一种降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂及制备和脱除粮食饲料中玉米赤霉烯酮毒素的方法

技术领域

本发明属于真菌毒素的酶法降解领域，更具体地，涉及一种降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂及制备和脱除粮食饲料中玉米赤霉烯酮毒素的方法。

背景技术

玉米是世界上最重要的粮食和饲料作物之一，玉米赤霉烯酮(Zearalenone，Zen)是一种从发霉玉米中分离的真菌毒素，它是由多种镰刀菌属真菌产生的次级代谢产物，其骨架结构为二羟基苯酸内酯。研究发现Zen普遍存在于玉米、小麦、大米等粮食及其产品中，是严重危害人类和动物健康的霉菌毒素之一。其毒性主要表现在：1.损害哺乳动物的血液系统、免疫系统、生殖系统及肝肾等器官。2.促使动物肝脏、卵巢等组织癌变，3.大量摄入可导致动物急性中毒，甚至死亡。我国规定玉米饲料原料中Zen含量不得超过500μg/kg。

我国玉米主产区位于亚热带和温带，受高温、潮湿天气影响，玉米在生长、收获、储藏和运输过程中极易被镰刀菌所浸染，进而导致玉米及其饲料中Zen含量超标，给我国饲料和养殖业带来了巨大经济损失。因此在实际生产中，需要采取一些高效、安全的措施来降低玉米及其产品中的Zen毒素。目前报道的Zen脱毒方法包括物理法、化学法和生物法。其中生物法脱毒得到了人们的广泛关注，包括生物酶和微生物脱毒法。微生物或微生物酶脱毒法具有效率高、成本低、对饲料无二次污染等优点。

目前报道的Zen降解酶主要包括：来源于天蓝色链霉菌的漆酶、源自不动杆菌的过氧化物酶、源自粉红粘帚霉菌的水解酶、源自棘状外瓶霉菌的玉米赤霉烯酮LD08等。虽然目前发现的Zen降解酶在实验室条件下，对纯的Zen毒素表现出高效的降解活性，但其对饲料中Zen的降解活性较低或无活性。究其原因：一方面，饲料成分复杂，单纯的Zen降解酶容易在饲料中失活，降低了其在饲料中的脱毒效果；另一方面，饲料中Zen毒素被麸皮、淀粉等颗粒物质包裹，导致此类降解酶无法与Zen充分接触，加上Zen难溶于水，进一步降低了该类降解酶的脱毒活性。上述原因导致目前发现的Zen降解酶无法应用于实际的饲料中Zen的脱毒处理。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提出一种降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂及制备和脱除粮食饲料中玉米赤霉烯酮毒素的方法。本发明的复合酶制剂克服了现有的单纯Zen降解酶在饲料中易失活和因无法充分与Zen接触导致的脱毒效率低的问题。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂，以所述复合酶制剂的总重量计，纤维素酶的含量为15-35wt％、淀粉酶的含量为20-40wt％、α-半乳糖苷酶的含量为15-30wt％、云芝漆酶的含量为5-25wt％、卵磷脂的含量为0.5-1wt％、吐温-80的含量为0.25-0.5wt％、NaCl的含量为0.1-0.5wt％。

本发明第二方面提供了所述的降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂的制备方法，所述制备方法包括：将所述纤维素酶、淀粉酶、α-半乳糖苷酶、云芝漆酶、卵磷脂、吐温-80和NaCl混合搅拌均匀，得到所述降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂。

本发明第三方面提供了一种脱除粮食饲料中玉米赤霉烯酮毒素的方法，所述方法包括：将粮食饲料、水和所述的降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂混合，得到混合体系，调节混合体系的pH，搅拌混合体系并离心去除上清液，得到脱毒后的粮食饲料。

根据本发明，优选地，所述粮食饲料的原料为玉米、小麦和大米中的至少一种。

根据本发明，优选地，所述粮食饲料为玉米粉、玉米浆干粉、小麦粉、小麦麸皮

本发明的降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂脱除粮食饲料中Zen的机理如下：复合酶制剂中的纤维素酶、淀粉酶、α-半乳糖苷酶主要用于分解粮食饲料中的麸皮、淀粉等颗粒物质，使得包裹于其中的Zen毒素充分释放，并在卵磷脂、吐温-80、NaCl协助下，Zen毒素被云芝漆酶充分降解，从而达到脱除Zen毒素的效果。

根据本发明，优选地，所述粮食饲料中的所述降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂的添加量为0.4-83.3g/kg。

根据本发明，优选地，所述粮食饲料和水的用量比为1：(1-40)g/mL。

根据本发明，优选地，调节混合体系的pH至4-9。

根据本发明，优选地，所述搅拌的温度为30-67℃。

根据本发明，优选地，所述搅拌的时间为3-96h。

本发明的技术方案的有益效果如下：

本发明通过将纤维素酶、淀粉酶、α-半乳糖苷酶、云芝漆酶、NaCl、卵磷脂、吐温-80进行合理复配，获得了一种新的复合酶制剂，该复合酶制剂可提高或维持云芝漆酶对饲料中Zen的降解活性，使得饲料中的Zen毒素分子与酶制剂充分接触，提高云芝漆酶对Zen的降解效率，进而降低饲料的脱毒成本。

本发明的复合酶制剂对玉米粉等饲料中Zen的脱除率最高达97.7％(附图1、6和7所示)，玉米粉等饲料中Zen含量从3229.5μg/kg(脱毒前)降为28.6μg/kg(脱毒后)，远低于国标(GB13078-2017)规定的500μg/Kg。与现有Zen的酶法脱毒技术相比，本发明的复合酶制剂具有脱毒效率高、脱毒工艺简单、脱毒成本低的优点，可用于实际工业化生产中各类Zen超标饲料的脱毒处理。

本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显，其中，在本发明示例性实施方式中，相同的参考标号通常代表相同部件。

图1示出了实施例2提供的一种脱除粮食饲料中玉米赤霉烯酮毒素的方法中利用复合酶制剂脱毒前后玉米粉饲料中Zen的含量变化的示意图。

图2示出了实施例2-7提供的一种脱除粮食饲料中玉米赤霉烯酮毒素的方法中复合酶制剂用量对Zen脱毒效率的影响。

图3示出了实施例8-13提供的一种脱除粮食饲料中玉米赤霉烯酮毒素的方法中pH对Zen脱毒效率的影响。

图4示出了实施例14-18提供的一种脱除粮食饲料中玉米赤霉烯酮毒素的方法中搅拌温度对Zen脱毒效率的影响。

图5示出了实施例19-24提供的一种脱除粮食饲料中玉米赤霉烯酮毒素的方法中搅拌时间对Zen脱毒效率的影响。

图6示出了实施例25-30提供的一种脱除粮食饲料中玉米赤霉烯酮毒素的方法中粮食饲料和水的用量比对Zen脱毒效率的影响。

图7示出了实施例25-30提供的一种脱除粮食饲料中玉米赤霉烯酮毒素的方法中粮食饲料和水的用量比对脱毒后玉米粉中Zen残留量的影响。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了使本发明更加透彻和完整，并且能够将本发明的范围完整地传达给本领域的技术人员。

以下各个实施例中，所用玉米粉饲料中Zen含量为3229.5μg/kg，是国标GB13078-2017规定的6.5倍。

实施例1

本实施例提供一种降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂，以所述复合酶制剂的总重量计，纤维素酶的含量为25wt％、淀粉酶的含量为30wt％、α-半乳糖苷酶的含量为20wt％、云芝漆酶的含量为23.5wt％、卵磷脂的含量为0.75wt％、吐温-80的含量为0.5wt％、NaCl的含量为0.25wt％。

所述的降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂的制备方法包括：将所述纤维素酶、淀粉酶、α-半乳糖苷酶、云芝漆酶、卵磷脂、吐温-80和NaCl混合搅拌均匀，得到所述降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂。

实施例2-7复合酶制剂用量对Zen脱毒效率的影响

实施例2

本实施例提供一种脱除粮食饲料中玉米赤霉烯酮毒素的方法，所述方法包括：将10g玉米粉饲料、100mL去离子水和实施例1所述的降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂(即所述玉米粉饲料中的所述降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂的添加量为83.3g/kg)混合，得到混合体系，调节混合体系的pH为7.5，在37℃下搅拌混合体系24h并离心(5000rpm，5min)去除上清液，得到脱毒后的玉米粉。

取1g脱毒后的玉米粉，按照GB5009.209-2016测定脱毒后玉米粉中Zen残留量。

实施例3-7

实施例3-7分别提供一种脱除粮食饲料中玉米赤霉烯酮毒素的方法，实施例3-7与实施例2的区别仅在于：

实施例3中，所述玉米粉饲料中的所述降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂的添加量为0.4g/kg；

实施例4中，所述玉米粉饲料中的所述降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂的添加量为0.8g/kg；

实施例5中，所述玉米粉饲料中的所述降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂的添加量为4.2g/kg；

实施例6中，所述玉米粉饲料中的所述降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂的添加量为8.3g/kg；

实施例7中，所述玉米粉饲料中的所述降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂的添加量为41.7g/kg。

实施例3-7分别取1g脱毒后的玉米粉，按照GB5009.209-2016测定脱毒后玉米粉中Zen残留量。

实施例2-7的结果如图2所示，由图2可知：随着复合酶制剂添加量的增加，复合酶制剂对玉米粉中Zen脱毒率逐渐提高(4.3-94.2％)，当复合酶制剂添加量为83.3g/kg时，复合酶制剂对玉米粉中Zen脱毒率高达94.24％。表明本发明的复合酶制剂对玉米粉饲料原料中Zen毒素具有高效的降解活性。

实施例8-13pH对Zen脱毒效率的影响

实施例8-13分别提供一种脱除粮食饲料中玉米赤霉烯酮毒素的方法，实施例8-13与实施例2的区别仅在于：

实施例8中，所述玉米粉饲料中的所述降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂的添加量为83g/kg；调节混合体系的pH为4；

实施例9中，所述玉米粉饲料中的所述降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂的添加量为83g/kg；调节混合体系的pH为5；

实施例10中，所述玉米粉饲料中的所述降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂的添加量为83g/kg；调节混合体系的pH为6；

实施例11中，所述玉米粉饲料中的所述降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂的添加量为83g/kg；调节混合体系的pH为7；

实施例12中，所述玉米粉饲料中的所述降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂的添加量为83g/kg；调节混合体系的pH为8；

实施例13中，所述玉米粉饲料中的所述降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂的添加量为83g/kg；调节混合体系的pH为9；

实施例8-13分别取1g脱毒后的玉米粉，按照GB5009.209-2016测定脱毒后玉米粉中Zen残留量。

实施例8-13的结果如图3所示，由图3可知：随着体系pH逐渐增大(4-9)，复合酶制剂对玉米粉中Zen的脱毒率显著提高(13.5-89.28％)，体系pH＝9.0时，复合酶制剂的脱毒率达89.28％。本发明的复合酶制剂在较宽的pH范围内，均可对玉米粉中的Zen表现出高效的降解活性，表明该复合酶制剂具有一定的pH耐受性，这更有利于本发明的复合酶制剂在玉米粉等饲料脱毒中的应用。

实施例14-18搅拌温度对Zen脱毒效率的影响

实施例14-18分别提供一种脱除粮食饲料中玉米赤霉烯酮毒素的方法，实施例14-18与实施例2的区别仅在于：

实施例14中，所述玉米粉饲料中的所述降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂的添加量为83g/kg；搅拌的温度为30℃；

实施例15中，所述玉米粉饲料中的所述降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂的添加量为83g/kg；搅拌的温度为45℃；

实施例16中，所述玉米粉饲料中的所述降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂的添加量为83g/kg；搅拌的温度为55℃；

实施例17中，所述玉米粉饲料中的所述降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂的添加量为83g/kg；搅拌的温度为60℃；

实施例18中，所述玉米粉饲料中的所述降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂的添加量为83g/kg；搅拌的温度为67℃；

实施例14-18分别取1g脱毒后的玉米粉，按照GB5009.209-2016测定脱毒后玉米粉中Zen残留量。

实施例14-18的结果如图4所示，由图4可知：随着体系温度升高(30-67℃)，复合酶制剂对Zen的降解率先升高，后降低。生物酶的活性往往与温度相关，温度太低或太高均可导致复合酶制剂对Zen的降解活性降低，本发明的复合酶制剂最佳脱毒温度区间为37-55℃，在该温度区间内，复合酶制剂对玉米粉中Zen的脱毒率均高于80.0％。即使在55℃的高温下，对玉米粉中Zen的脱毒率仍可达93.1％，这表明本发明的复合酶制剂具有一定的耐热性。

实施例19-24搅拌时间对Zen脱毒效率的影响

实施例19-24分别提供一种脱除粮食饲料中玉米赤霉烯酮毒素的方法，实施例19-24与实施例2的区别仅在于：

实施例19中，所述玉米粉饲料中的所述降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂的添加量为83g/kg；搅拌的时间为3h；

实施例20中，所述玉米粉饲料中的所述降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂的添加量为83g/kg；搅拌的时间为6h；

实施例21中，所述玉米粉饲料中的所述降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂的添加量为83g/kg；搅拌的时间为12h；

实施例22中，所述玉米粉饲料中的所述降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂的添加量为83g/kg；搅拌的时间为24h；

实施例23中，所述玉米粉饲料中的所述降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂的添加量为83g/kg；搅拌的时间为48h；

实施例24中，所述玉米粉饲料中的所述降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂的添加量为83g/kg；搅拌的时间为96h；

实施例19-24分别取1g脱毒后的玉米粉，按照GB5009.209-2016测定脱毒后玉米粉中Zen残留量。

实施例19-24的结果如图5所示，由图5可知：随着脱毒时间增加(3-96h)，复合酶制剂对Zen的脱毒率同步提高(13.2-95.7％)。将本发明的复合酶制剂用于脱除玉米粉饲料原料中Zen毒素时，需搅拌处理24h以上，即可脱除90％以上的Zen毒素。

实施例25-30粮食饲料和水的用量比对Zen脱毒效率的影响

实施例25-30分别提供一种脱除粮食饲料中玉米赤霉烯酮毒素的方法，实施例25-30与实施例2的区别仅在于：

实施例25中，所述玉米粉饲料中的所述降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂的添加量为83g/kg；10mL去离子水(所述粮食饲料和水的用量比为1：1g/mL)；

实施例26中，所述玉米粉饲料中的所述降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂的添加量为83g/kg；50mL去离子水(所述粮食饲料和水的用量比为1：5g/mL)；

实施例27中，所述玉米粉饲料中的所述降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂的添加量为83g/kg；100mL去离子水(所述粮食饲料和水的用量比为1：10g/mL)；

实施例28中，所述玉米粉饲料中的所述降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂的添加量为83g/kg；150mL去离子水(所述粮食饲料和水的用量比为1：15g/mL)；

实施例29中，所述玉米粉饲料中的所述降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂的添加量为83g/kg；200mL去离子水(所述粮食饲料和水的用量比为1：20g/mL)；

实施例30中，所述玉米粉饲料中的所述降解玉米赤霉烯酮的复合酶制剂的添加量为83g/kg；400mL去离子水(所述粮食饲料和水的用量比为1：40g/mL)；

实施例25-30分别取1g脱毒后的玉米粉，按照GB5009.209-2016测定脱毒后玉米粉中Zen残留量。

实施例25-30的结果如图6、7所示，由图6、7可知：体系水含量显著影响复合酶制剂对玉米粉中Zen的脱毒效率，体系水含量较少，酶无法充分与饲料中的Zen接触，导致复合酶制剂的脱毒效率降低；体系水含量太多，则降低了复合酶制剂的浓度，相应复合酶制剂的脱毒效率也相应降低。当料液比为1:15时，复合酶制剂对Zen的脱毒率高达97.7％，玉米粉中Zen含量从3229.5μg/kg(脱毒前)降低为28.6μg/kg(脱毒后)，远低于国标规定的玉米饲料原料中Zen含量500μg/Kg。这表明本发明的复合酶制剂可高效的脱除玉米饲料原料中的Zen毒素，脱毒后饲料中Zen含量符合国家标准。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。