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一种经过植物乳杆菌发酵后的黑果腺肋花楸提取物纳米眼霜及制备方法

文献发布时间：2024-04-18 20:01:30

技术领域

本发明属于化妆品技术领域，尤其是一种经过植物乳杆菌发酵后的黑果腺肋花楸提取物纳米眼霜及制备方法。

背景技术

眼霜是一种用于眼周皮肤的护肤类化妆产品，除了具有提升皮肤保湿、屏障功能外，根据不同产品的功效性组分和活性物添加，有时候也具有紧致眼部肌肤的功效，缓解黑眼圈、改善皱纹、细纹的功效。

人的眼部肌肤薄弱，更易受到外界环境侵害，也是最容易衰老的部位之一。这种衰老在眼部皮肤具体体现为皮肤厚度减少、含水率下降、皮肤松弛、细密皱纹增多、黑眼圈、眼周皮肤色素沉积、暗沉等一系列现象，归其原因其实是皮肤的抗氧化能力下降、脂褐素堆积、胶原蛋白的合成能力下降、透明质酸含量减少、皮肤含水率下降等。

黑果腺肋花楸(学名：Aronia melanocarpa(Michx.)Elliott)具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎抑菌等生理活性功能，其果实中的黄酮、花青素、多酚是已知植物中含量最高的，超过了蓝莓等，多糖含量也较高。黑果腺肋花楸提取物对治疗癌症、糖尿病和心脑血管等疾病有特效，同时，能够提高人体免疫力，调节血糖血脂，改善肝功能以及防治心血管疾病。

目前对眼部肌肤修复、抗皱、抗氧化等功能的眼霜普遍效果不明显，对紧致、抗皱、修复等功能需要长时间使用才能见效，况且眼部肌肤比较敏感脆弱，眼霜中含有的大量化学类物质原料容易引发皮肤过敏和肤感不适。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种经过植物乳杆菌发酵后的黑果腺肋花楸提取物纳米眼霜及制备方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种经过植物乳杆菌发酵后的黑果腺肋花楸提取物纳米眼霜，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌OPB15，其名称为：OPB15，分类名称为：植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，保藏编号为：CGMCC No.27735，保藏日期：2023年6月29日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

如上所述的黑果腺肋花楸提取物纳米眼霜的制备方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将活性多肽、人参皂苷、洋甘菊提取物、黑果腺肋花楸多糖、发酵后黑果腺肋花楸提取物与驼奶脂质体搅拌混合均匀，35±1℃孵育10±1分钟，持续搅拌；旋干水分，成蜂窝状膜，加入普洱茶提取物，溶解蜂窝状膜，超声10分钟，压力为2500psi，制得包载活性成分的驼奶脂质体；将包载活性成分的驼奶脂质体加热至70±1℃；

其中，活性多肽：人参皂苷：洋甘菊提取物：黑果腺肋花楸多糖：发酵后黑果腺肋花楸提取物：驼奶脂质体：普洱茶提取物的质量比为1：1：1：2：3：8：1；

(2)将阿拉伯胶和海藻酸钠加入水中，搅拌成混合均匀的凝胶基质，在70±1℃的条件下，将包载活性成分的驼奶脂质体加入凝胶基质，搅拌至均匀后再加入维生素C和维生素E；继续搅拌至均匀，保温10±1分钟，得混合物；

其中，阿拉伯胶：海藻酸钠：包载活性成分的驼奶脂质体：维生素C：维生素E的质量比为1：1：4：1：1；

(3)混合物的温度降至30-45℃，将透明质酸、海藻糖、茶树精油和丁香精油加入超纯水混合，搅拌至均匀，再加入步骤(2)制备得到的混合物中，摇匀静置至无沉淀，加超纯水和阿拉伯胶调节眼霜粘稠度，即得发酵后的黑果腺肋花楸提取物纳米眼霜；

其中，透明质酸：海藻糖：茶树精油：丁香精油：第一次添加的超纯水：步骤(2)制备得到的混合物的质量比为0.8：1：1：1：5：10。

进一步地，步骤(1)中普洱茶提取物的制备方法如下：

称取普洱茶，粉碎，烘干至质量不再变化，按液料比1：30加入超纯水，80℃加热回流1.5h，冷却后真空抽滤得滤液，滤渣重复提取三次，合并滤液，经预冻后放入冻干机冻干，12h后冻干成粉，即得普洱茶提取物。

进一步地，步骤(1)中洋甘菊提取物的制备方法如下：

称取洋甘菊的茎和叶，烘干至质量不再变化，打碎成粉，按液料比1：15加入超纯水，85℃加热回流3h，冷却后真空抽滤得滤液，滤渣重复提取三次，合并滤液，经预冻后放入冻干机冻干，12h后冻干成粉，即得洋甘菊提取物。

进一步地，步骤(1)中人参皂苷的制备方法如下：

称取人参，粉碎，烘干至质量不再变化，按液料比1：10加入超纯水，77℃加热回流3h，冷却后真空抽滤得滤液，滤渣重复提取三次，合并滤液，经预冻后放入冻干机冻干，12h后得人参皂苷干粉，即得人参皂苷提取物。

进一步地，步骤(1)中黑果腺肋花楸多糖的制备方法步骤如下：

1)取黑果腺肋花楸于滤纸斗中，把滤纸斗的开口处折起来封死，放入索氏提取器中，用乙醚54℃开始提取，直到提取其中的乙醚呈现澄清状态，取出包有黑果的滤纸并置于通风橱将剩余乙醚挥发殆尽；

2)通风橱中取出黑果后水提醇沉，温度77℃，90分钟，得滤液，滤渣重新提取一次，将两次滤液合并在一起，抽滤，取清液；浓缩，每15g黑果腺肋花楸浓缩至10ml，浓缩后92％乙醇醇沉过夜；离心7000rpm离心10分钟，弃去上层清液，沉淀物用乙醚和乙醇各洗涤2次，待溶剂挥干后用热水溶解；

3)后加入sevage试剂(氯仿：正丁醇的体积比为4：1)脱蛋白，然后摇床振荡30min，静置分蛋白，除去有机相和在水相和有机相之间的蛋白，共5到6次；用透析袋(MD44-10000)透析12h后，冻干得到黑果腺肋花楸多糖。

进一步地，步骤(1)发酵后黑果腺肋花楸提取物的制备方法如下：

取黑果腺肋花楸果实与黄豆，粉碎，烘干至不再变化，灭菌，加入无菌水至粘稠状，加入植物乳杆菌OPB15菌粉，摇匀，恒温培养箱中培养48h，取出，用5-10倍体积的乙醇浸泡，超声提取，离心，过滤后得到滤液，冷却至室温，滤渣重复用乙醇提取三次，合并滤液倒入圆底烧瓶并加5-10倍体积的乙醇，摇匀，0.45um滤膜滤过，取滤液，即得；

其中，黑果腺肋花楸果实：黄豆：植物乳杆菌OPB15菌粉的质量比为1：0.01：5。

进一步地，步骤(1)驼奶脂质体的制备方法如下：

先将骆驼奶于35±1℃孵育10±1分钟，并持续搅拌，再以薄膜分散法旋干水分，成蜂窝状膜，超声10±1分钟，压力为2500psi，制得驼奶脂质体。

进一步地，步骤(1)中活性多肽的制备方法如下：

取山核桃、小麦、豌豆、松花粉和桃仁，粉碎，加入水后调节pH值至弱碱性pH＝8.7±0.5，用碱溶酸沉法提取蛋白并冷冻干燥，蛋白酶酶解后8000rpm离心10分钟，上清液冷冻干燥，获得活性多肽提取物。

进一步地，所述茶树精油和丁香精油的作用为协同防腐作用，且均为植物源防腐剂。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明将发酵后黑果腺肋花楸活性成分运用到眼霜等眼周护肤品设计中，将黑果腺肋花楸活性物质与洋甘菊提取物，人参皂苷利用脂质体技术一起混合包载，优化筛选脂质体纳米技术工艺参数，将护肤效果发挥到极致。

2、本发明首次将黑果腺肋花楸多糖应用到化妆品当中来提高化妆品的抗氧化功效，本发明首次利用植物乳杆菌OPB15发酵产品，且发酵产品效果稳定良好，能够增强其抗氧化的功能，肤感极佳。

3、本发明使用的黑果腺肋花楸多糖有增强抗氧化功能。也是首次将黑果腺肋花楸多糖应用到化妆品当中。

4、本发明使用的黑果腺肋花楸能够有抗氧化，抗衰老，抗辐射，缓解视疲劳等功效。且发酵使用的植物乳杆菌OPB15在发酵过程中产生的有机酸能防止酚类物质的降解从而导致总酚含量的增加。发酵的产生的有机酸造成的酸性环境有利于酚类物质稳定。发酵中产生某些酶类，对黑果花楸细胞壁上的多糖和蛋白质进行了水解，进而释放出与其结合的酚类物质。增加其抗氧化能力。

5、本发明眼霜具有提升皮肤保湿、屏障功能、紧致眼部肌肤、缓解黑眼圈、改善皱纹、细纹的功效、减少水肿、保持皮肤清爽的作用。

6、本发明眼霜使用的是脂质体作为运载体。脂质体(liposomes)是将有效成分包封于类脂质双分子层内而形成的微型球状载体，溶性成分可包裹在磷脂的内水相，脂溶性成分可包裹在磷脂双分子层间。脂质体是纳米载药系统的典型代表，具有被动靶向性，保护药物被破坏，增加其稳定性和难溶性药物的溶解度，能使药物的释放速率加以控制并延长脂质体在体内的循环时间，提高药物的疗效。对皮肤敏感人群友好，且成品没有有害化学也类物质。

附图说明

图1为本发明中混合单糖对照品色谱图；

图2为本发明中黑果腺肋花楸多糖水解单糖色谱图；

图3为本发明中不同浓度NaIO

图4为本发明中标准品衍生后的气相色谱图；

图5为本发明中样品降解衍生后的气相色谱图；

图6为本发明中黑果腺肋花楸多糖

图7为本发明中黑果腺肋花楸多糖

图8为本发明中黑果腺肋花楸多糖的傅里叶红外图；

图9为本发明中不同分子量标准品所制的分子量标准曲线；

图10为本发明中黑果腺肋花楸多糖的示差色谱图；

图11为本发明中植物乳杆菌OPB15发酵黑果腺肋花楸果实固态发酵图；

图12为本发明中未经发酵的黑果腺肋花楸紫外和质谱图(+)；

图13为本发明中未经发酵的黑果腺肋花楸紫外和质谱图(-)；

图14为本发明中经植物乳杆菌OPB15发酵黑果腺肋花楸后的紫外和质谱图(+)；

图15为本发明中经植物乳杆菌OPB15发酵黑果腺肋花楸后的紫外和质谱图(-)；

图16为本发明中植物乳杆菌OPB15的菌落形态图；

图17为本发明中植物乳杆菌OPB15的显微镜图片；

图18为本发明中植物乳杆菌OPB15基因组序列BLAST结果距离树图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

具体实施例中所涉及的各种实验操作，均为本领域的常规技术，本文中没有特别注释的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。

如上所述的黑果腺肋花楸提取物纳米眼霜的制备方法，所述方法包括如下步骤：

其中，阿拉伯胶：海藻酸钠：包载活性成分的驼奶脂质体：维生素C：维生素E的质量比为1：1：4：1：1；

其中，透明质酸：海藻糖：茶树精油：丁香精油：第一次添加的超纯水：步骤(2)制备得到的混合物的质量比为0.8：1：1：1：5：10。

较优地，步骤(1)中普洱茶提取物的制备方法如下：

较优地，步骤(1)中洋甘菊提取物的制备方法如下：

较优地，步骤(1)中人参皂苷的制备方法如下：

较优地，步骤(1)中黑果腺肋花楸多糖的制备方法步骤如下：

较优地，步骤(1)发酵后黑果腺肋花楸提取物的制备方法如下：

其中，黑果腺肋花楸果实：黄豆：植物乳杆菌OPB15菌粉的质量比为1：0.01：5。

较优地，步骤(1)驼奶脂质体的制备方法如下：

先将骆驼奶于35±1℃孵育10±1分钟，并持续搅拌，再以薄膜分散法旋干水分，成蜂窝状膜，超声10±1分钟，压力为2500psi，制得驼奶脂质体。

较优地，步骤(1)中活性多肽的制备方法如下：

较优地，所述茶树精油和丁香精油的作用为协同防腐作用，且均为植物源防腐剂。

具体地，相关制备及检测如下：

对比例1

维生素C标准工作液：准确称取l0mg纯维生素C，充分溶解于1ml超纯水中，配成10mg/ml维生素C溶液，梯度稀释至20、15、10、6、2ug/ml的Vc标准工作液。

实施例1未发酵的黑果腺肋花楸提取物制备方法如下：

取一定量的黑果腺肋花楸与少量黄豆，粉碎，烘干至不再变化，灭菌，加入少量无菌水至粘稠状，加入适量植物乳杆菌OPB15菌粉，摇匀，立刻用5-10倍体积的乙醇浸泡，超声提取，离心，过滤后得到滤液，冷却至室温，滤渣重复用乙醇提取三次，合并滤液倒入圆底烧瓶加乙醇至刻度线，摇匀，0.45um滤膜滤过，取滤液，既得。其中，黑果腺肋花楸果实：黄豆：植物乳杆菌OPB15菌粉的质量比为1：0.01：5

实施例2发酵后黑果腺肋花楸提取物制备方法如下：

取与未发酵相同量的黑果腺肋花楸果实与少量黄豆，粉碎，烘干至不再变化，灭菌，加入少量无菌水至粘稠状，加入适量植物乳杆菌OPB15菌粉，摇匀恒温培养箱中培养48h，取出，立刻用5-10倍体积的乙醇浸泡，超声提取，离心，过滤后得到滤液，冷却至室温，滤渣重复用乙醇提取三次，合并滤液倒入圆底烧瓶并加5-10倍体积的乙醇，摇匀，0.45um滤膜滤过，取滤液，既得。其中，黑果腺肋花楸果实：黄豆：植物乳杆菌OPB15菌粉的质量比为1：0.01：5。

实施例3黑果腺肋花楸多糖的制备方法步骤如下：

1)取15g的黑果腺肋花楸于滤纸斗中，把滤纸斗的开口处折起来封死，放入索氏提取器中，用乙醚54℃。开始提取，直到提取其中的乙醚呈现澄清状态。取出包有黑果的滤纸通风橱将剩余乙醚挥发殆尽。

2)通风橱中取出黑果后水提醇沉。温度77℃，90分钟。得滤液，滤渣重新提取一次，将两次滤液合并在一起，抽滤，取清液。浓缩至10ml，92％乙醇醇沉过夜。7000rpm离心10分钟，弃去上层清液。沉淀物用乙醚和乙醇各洗涤2次，待溶剂挥干后用热水溶解。

3)后加入sevage试剂(氯仿：正丁醇＝4：1)脱蛋白，然后摇床30min左右，静置分蛋白，除去有机相和在水相和有机相之间的蛋白，共5到6次。用透析袋(MD44-10000)透析12h后冻干得到黑果多糖。

实施例4未发酵的黑果腺肋花楸纳米眼霜制备方法

(1)将活性多肽、人参皂苷、洋甘菊提取物、实施例3制得的黑果腺肋花楸多糖、实施例1制得的未发酵黑果腺肋花楸提取物与驼奶脂质体搅拌混合均匀，35℃左右孵育10分钟左右，持续搅拌。旋干水分，成蜂窝状膜，加入普洱茶提取物，溶解蜂窝状膜，超声10分钟，压力为2500psi，制得包载活性成分的驼奶脂质体。将包载活性成分的驼奶脂质体加热至70℃左右。其中，活性多肽：人参皂苷：洋甘菊提取物：实施例3制得的黑果腺肋花楸多糖：实施例1制得的未发酵黑果腺肋花楸提取物：驼奶脂质体：普洱茶提取物的质量比为1：1：1：2：3：8：1；

(2)按比例将阿拉伯胶和海藻酸钠加入水中，搅拌使成混合均匀的凝胶基质，在70℃左右的条件下，将包载活性成分的驼奶脂质体加入凝胶基质，搅拌至均匀后再加入维生素C和维生素E。继续搅拌至均匀，保温10分钟左右，得混合物；其中，阿拉伯胶、海藻酸钠、包载活性成分的驼奶脂质体、维生素C和E的质量比为1：1：4：1：1；

(3)混合物温度降至30-45℃，将透明质酸、海藻糖、茶树精油和丁香精油加入超纯水混合，搅拌至均匀，再加入步骤(2)制备得到的混合物中，摇匀静置至无沉淀，加适量超纯水和阿拉伯胶调节眼霜粘稠度，即得未发酵的黑果腺肋花楸纳米眼霜。其中，透明质酸：海藻糖：茶树精油：丁香精油：第一次添加的超纯水：步骤(2)制备得到的混合物的质量比为0.8：1：1：1：5：10。

其中，步骤(1)中普洱茶提取物的制备方法如下：

称取普洱茶，粉碎，烘干至质量不再变化，液料比1：30加入超纯水，80℃加热回流1.5h，冷却后真空抽滤得滤液，滤渣重复提取三次，合并滤液，经预冻后放入冻干机冻干，12h后冻干成粉，即得普洱茶提取物。

步骤(1)中洋甘菊提取物的制备方法如下：

称取洋甘菊的茎和叶，烘干至质量不再变化，打碎成粉，液料比1：15加入超纯水，85℃加热回流3h，冷却后真空抽滤得滤液，滤渣重复提取三次，合并滤液，经预冻后放入冻干机冻干，12h后冻干成粉，即得洋甘菊提取物。

步骤(1)中人参皂苷的制备方法如下：

称取适量人参，粉碎，烘干至质量不再变化，液料比1：10加入超纯水，77℃加热回流3h，冷却后真空抽滤得滤液，滤渣重复提取三次，合并滤液，经预冻后放入冻干机冻干，12h后得人参皂苷干粉，即得人参皂苷提取物。

步骤(1)驼奶脂质体的制备方法如下：

先将驼奶于35℃左右孵育10分钟左右并持续搅拌在以薄膜分散法旋干水分，成蜂窝状膜，超声10分钟左右，压力为2500psi，制得驼奶脂质体。

所述驼奶脂质体在与其他活性成分混合前，以蒸馏水稀释10-100倍。

步骤(1)中地活性多肽制备方法如下：

取一定量的山核桃、小麦、豌豆、松花粉和桃仁，粉碎，加入水后调节pH值至弱碱性(pH＝8.7左右)，用碱溶酸沉法提取蛋白并冷冻干燥，经蛋白酶酶解后8000rpm离心10分钟，上清液冷冻干燥，获得活性多肽提取物。

所述茶树精油和丁香精油的作用为防腐且均为植物源防腐剂。

实施例5发酵后的黑果腺肋花楸纳米眼霜制备方法：

(1)将活性多肽、人参皂苷、洋甘菊提取物、实施例3制得的黑果腺肋花楸多糖、实施例2制得的发酵后黑果腺肋花楸提取物与驼奶脂质体搅拌混合均匀，35℃左右孵育10分钟左右，持续搅拌。旋干水分，成蜂窝状膜，加入普洱茶提取物，溶解蜂窝状膜，超声10分钟，压力为2500psi，制得包载活性成分的驼奶脂质体。将包载活性成分的驼奶脂质体加热至70℃左右。其中，活性多肽：人参皂苷：洋甘菊提取物：实施例3制得的黑果腺肋花楸多糖：实施例2制得的发酵后黑果腺肋花楸提取物：驼奶脂质体：普洱茶提取物的质量比为1：1：1：2：3：8：1；

(3)温度降至30-45℃，将透明质酸、海藻糖、茶树精油和丁香精油加入超纯水混合，搅拌至均匀，再加入步骤(2)制备得到的混合物中，摇匀静置至无沉淀，加适量超纯水和阿拉伯胶调节眼霜粘稠度，即得发酵后的黑果腺肋花楸纳米眼霜。其中，透明质酸：海藻糖：茶树精油：丁香精油：第一次添加的超纯水：步骤(2)制备得到的混合物的质量比为0.8：1：1：1：5：10。

步骤(1)中普洱茶提取物的制备方法如下：

步骤(1)中洋甘菊提取物的制备方法如下：

步骤(1)中人参皂苷的制备方法如下：

步骤(1)驼奶脂质体的制备方法如下：

先将驼奶于35℃左右孵育10分钟左右并持续搅拌在以薄膜分散法旋干水分，成蜂窝状膜，超声10分钟左右，压力为2500psi，制得驼奶脂质体。

所述驼奶脂质体在与其他活性成分混合前，以蒸馏水稀释10-100倍。

步骤(1)中地活性多肽制备方法如下：

取一定量的山核桃、小麦、豌豆、松花粉和桃仁，粉碎，加入水后调节pH值至弱碱性pH＝8.7左右，用碱溶酸沉法提取蛋白并冷冻干燥，经蛋白酶酶解后8000rpm离心10分钟，上清液冷冻干燥，获得活性多肽提取物。

所述茶树精油和丁香精油的作用为防腐且均为植物源防腐剂。

实施例6黑果腺肋花楸多糖结构

(1)单糖组成测定

1)对照品衍生化：吸取混合单糖(甘露糖、鼠李糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖，质量比为1：1：1：1：1：1：1：1)溶液400ul置螺帽试管中，依次加入0.3mol/L的氢氧化钠400ul和0.5mol/L的PMP溶液400ul，密封，混匀置于70℃的水浴锅中70min后取出，冷却至室温，加入0.3mol/L的盐酸400ul调节溶液至中性，混匀，加入1mL的三氯甲烷萃取三次除PMP，取水层，0.45um滤膜过滤。

2)黑果腺肋花楸多糖的水解：将实施例3制得的黑果腺肋花楸多糖溶解后置于螺口瓶中，加入1mL三氟乙酸，混匀于120℃水解4.5h。水解后取出放冷。在80℃水浴蒸干，后加入1mL甲醇在蒸干以去除三氟乙酸。此步骤重复三次。残渣加热水溶解。

3)多糖PMP衍生化同对照品衍生化：吸取实施例3制得的黑果腺肋花楸多糖的水解液400ul置螺帽试管中，依次加入0.3mol/L的氢氧化钠400ul和0.5mol/L的PMP溶液400ul，密封，混匀置于70℃的水浴锅中70min后取出，冷却至室温，加入0.3mol/L的盐酸400ul调节溶液至中性，混匀，加入1mL的三氯甲烷萃取三次除PMP，取水层，0.45um滤膜过滤。

4)色谱条件：InertSustain C18色谱柱(4.6×250mm，5um)。流动相乙腈-0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH＝6.8)，流速1mL/min，检测波长254nm，柱温35，进样量10ul。

结论：黑果有八种单糖色谱峰分别为甘露糖、鼠李糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖(如图1、2所示)。外标法以峰面积计算各单糖的摩尔比，各糖的摩尔比为：1.93：0.87：0.86：1.99：27.27：3.36：1.75：1.48。

(2)高碘酸氧化和Smith降解

1)标准曲线建立：配置30mmol/LNaIO4现配现用锡纸包好避光，取6支干燥的试管，依次加入30mmol/LNaIO4溶液0、0.5、1、1.5、2、4mL，将各个试管混合摇匀，每管取0.1mL至25ml的容量瓶中，定容，在223nm处测OD值。横坐标为浓度，纵坐标为吸光度，绘制标准曲线(如图3)。

2)高碘酸氧化：称取12.5mg的实施例3用12.5ml的超纯水溶解，放入25ml的容量瓶中，加入浓度为15mmol/L的NaIO

3)终止反应：等OD值不再变化时向反应体系中加入2ml的乙二醇终止反应。并静置20min。用移液器取出2ml反应液，以酚酞作指示剂用0.01mol/L的NaOH标准液滴定甲酸释放量。剩下的转移至透析袋(3000Da)透析。

4)Smith降解：透析60h，4小时换一次水，透析后减压浓缩至10mL左右，加入70mg的硼氢化钠，混匀避光反应24小时。待上述反应完成后，滴加50％醋酸溶液(v/v)使其PH调整为5-7，超纯水透析60h，尽量4h换一次水，透析后将透析液减压蒸干。加入10mg盐酸羟胺和1mL的吡啶，于90°水浴震荡反应30min，直至沉淀消失。冷却至室温后加入醋酸酐1mL，再90°水浴震荡反应30min，取出冷却至室温，最终生成具有挥发性的糖腈乙酸酯衍生物，加入1mL三氯甲烷后0.22um过膜，进行GC分析(如图4、5)。

结论：1mol六碳糖消耗了1.42mol高碘酸产生0.6493甲酸说明含有64.93％的1→或1→6键(邻三羟基)，12.14％的1→2，1→2.6，1→4或1→2.4糖苷键(邻二羟基)和22.93％的1→3，1→3.4，1→3.6，1→2.4，1→2.3，1→2.3.4糖苷键(及不含邻三羟基也不含邻二羟基)。

黑果花楸经Smith降解后的产物有甘油、赤藓醇，乙二醇。表明存在大量的1→6、1→、1→2、1→2,6、1→4或1→4,6糖苷键；

产物中含有少量甘露糖和葡萄糖，说明黑果花楸中含有不被氧化的1→3、1→2,3、1→3,6、1→2,4、1→2,3,4糖苷键；甘露糖与葡萄糖的存在说明甘露糖与葡萄糖中含有不被氧化的糖苷键，降解产物中检出鼠李糖，说明部分鼠李糖未被高碘酸氧化，推断出黑果花楸中有一部分连接键为1→2或1→2,6；Smith降解产物中检出半乳糖，说明黑果中含有1→3、1→2,3、1→2,4、1→3,4、1→3,6或1→2,3,4糖苷键，即半乳糖残基。

(3)核磁共振测定

称取15mg实施例3制得的黑果腺肋花楸多糖样品溶于1mLD

结论：与其他天然成分相比，糖类在

糖类在

(4)傅里叶红外测定

取实施例3制得的黑果腺肋花楸多糖与干燥的KBr按照质量1：100混合，充分研磨，压片，在红外4000～400cm

结论：在3415cm

(5)黑果腺肋花楸多糖分子量的测定

色谱条件：本实验采用高效凝胶渗透色谱法测定黑果腺肋花楸多糖的分子量分布，所用的色谱柱为TSK-GEL G4000 PWXL凝胶柱(7.8mm×30.0cm)。所用流动相为超纯水；流速为0.8mL/min；柱温为35℃；所用检测器为示差折光检测器。

分子量校正标准曲线建立：将不同分子量的葡聚糖标准品用流动相配成1.0mg/mL的标准液，进样量1g/L。制分子量标准曲线(图9)。

进样1g/L黑果腺肋花楸多糖溶液得出保留时间(图10)，算出其保留时间，带入标曲公式得出分子量为Mr＝10876Da。

实施例7：植物乳杆菌OPB15的筛选

(一)乳杆菌的分离筛选

(1)取0.1ml酸奶样品(取自喀什地区喀什市阿瓦提乡牧民家中自酿酸奶)接种于脱脂乳培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养48h。用接种环挑取少许菌液，划线接种于MRS琼脂培养基平皿中。

(2)48小时后，根据菌落的形状，大小，颜色等，用接种环挑取不同的菌落进行划线分离纯化。

(3)经过革兰氏染色和过氧化氢酶分析，保留革兰氏染色阳性杆菌和过氧化氢酶阴性菌。

(4)获取最终菌株的菌体及菌落特征：革兰氏阳性杆状细菌，不形成孢子，非运动性的细菌(图16)；直径约1.0～1.2mm，正面圆形，中央凸起，边缘整齐，表面湿润光滑，乳白色，不透明，稍有酸味(图17)。

(二)乳杆菌的分子生物学鉴定

(1)单菌基因组抽提

(A)将所筛选得到的乳杆菌培养过夜；

(B)使用索莱宝细菌基因组DNA提取试剂盒，货号1600，取培养过夜的菌悬液1ml于1.5ml离心管中，12000r/min离心1min，尽量吸出上清；

(C)向菌体中加入200ul终浓度为20mg/ml的溶菌酶，37℃处理40min；

(D)向(C)步骤中所得混合液加入溶液A(10mmol/L、pH＝8.0的Tris-HCl和1mmol/L的EDTA混合液，浓度为0.08g/mL的SDS，浓度为1.5mol/L的NaCl)，用移液器吹打使菌体充分悬浮，向悬浮液中加入20ul的rRNaseA(10mg/ml)，充分颠倒混匀，室温静置30min；

(E)向管中加入20ul的蛋白酶K，充分混匀，55℃消化60min；消化期间颠倒离心管数次，直至样品呈清亮粘稠状，证明样品消化完全；

(F)向问管中加入200ul溶液B(体积比为酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1的混合液)，充分颠倒混匀，如出现白色沉淀，可于75℃放置15-30min，沉淀会消失；

(G)向管中加入200ul无水乙醇，充分混匀，此时还可能会出现絮状沉淀，不影响DNA的提取，将溶液跟絮状沉淀都加入到吸附柱中，静置2min；

(H)12000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱放入收集管中；

(I)向吸附柱中加入600ul漂洗液(75％乙醇)，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中，重复一次；

(J)12000rpm离心2min，将吸附柱敞口置于50℃温箱放置数分钟；

(K)将吸附柱放到灭菌后的1.5ml离心管中，向吸附膜中央悬空滴加100ul经65℃水浴预热的脱洗液(通用)，室温放置5min，12000rpm离心1min；

(L)离心所得洗脱液再加入到吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心2min，即可得到该乳杆菌的基因组DNA。

TTAGGCGGCTGGTTCCTAAAAGGTTACCCCACCGACTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATGGCTTTAAGAGATTAGCTTACTCTCGCGAGTTCGCAACTCGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACCAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTGATAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTATCCATGTCCCCGAAGGGAACGTCTAATCTCTTAGATTTGCATAGTATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCATTCATCGTTTACGGTATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTACCCATACTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTTCCGATGCACTTCTTCGGTTGAGCCGAAAGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTAGCCGTGGCTTTCTGGTAATACCGTCATACCTGAACAGTTACTCTCAGATATGTTCTTCTTTAACAACNGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCTCACTGCTATACATGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTCGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAACTCAAGGAATTGACGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGACCTTACCNNTCTGACATACTATGCAAATCTAGAGAT

(2)16S r DNA PCR

细菌16S r DNA 50μLPCR反应体系：Taq酶24μL；dd H

PCR条件：94℃5min(即step1)；94℃30s(即step2)；55℃30s(即step3)；72℃30s(即step4)；step2至4 30×；72℃5min。

制备1％琼脂糖凝胶，之后将PCR产物与10000×loading buffer混合，上样量2μL，120V跑30min，然后进行凝胶成像；

将得到PCR产物送专业测序公司，将得到的测序结果与使用BLAST在Gen Bank中进行搜索和相似性比对(见图18)，将其鉴定为植物乳杆菌的菌株，-80℃保存。

实施例8：植物乳杆菌OPB15对模拟胃肠液具有良好的耐受性

体外模拟胃液：将0.1mol/L磷酸钾缓冲液的pH值调至2.5，加入胃蛋白酶(10g/L)，混合均匀后过0.22μm无菌膜，即可得到模拟胃液。

体外模拟肠液：将0.1mol/L磷酸钾缓冲液的pH值调至6.8，加入胰酶(10g/L)，猪胆盐(3g/L)，混合均匀后过0.22μm无菌膜，即可得到模拟肠液。

模拟胃消化：

取3.0mL植物乳杆菌OPB15的培养液离心3min，收集菌丝体，置于3.0mL pH值2.5模拟胃液环境中，37℃、90r/min厌氧条件下模拟胃液消化。于0、1.0、2.0、3.0h时取样，采用稀释涂布平板计数法对活菌进行计数，并计算存活率。

模拟肠消化：

取3.0mL植物乳杆菌OPB15的培养液离心3min，收集菌丝体，置于3.0mL pH值为6.8模拟肠液环境中，37℃、120r/min厌氧条件下模拟肠液消化。于0、2.0、4.0、6.0、8.0h时取样，采用稀释涂布平板计数法对活菌进行计数，并计算存活率。

存活率(％)以该培养液中在取样时的活菌数与在第0h时活菌数之比计算，以％表示。实验结果如表1所示，结果表明，植物乳杆菌OPB15对人工模拟胃肠液具有较好的耐受能力。

表1植物乳杆菌OPB15在人工模拟胃液中的耐受能力

表2植物乳杆菌OPB15在人工模拟肠液中的耐受能力

实施例9：植物乳杆菌OPB15对SFP级Balb/c小鼠无毒副作用

将植物乳杆菌OPB15菌体重悬于100g/L的脱脂乳溶液中，制成浓度为4.0×10

这些试验结果列于表3中。这些结果表明，喂食浓度1.2×10

表3小鼠体重变化及死亡情况