香蕉组织内源激素玉米素在抗香蕉枯萎病中的用途

技术领域

本发明涉及植物保护技术领域，更具体地，涉及香蕉组织内源激素玉米素在抗香蕉枯萎病中的用途。

背景技术

植物激素是指在植物体特定部位合成的，并从合成部位运往植物体其他部位对植物体整个生命活动起显著调节作用的微量有机物，也被称为植物天然激素或植物内源激素。植物激素通常是在低浓度时对植物的生长发育产生显著调节作用。

植物激素亦称植物天然激素或植物内源激素。是指植物体内产生的一些微量而能调节(促进、抑制)自身生理过程的有机化合物。已知植物体内产生的激素有六大类，即生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸、乙烯和油菜素甾醇。它们都是些简单的小分子有机化合物，但它们的生理效应却非常复杂、多样。从影响细胞的分裂、伸长、分化到影响植物发芽、生根、开花、结实、性别决定、休眠和脱落等。所以，植物激素对植物的生长发育有重要的调控作用。生长素、赤霉素、细胞分裂素能促进植物生长和发育过程，而脱落酸和乙烯的作用则是抑制植物生长，促进成熟和衰老。这几种激素在植物生长发育的不同时期除各有其独特作用外，还能互相促进或抑制，充分发挥调节植物生长发育的作用。一些矿质养分如氮、磷、钾和土壤逆境胁迫会影响植物根系激素的含量和分布，进而调控根系生长。

玉米素(Zeatin)是一种有机化合物，分子式为C

叶黄素(Lutein)，别名植物黄体素，是一种类胡萝卜素，化学式为C

尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)引起的枯萎病极大地限制了香蕉产业的可持续发展，尤其是4号生理小种热带型(TR4，Tropical Race 4)危害尤为严重，可侵染香蕉根，球茎，假茎，叶片，木质部，果轴。该病原菌传播迅速，到目前为止该病害已从东南亚部分地区扩散到约旦、阿曼、秘鲁等20多个种植香蕉的国家。TR4极难防控，该病害扩散到某一地区后，施用杀菌剂、土壤熏蒸剂，改进栽培措施如轮作和土壤改良等均不能有效控制病害的流行。由于其传播快，防控难，缺少系统性的防控方法，大量香蕉种植园因TR4而被毁灭丢荒。因此，开发有效的绿色防控TR4方法对香蕉产业的可持续发展显得尤为关键。

经检索，步佳佳在硕士学位论文“香蕉组织内源激素与枯萎病抗性关系的研究”一文中明确指出：“生长素可能参与香蕉枯萎病抗病反应，玉米素含量变化与香蕉抗性无明显相关性，推断玉米素可能在香蕉抗枯萎病过程中作用不大，脱落酸可能在香蕉枯萎病抗病过程中起作用”。现有技术均未检索到玉米素或叶黄素在抑制植物病原菌方面的用途，特别是抗香蕉枯萎病中的用途。

发明内容

针对以上技术问题，本发明提供香蕉组织内源激素在抗香蕉枯萎病中的用途。

本发明保护香蕉组织内源激素在抗香蕉枯萎病中的应用，所述的内源激素为玉米素。

进一步地，所述的香蕉枯萎病为尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporumf.sp.cubense)4号生理小种热带型。

进一步地，所述的玉米素在抑制香蕉枯萎病菌生长中的应用。

进一步地，所述的玉米素在预防香蕉枯萎病菌侵染中的作用。

本发明研究团队通过KEGG通路富集分析结果发现：抗病处理组与对照组相比显著富集到了KEGG通路19个，其中单独诱导的通路为Carotenoid biosynthesis(map00906)，Zeatin biosynthesis(map00908)等10个，差异基因富集可能是导致香蕉抗病的一个重要响应。因此，发明人推测这两个通路(map00906和map00908)中后期合成的物质可能对病原菌TR4生长具有重要功能。因此，发明人尝试使用玉米素或叶黄素进行抗香蕉枯萎病TR4的实验，结果表明：玉米素或叶黄素可有效抑制TR4菌丝的生长，表现出良好的抗香蕉枯萎病菌活性，对香蕉枯萎病菌(TR4)具有显著的防治作用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)本发明保护所述的香蕉组织内源激素为玉米素，实验证明：体外试验和组培瓶内实验均表明玉米素或叶黄素均可有效抑制TR4菌丝的生长，玉米素或叶黄素处理生根培养基可提高香蕉对枯萎病的抗性；但是，温室炼苗成活率实验表明：玉米素处理幼苗接种TR4与未接种TR4对照表现出一致的成活率，温室中玉米素也提高了香蕉幼苗对TR4的抗性，也没有影响蕉幼苗的植株生长，而叶黄素在温室中的成活率与接种TR4对照处理基本一致。说明叶黄素虽然提高香蕉幼苗对TR4的抗性，但是也会影响香蕉幼苗的植株生长。因此，本发明保护玉米素抗香蕉枯萎病菌活性，玉米素对香蕉枯萎病菌(TR4)具有显著的防治作用。

2)本发明为TR4防控提供了新思路和方法，为深入探索防控香蕉枯萎病病害TR4奠定了基础。植物激素来源于寄主植物体内，基因表达筛选发现这两类激素信号通路的基因被富集，适当剂量不会给植物带来不利的影响。

附图说明

图1激素体外处理对TR4菌落直径的变化影响；

图2激素体外处理对TR4生长的影响；

图3激素处理香蕉组培苗对TR4抗性的作用；

图4激素处理香蕉组培生根苗接种TR4对成活率的影响；

图5激素处理对香蕉组培苗株高的作用变化；

图6激素处理对香蕉组培苗鲜重的作用；

图7激素处理对香蕉组培苗根系生长的作用。

具体实施方式

实施例1、香蕉体内抗TR4物质种类的筛选

1.实验处理，采集样本

香蕉生根苗培养：香蕉感TR4品种-巴西蕉扩繁培养基中组培苗选择生长较好的小苗挑选至带有生根培养基的组培瓶中，每瓶15株，光照强度1600～2000lux，光照时间8小时/天的条件下培养15～20天，获得可用于炼苗的生根苗。

炼苗、幼苗培养：巴西蕉生根组培苗洗净培养基后，在温室的带有基质和椰糠(1：1)的育苗盆中培养约3周后转移至带有生土/香蕉基质(1：1)的盆中培养，1株/盆，生长至10cm后用于人工接种TR4(15-1)，每周叶片喷施0.05％的尿素溶液。

处理幼苗接种TR4、采集样本：前期研究发现使用的硒形态可以有效提高温室内巴西蕉幼苗对TR4的抗病性(刘立娜等，2023：亚硒酸钠在防治香蕉枯萎病菌中的应用，专利号CN202210010596.8)，因此本发明选择该硒形态用于诱导香蕉幼苗的抗病性以筛选诱导的抗病相关物质。巴西蕉小苗接种TR4前10天将幼苗分为4组，分别为空白对照(Control)、TR4对照(TR4)、硒形态处理(Se80：80mg/L硒形态液体，50mL/盆)，硒形态处理+TR4(Se80+TR4)。采用伤根浸菌法接种(刘立娜等，2021)，取出椰糠中培养的香蕉苗后，把要进行接种的香蕉苗按照种质资源有序取出摆好，用剪刀将香蕉苗根系修剪至5cm左右的长度，然后将根浸没于孢子悬浮液中，间隔5～10分钟搅拌一次悬浮液。30min后取出浸泡好的香蕉苗移栽于混合基质土的盆中。接种TR4第7天，采集巴西蕉球茎样本，3个球茎混为1个样本，5个样本/处理用于转录组测序，每组剩余约20株用于TR4接种42天的发病率调查。

2.转录组测序与数据分析

RNA提取、文库构建及测序：使用TRIzol方法提取植物组织的总RNA，DNase I去除基因组DNA。1.0％琼脂糖凝胶检测RNA完整性，Bioanalyser 2100测定RNA质量，ND-2000进行量化。选择高质量RNA样本(OD260/280＝1.8～2.2，OD260/230≥2.0，RIN≥8.0，28S:18S≥1.0，>1μg)构建测序文库。RNA纯化、反转录、文库构建和测序委托上海美吉生物技术公司进行，按照Illumina操作说明书进行，双向RNA测序文库经TBS380检测合格后，利用Illumina NovaSeq 6000测序仪进行测序。

基因表达量分析：利用FASTP(https://github.com/OpenGene/fastp)对原始数据进行去除和质量控制(Chen et al.,2018)，获得Clean Reads。然后使用HISAT2软件(http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml)(Kim et al.,2015)将CleanReads分别以定向模式比对到香蕉参考基因组(https://banana-genome-hub.southgreen.fr/)(Belser et al.,2021)。每个样本Reads以StringTie(https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/)组装到参考基因组(Pertea et al.,2015)。采用TPM方法计算各基因的表达量，RSEM(http://deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/)(Li etal.,2011)用于定量基因的丰度。

功能富集分析：用DESeq2(Love et al.,2014)/DEGseq(Wang et al.,2009)/EdgeR(Robinson et al.,2010)结合进行差异表达分析，|log2 FC|≥1且P-adjust≤0.05被定义为表达差异显著的基因(DEGs)。DEGs进行GO功能基因富集分析(Gene Ontology,http://www.geneontology.org)和KEGG通路分析(Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes,http://www.genome.jp/kegg/)。

3.实验结果

4组处理后TR4接种42天病情指数调查结果为：Control、TR4、Se80和Se80+TR4的病情指数分别为0.0，63.0，0.0和42.0，Se80的防控效果达到33.3％，达到处理效果，Control和Se80发病率为0，证明实验无污染，处理结果可靠。因此，采集的球茎样本可用于转录组测序研究。

Se80+TR4和TR4的转录组分析结果表明，差异表达基因共计5709个，其中Se80+TR4与TR4组相比，上升基因数为2674个，下降基因数为3035个。差异表达基因进行GO富集后发现Se80+TR4特异富集的生物学过程BP 19个(表1)，包括激素代谢过程(GO:0042445)，苯丙烷代谢过程(GO:0009698)，木质素代谢过程(GO:0009808)，次生代谢过程(GO:0019748)等；KEGG富集分析结果表明二萜类植保素生物合成(map00904)，类胡萝卜素生物合成(map00906)和玉米素生物合成(map00908)等10个通路被显著富集。结合GO富集、KEGG通路富集和基因表达量结果，选择类胡萝卜素生物合成途径中的叶黄素、玉米素生物合成途径中的玉米素进行提高香蕉植株抗TR4的进一步功能研究。

表1差异基因GO富集结果

表2差异基因KEGG通路富集结果

实施例2、玉米素或叶黄素的体外抑制TR4生长的效果

1.实验材料

枯萎病菌菌株：TR4(云南西双版纳分离的致病性强的野生型菌株15-1)。

2.实验方法

TR4(15-1)菌丝的培养：去皮马铃薯200g，切成小块，用1000mL水煮沸15min，纱布过滤去马铃薯残渣，加入白沙糖20g，琼脂粉20g，加水定容至1000mL，121℃高压灭菌20min。将-80℃保存的TR4(15-1)接种于PDA平板上，28℃黑暗培养5天。

激素处理培养基培养TR4：购买筛选的类胡萝卜素合成途径中的叶黄素(索莱宝，SL8650，C

数据分析：采用T-Test对不同处理间直径差异的显著性进行分析。

3.实验结果

结果显示：选择差异表达基因显著富集的激素(玉米素和叶黄素)在离体处理的PDA平板上进行TR4菌丝生长的作用测定，结果见图1和图2。

从图中可以看出，不同浓度玉米素或叶黄素对TR4菌丝生长的抑制作用均显著高于对照以及含DMSO的对照，表现出高浓度抑制作用大于低浓度。对照，DMSO，玉米素8uM，玉米素64uM，叶黄素8uM，叶黄素64uM处理的PDA培养基上TR4菌落直径分别为65.25±2.83cm，63.17±2.03cm，59.17±1.14cm，57.83±1.95cm，58.75±1.64cm，57.08±1.89cm，激素(叶黄素或玉米素)对TR4菌丝生长的抑制率为9.3～12.5％，玉米素处理显著抑制了TR4的生长，浓度高抑制效果更好，但不同浓度之间不存在显著差异。叶黄素处理也显著抑制了TR4的生长，且64uM处理的抑制效果显著高于8uM处理。结果表明植物激素(玉米素或叶黄素)在体外可有效抑制TR4菌丝的生长。

实施例3、玉米素或叶黄素在组培瓶内对香蕉苗抗TR4的作用

1.实验材料

香蕉种质：巴西蕉。

枯萎病菌菌株：TR4(云南西双版纳分离的致病性强的野生型菌株15-1)。

2.实验方法

TR4(15-1)菌丝的培养：PDA平板上的分生孢子用无菌水洗脱下来，注入到装有300mL PDB液体培养基的锥形瓶中，25℃下150rpm摇瓶培养3天。两层纱布过滤除去菌丝，采用血球计数板在显微镜下将孢子液浓度调整至1×10

巴西蕉不同处理生根苗的培养：选择保存香蕉种质3cm以上，高度均匀的巴西蕉小苗切割，接种到带有生根培养基(MS培养液+NAA 0.5mg/L+蔗糖10-15g/L+琼脂5.0g/L，pH5.6～5.8)的组培瓶中，每瓶100mL培养基，分别加入玉米素或叶黄素1mL混合液I(80μL10uM母液+920μL DMSO)，生根培养基玉米素或叶黄素终浓度为8uM，每个处理5瓶，每瓶5株巴西蕉切割小苗，光照强度1600～2000lux，光照时间8小时/天的条件下培养20～25天，获得不同处理的生根苗，实验重复2次。

生根苗叶片接种TR4：不同处理生根苗的叶片在无菌条件下接种1×10

接种TR4后的生根苗炼苗培养：将玉米素、叶黄素处理的巴西蕉生根苗、对照巴西蕉接种TR4，以及巴西蕉未接种TR4的4组处理，每组处理24株，接种7天后在温室中采用椰糠：基质为1：1的介质炼苗约40天，统计植株成活率并转移到含土基质中种植(生土质量：基质质量＝1：1)。

3.实验结果

不同浓度的叶黄素或玉米素处理生根培养基中生长20天的巴西蕉生根苗接种TR4第7天进行发病调查，结果见图3，数据显示：对照处理巴西蕉生根苗或DMSO处理的巴西蕉生根苗叶片对TR4侵染表现出不同程度的感病性，叶黄素或玉米素处理的巴西蕉叶片对TR4侵染均未表现出病斑扩张的现象。表明激素(玉米素或叶黄素)处理生根培养基可提高香蕉对枯萎病的抗性。不同处理接种TR4后，温室炼苗成活率见图4。从图中可以看出，对照未接种TR4，对照接种TR4，玉米素TR4，叶黄素TR4的24株生根苗经过40天炼苗后，成活数量分别为21株，15株，21株，13株。转入含土盆栽种7d后，对照接种TR4的2个植株死亡，其余均较好生长。实验结果表明，玉米素TR4与未接种TR4对照表现出一致的成活率，温室中玉米素也提高了香蕉幼苗对TR4的抗性，而叶黄素在温室中未能显著提高，成活率与对照TR4处理基本一致。这可能是由于叶黄素抑制TR4的有效剂量影响了香蕉幼苗的植株生长。

实施例4、玉米素或叶黄素对组培瓶内香蕉植株生长的影响1.实验方法

巴西蕉不同处理生根苗培养20天后，每个处理5瓶，每瓶5株巴西蕉组培苗用于测定香蕉植株生长指标。组培苗去除培养基，洗净后，吸水纸吸附多余的水分后，测量株高(第一根须根到植株顶端的高度)，称量整株重量，观察香蕉根系生长活力。采用T-Test对不同处理间直径差异的显著性进行分析。

2.实验结果

与对照株高相比，玉米素或叶黄素对巴西蕉生根苗生长的影响见图5(株高)，图6(鲜重)，图7(根系活力)。玉米素或叶黄素处理后巴西蕉生根苗的株高分别为10.7±1.7cm，11.0±0.8cm；与对照或DMSO处理株高(10.9±3.7cm和11.2±2.4cm)保持一致。与对照鲜重相比(2.89±1.17g和2.50±0.82g)玉米素或叶黄素处理后巴西蕉生根苗的鲜重分别为2.21±0.72g，2.06±0.81g，鲜重均下降，叶黄素处理鲜重下降达到显著水平。根系活力表明根系数量和生长变化不显著。数据表明，玉米素和叶黄素在显著提高巴西蕉幼苗的TR4抗性浓度范围内，玉米素对香蕉苗的生长不影响，而叶黄素显著降低了巴西蕉苗的鲜重。