芯片的各功能区域分布示意图；

图4是PDMS芯片层上表面的示意图；

图5是PDMS芯片层下表面的示意图；

图6是液滴生成区的局部放大示意图；

图7是液滴平铺区的局部放大示意图；

图8是废液排出区的局部放大示意图；

图中标号说明：玻璃上层10、PDMS芯片层20、玻璃基底30、样品进入区40、连续相进入区50、液滴生成区60、液滴平铺区70、废液排出区80、玻璃上层样品进入孔11、玻璃上层连续相进入孔12、玻璃上层废液排出孔13、PDMS芯片层样品进入孔21、PDMS芯片层连续相进入孔22、PDMS芯片层废液排出孔23、微通道结构24、液滴流动通道61、液滴流动通道扩张角62、离散相流动通道63、连续相流动通道64、液滴平铺腔室71、液滴平铺区支撑柱72、废液流动通道81。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与发明相关的部分。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。

如图1和图2所示，本发明公开了一种一体化数字PCR微流控芯片，包括玻璃上层10、PDMS芯片层20、玻璃基底30。PDMS芯片层20的上表面与玻璃上层10的下表面贴合，PDMS芯片20的下表面与玻璃基底30的上表面贴合，在一些实施例中，贴合采用粘接、焊接、键合等方式，以保证贴合牢固、紧密。

其中，玻璃上层10与玻璃基底30采用厚度小于1mm的石英玻璃，可以使PCR反应时导热更迅速，不会影响液滴的光学检测，且保证了高透光性。

如图3所示，芯片按照功能划分为样品进入区40、连续相进入区50、液滴生成区60、液滴平铺区70和废液排出区80。样品进入区40用于样本的进样；连续相进入区50用于连续相的进样；液滴生成区60用于将样本相分配为数万个至数百万个液滴，例如，将水相样本转变为油包水液滴或将油相样本转变为水包油液滴；液滴在液滴平铺区70整齐排列并进行PCR反应，反应完成后，对液滴平铺区70内的液滴进行光学检测；废液排出区80用于排除多余的连续相。

其中，样品进入区40、连续相进入区50和废液排出区80贯穿玻璃上层10及PDMS芯片层20，液滴生成区60和液滴平铺区70设于PDMS芯片层20的下表面。

由于样品进入区40、连续相进入区50和废液排出区80贯穿玻璃上层10及PDMS芯片层20，故如图1和图4所示，玻璃上层10设有贯穿玻璃上层10上下表面的玻璃上层样品进入孔10、玻璃上层连续相进入孔12与玻璃上层废液排出孔13，PDMS芯片层20设有贯穿PDMS芯片层30上下表面的PDMS芯片层样品进入孔21、PDMS芯片层连续相进入孔22与PDMS芯片层废液排出孔23。其中，玻璃上层样品进入孔11与PDMS芯片层20样品进入孔21孔径相同，中心对齐；玻璃上层连续相进入孔12与PDMS芯片层连续相进入孔22孔径相同，中心对齐；玻璃上层废液排出孔13与PDMS芯片层废液排出孔23孔径相同，中心对齐。

如图5所示，PDMS芯片层20的下表面设有微通道功能区，功能区包括样品进入区40、连续相进入区50、液滴生成区60、液滴平铺区70和废液排出区80，各功能区之间通过微通道结构24连通。

其中，液滴平铺区70采用矩形结构，其目的是为了在液滴平铺过程中利用连续相的浸润性排除液滴平铺区70内的空气。且液滴平铺区70的高度设为小于液滴的直径大小，其目的在于防止液滴平铺过程中液滴产生堆叠造成检测误差。

如图6所示，微通道结构24设置有离散相流动通道63和连续相流动通道64，离散相流动通道63的宽度小于连续相流动通道64的宽度，其目的在于可获得不同的流速，从而更稳定形成液滴。流动相连续通道64还与液滴流动通道61相连，液滴流动通道61设有液滴流动通道扩张角62，在一些实施例中，液滴流动通道扩张角62的大小为5°-7°，其作用是在降低液滴流速的同时降低流动阻力，以防液滴速度骤变发生液滴间的相互碰撞。

如图7所示，液滴流动通道61连通液滴生成区60与液滴平铺区70，使得在液滴生成区60生成的液滴通过液滴流动通道61进入液滴平铺区70。液滴平铺区70内设有液滴平铺区支撑柱72，其作用在于防止液滴平铺腔室71坍塌造成液滴融合。

如图8所示，废液流动通道81将液滴平铺区70与废液排出区80连通，使得实验后的废液通过废液流动通道81从液滴平铺区70流动到废液排出区80，然后从PDMS芯片层废液排出孔23将废液排出。其中，废液流动通道81的宽度设为小于生成的液滴的直径，其作用是防止在液滴平铺的过程中液滴大量流失。

下面通过一个实施例对本发明的芯片的使用过程进一步说明。

在本实施例中，样本进入区40用于储存加入的水相样本相，连续相进入区50用于储存加入的生成油相，通过外部正压或负压作用将样本进入区40中的样本和连续相进入区50中的生成油驱动至液滴生成区60。

液滴生成区60将样本分散成数万个油包水液滴，生成的油包水液滴通过液滴流动通道61进入液滴平铺区70。在外部温控设备的辅助下对液滴平铺区70内的液滴进行PCR反应，反应完成后对液滴平铺区70内的液滴进行光学信号检测。

以上描述仅为本申请的较佳实施例以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本申请中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。

除说明书所述的技术特征外，其余技术特征为本领域技术人员的已知技术，为突出本发明的创新特点，其余技术特征在此不再赘述。