一种用于植物的活体曲面质谱成像方法

技术领域

本发明属于质谱检测技术领域，特别涉及一种用于植物的活体曲面质谱成像方法。

背景技术

植物代谢物的区域特异性表达是影响植物生长、发育以及对非生物或生物胁迫反应的关键因素。越来越多的研究发现，植物表面的生物分子可以反映植物的生理状态、受到的胁迫刺激和周围的微生物群落。由此可知，监测活体植物表面的信号分子是了解植物生长过程中生理行为的一种很有前景的途径，但由于这些化合物的浓度相对较低、活性形式组成复杂，因此要有效检测这些物质仍是一项长期的挑战。

受人体可穿戴传感设备的影响，一些新兴的植物传感器平台应运而生，它们可以安装在活体植物上，对其生理特性进行连续监测。然而，这些传感器通常仅限于测量生物体周围的微环境和单一生物分子。但活体植物表面的化学成分是多样的、动态的，这给化合物的精确识别和定位带来了巨大挑战。尽管针对上述问题提出了一些先进的、无损的活体植物监测技术，如基于表面增强拉曼散射的纳米探针和拉曼显微技术，但这些技术无法完全克服植物自发荧光的干扰和由于纳米材料的引入对植物生长所带来的影响。因此，有必要开发一种真正无创的分子成像方法，用于分析活体植物中的分子。

质谱成像(MSI)是一种新兴的空间代谢组学技术，可在广泛的动态范围内分析化合物，具有原位和无标记的优点。其中，激光解吸/电离质谱成像(LDI-MSI)作为最常见质谱成像技术，可用于微米级的植物生物学研究，现已成为一种获取代谢物种类和空间位置信息的理想工具。研究发现，基于纳米基底的分子印迹方法可以实现化合物从生物组织到基底上的原位转移，并能进行高效的LDI-MSI分析，显示了这种方法在活体植物中进行成像分析的巨大应用潜力。遗憾的是，目前并没有报道过利用柔性纳米基底进行活体植物分子成像的方法。

Ti

本发明提出了一种新型的分子成像方法，将柔性纳米基底(Ag NWs@MXene)与激光解吸电离质谱成像(LDI-MSI)相结合，可以对植物内源性代谢物和活体植物表面的分子进行直接地可视化成像分析。本发明的创新性主要体现在以下两个方面：(1)解决了坚硬/脆弱的组织因难以制备冷冻切片所带来的成像挑战，在无离域的前提下获取了完整的植物内源性代谢物空间信息；(2)克服了常规的基质辅助激光解吸电离质谱成像(MALDI-MSI)因分析方法的限制在直接分析来自活体植物中分子方面的局限性，实现了快速、原位、无损的活体植物表面分子转移和可视化。该方法具有免标记、灵敏度高、分子覆盖范围广、空间分辨率高、简单易行等优点，可从不同植物器官中获得多种代谢物的丰富空间数据，对微米尺度上对植物的健康水平和发病区域研究至关重要。

发明内容

第一方面本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种用于植物的活体曲面质谱成像方法，来获取活体植物表面信号分子的组成和定位。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种用于植物的活体曲面质谱成像方法，方法如下：合成银纳米线与Ti

对植物样本内源性物质进行可视化分析方法包括以下步骤：

(1)将银纳米线分散液在持续搅拌下缓慢滴加至单层Ti

(2)得到的Ag NWs@MXene复合纳米材料分散液通过真空抽滤，得到Ag NWs@MXene膜；

(3)植物样本的处理：选取植物的目标平面区域，包括黄芩根的横截面、生姜根的横截面和金银花，通过分子印迹法将组织平面内部的化学成分转移至Ag NWs@MXene膜表面；

(4)植物内源性代谢物的质谱成像分析：将植物组织压印后的Ag NWs@MXene膜未接触样本的一侧，通过双面导电铜箔胶带将其粘贴于氧化铟锡导电玻璃片上，LDI-MSI进行成像分析。

进一步的，所述步骤(1)纳米材料的分散介质均为去离子水，银纳米线规格为：直径30nm，长度20～60μm，其分散液浓度为1mg·mL

进一步的，所述步骤(2)真空抽滤时间为20～30min。

进一步的，所述步骤(3)植物目标平面区域为经过切割所形成的组织平面或植物原始所具有的组织平面，印迹法的压印时长为30s，压印的施力方向垂直平面向下，压力根据样本性质在1～10N之间调整。

进一步的，所述步骤(4)氧化铟锡导电载玻片的大小为25mm×75mm，方阻＜6Ω，LDI-MSI的激光能量根据分析物性质在60～80％之间进行调整，分辨率为100μm。

对活体植物表面分子的无损检测分析方法包括以下步骤：

(1)将银纳米线分散液在持续搅拌下缓慢滴加至单层Ti

(2)得到的Ag NWs@MXene复合纳米材料分散液通过真空抽滤，得到Ag NWs@MXene膜；

(3)活体植物样品前处理：使用去离子水冲洗掉活体植物目标组织表面的杂质，用氮气吹干表面；

(4)活体植物样品表面的分子吸附：将Ag NWs@MXene膜裁剪成合适的大小，在膜上覆盖一层无尘纸，用医用胶带将其紧密固定在组织的目标区域上；随后将植物重新转移至生长环境中，使其继续自然生长；

(5)活体植物样品的质谱成像分析：取下粘贴在植物表面的Ag NWs@MXene膜，用双面导电铜箔胶带将其未接触样品的一侧固定在氧化铟锡导电载玻片上，LDI-MSI进行成像分析。

进一步的，所述步骤(1)纳米材料的分散介质均为去离子水，银纳米线规格为：直径30nm，长度20～60μm，其分散液浓度为1mg·mL

进一步的，所述步骤(2)真空抽滤时间为20～30min。

进一步的，所述步骤(3)活体植物为生长良好的西洋参和人参，无枯萎和患病情况，同时，目标区域为西洋参根和人参叶片

进一步的，所述步骤(4)Ag NWs@MXene膜大小为0.6cm×0.6cm。

进一步的，所述步骤(5)Ag NWs@MXene膜移除时间分别为：西洋参根7天，人参叶片48小时，氧化铟锡导电载玻片的大小为25mm×75mm，方阻＜6Ω，LDI-MSI分析时的激光能量在80％～95％之间进行调整，分辨率为100μm。

与现有技术相比，本发明的有益之处为：

(1)本发明设计了一种柔性复合纳米薄膜底物，制备了Ag NWs@MXene膜，首次用于LDI-MSI，表现出了较低的本底干扰、较高的灵敏度和稳定性。

(2)本发明利用开发的Ag NWs@MXene膜，成功地捕获了难以制备冷冻切片的植物组织中内源性分子的空间信息，并结合LDI-MS实现了异质性分子的高分辨可视化分析，与传统的MALDI-MSI相比，具有更高的灵敏度(2～6倍)和分子覆盖率。

(3)本发明打破了当前活体植物分子成像技术的局限性，首次利用柔性基底结合LDI-MSI对活体植物表面的分子进行了直接的成像分析，真正地实现了原位、无损的活体分子检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为材料的合成及表征结果。其中，(A)为Ag NWs@MXene膜合成的流程图，(B)为Ag NWs@MXene、MXene和银纳米线的XRD图谱；(C)为Ag NWs@MXene、MXene和银纳米线的XRD的UV-Vis结果；(D-F)为Ag NWs@MXene膜的光学图像；(G)为Ag NWs@MXene膜表面的SEM图，插图为材料的静态水接触角测试图；(I)为MXene膜表面的SEM图，插图为材料的静态水接触角测试图；(I)为Ag NWs@MXene膜截面的SEM图；(J)为MXene膜的SEM图；(K)为Ag NWs@MXene膜截面的SEM图。

图2为Ag NWs@MXene膜作为LDI-MSI基底对小分子天然产物的检测效果。

图3Ag NWs@MXene膜的自身背景信号测试结果。

图4为Ag NWs@MXene膜作为LDI-MSI基底的稳定性测试和定量分析结果。其中，(A)为苯丙氨酸、葡萄糖、绿原酸、黄芩苷标准品的质谱成像图；(B)为苯丙氨酸、葡萄糖、绿原酸、黄芩苷标准品的信号强度重现度测试结果；(C)为三唑磷及内标物苯菌灵的质谱图及浓度在10～80ng·μL

图5为不同厚度的黄芩和生姜根部冷冻切片图。

图6为Ag NWs@MXene膜结合LDI-MSI对黄芩和生姜根部印迹中代谢物的可视化结果。其中，(A)为黄芩根中目标化合物的质谱成像结果；(B)为生姜根中目标化合物的质谱成像结果。

图7为Ag NWs@MXene膜结合LDI-MSI对金银花中代谢物的可视化结果。其中，(A)为金银花的光学图像；(B)为金银花印迹的光学图像；(C)为金银花内源性代谢物的质谱成像图；(D)为金银花花瓣中的两个代谢物分布区域；(E)为金银花花瓣的主成分分析图；(F)为具有特定分布模式的代表性离子成像图。

图8为活体植物表面的分子成像图。插图为代表性离子的空间分布图。其中，(A)为西洋参根部表面的分子成像；(B)为人参叶片表面的分子成像。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明上述内容做进一步详细说明，但不应该经此理解为本发明上述主体的范围仅限于以下实施例，凡基于本发明上述内容实现的内容均属于本发明的范围。

实施例1：Ag NWs@MXene膜作为LDI-MSI基底检测天然产物

①Ag NWs@MXene膜的合成：Ag NWs@MXene纳米复合物采用直接掺杂法合成，AgNWs@MXene薄膜采用真空辅助过滤法制备，如图1A。

首先，将30mg的单层MXene粉末超声分散在6mL去离子水中。然后，在持续搅拌下将1.5mL的银纳米线水分散液(1mg·mL

②Ag NWs@MXene膜的表征：采用紫外-可见吸光光度计、X射线衍射(XRD)、扫描电子显微镜(SEM)对所Ag NWs@MXene膜的形貌及结构进行表征。其中，Ag NWs@MXene、MXene和银纳米线的紫外-可见吸收光谱(UV-Vis)在200～800nm的波长范围内测量。XRD测量在5～90°范围内以4°·min

如图1B的XRD结果所示，MXene在(002)特征面上的衍射峰，证实了MXene纳米片的存在。此外，Ag NWs的XRD图谱显示了四个典型的银特征峰：(111)、(200)、(220)、(331)和(222)平面。可以观察到，Ag NWs@MXene仍然保留了MXene和银纳米线的衍射峰，这意味着AgNWs@MXene纳米复合物已被成功构建。由图1C的UV-Vis可见，与MXene和银纳米线相比，AgNWs@MXene复合材料在355nm(LDI-MS的激光工作波长)处紫外吸收光谱表现出更高的吸收率。此外，如图1D-F所示，Ag NWs@MXene膜表现出优异的机械柔韧性，使其能够更好的贴合植物的各种弯曲表面。SEM测试的结果如图1G所示显示，Ag NWs@MXene膜的表面平整、光滑且结构无缺陷。同时，与MXene膜相比，Ag NWs@MXene膜中的银纳米线被MXene纳米片紧紧包裹，少量的银纳米线末端暴露在膜表面(图1G和1H)。此外，由于掺杂了银纳米线，Ag NWs@MXene膜的水接触角比MXene膜提高了约20°(图1G和1H)，这种改善可以有效增加膜的表面疏水性，减小分析物的分散程度，从而降低LDI-MSI的检测偏差。图1I和1J比较了Ag NWs@MXene膜和MXene膜的横截面微观结构，可以看出Ag NWs紧密堆积在MXene纳米片层之间，并表现出与MXene薄膜相同的有序层状结构膜的平均厚度约为17.6μm(图1K)。基于这些结果，证明了该合成方法能够成功制备Ag NWs@MXene膜，并且该薄膜具有作为LDI-MSI基底的潜力。

③Ag NWs@MXene膜作为LDI-MSI基底对天然产物的检测：使用四种小分子天然产物(苯丙氨酸、葡萄糖、绿原酸和黄芩苷)作为模型分析物，验证Ag NWs@MXene膜作为LDI-MSI底物的分析效率。首先，将Ag NWs@MXene膜用手动打孔器制成直径为3mm的圆片，用双面导电铜箔胶带将其固定于ITO导电玻璃上。分别滴加2μL的四种分析物溶液(0.1mg·mL

实施例2：Ag NWs@MXene膜作为LDI-MSI基底对小分子化合物的定量分析

①Ag NWs@MXene膜作为LDI-MSI基底的稳定性评价：上述四种分析物分别滴加在Ag NWs@MXene膜上，进行空间分辨率为200μm的成像分析，同时进行三次生物学平行。结果显示，三次实验所获得的成像图相似，各分析物分布较均匀(图4A)。此外，随机选取了膜内8个不同位置进行LDI-MS分析，同样地，该实验重复2次。结果表明，每种分析物均获得了较好的质谱信号强度稳定性，变异系数(CV)小于10％(图4B)。这些结果证实了Ag NWs@MXene基底可提供稳定的质谱信号，这对有效地检测活体植物中的分子至关重要。

②Ag NWs@MXene膜作为LDI-MSI基底用于小分子化合物的定量分析：使用两种农药(三唑磷(TRZ)和氯虫苯甲酰胺(CAP))作为模型分析物，结合内标法(IS)评估了其潜在定量分析的能力。在这里，苯菌灵(BEN)因其化学性质稳定，与分析物的化学性质相似，故被选择作为内标物。分别将两种农药分析物和苯菌灵(100ng·μL

实施例3：黄芩和生姜根部内源性代谢物的可视化分析

采用直接印迹法将植物样品中的天然产物转移到Ag NWs@MXene膜上。首先，使用双面导电铜箔胶带将Ag NWs@MXene膜安装在氧化铟锡物载玻片上。用手术刀将新鲜的黄芩根和根切成0.5cm的小块。用0.5kg的砝码将上述样品紧压在Ag NWs@MXene膜表面上，使其相互作用30s，以确保分子彻底转移，室温风干5min后，进行LDI-MSI分析。为便于比较，还采用了传统的MALDI-MSI方法分析了黄芩根和生姜根。用于MALDI-MSI分析的植物组织在液氮中速冻20s，然后在冷冻切片机分别制备不同厚度的切片。如图5的结果所示，不同厚度下的组织切片的完整均有损失，这表明坚硬的黄芩根组织和富含水分的生姜根组织不适合制备冷冻切片。进一步选择了相对完整的15μm黄芩根切片和20μm生姜切片，将其喷涂常用的有机基质(DHB、CHCA和1,5-DAN)以进行后续对比分析。成像结果如图6所示，由于有机基质的背景干扰，许多重要的目标分子无法被识别，而使用Ag NWs@MXene膜能有效地从植物组织中转移异质性的植物分子，进而绘制高质量的质谱成像图，同时还可以实现传统有机基质无法检测到的分子成像，这能够为活体植物的分子转移和成像提供基础。

实施例4：金银花内源性代谢物的可视化分析

采用直接印迹法将植物样品中的天然产物转移到Ag NWs@MXene膜上。首先，将金银花拆分为三个部分，分别为花瓣(Petal)、花柱(Style)和雄蕊(Stamen)(图7A)，以便进行后续研究。用去离子水冲洗金银花表面以去除杂质，然后用氮气吹干水分。用1kg的砝码将上述样品压在Ag NWs@MXene表面，使其相互作用30s，以确保分子彻底转移，然后风干5min，用于进行LDI-MSI分析。成像结果如图7C所示，成功地检测出金银花雄蕊、花柱和花瓣的代表性内源代谢物的特异性空间分布，包括1种脂肪酸、2种黄酮类化合物、3种酚酸、3种有机酸、3种碳水化合物和3种氨基酸。从上述观察结果来看，金银花花瓣中不同类别的代谢物显示出两个独特的区域分布，即沿花瓣中轴线到顶端的第一部分(Sec.1)和位于花瓣两侧的第二部分(图7D)。基于上述区域的质谱信号进行的主成分分析证实了两个区域的显著分离，表明这些区域的代谢物有很大不同(图7E)。进一步选取了具有特定组织微区分布的代表性离子，如图7F所示，m/z 501.11和m/z 249.18的离子呈明显的互补空间分布。根据这两个目标离子的单色和叠加质谱图像，可以清晰的描述金银花花瓣中代谢物的异质性分布。

实施例5：活体西洋参根、人参叶片表面的分子成像

如图8的流程所示，将Ag NWs@MXene膜附着在植物根和叶的表面，以吸附和印记分子，具体步骤如下：(1)安装膜之前，先用去离子水冲洗西洋参根部和人参叶片表面的杂质，然后用氮气吹干；(2)将Ag NWs@MXene膜的一面贴在植物表面，另一面用几层纸巾覆盖，之后用医用胶带固定边界；(3)分别在西洋参根部粘贴7天和人参叶片粘贴48小时后，取下AgNWs@MXene膜，然后用双面铜箔胶带将薄膜未接触植物的一面固定在ITO载玻片上。同时，使用同批次的未处理的Ag NWs@MXene膜作为对照。

质谱成像结果如图8的插图所示，在西洋参根的表面观察到了3种典型的离子，分别为胆碱(m/z 104.11,[M]

此外，在人参叶片表面发现了四个代表性离子，包括低分子量有机酸(苹果酸(m/z157.01，[M+Na]

该案例证明了本发明可以直观地检测活体植物表面信号分子的组成和空间分布，能够实现广泛地异质性分子检测，且能以较高的灵敏度来获取化合物在活体曲面上的分布特征，能够成为一种监测植物内部健康和患病区域的有力工具。