一种信号放大的免疫层析检测试纸及其制备方法、检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及免疫层析技术领域，尤其涉及一种信号放大的免疫层析检测试纸，以及试纸的制备方法，和检测试剂盒及对应的检测方法。

背景技术

目前抗原常用的检测技术有：胶体金法、酶联免疫法(ELISA)、荧光免疫层析、化学发光法等。胶体金法是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PNA、ConA等；ELISA已成为目前分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术；荧光免疫层析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术，以固定有检测线(包被抗体或包被抗原)和质控线(抗抗体)的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，荧光标记抗体或抗原固定于连接垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动；化学发光法是利用化学发光测定化学发光反应物、催化剂、增敏剂、抑制剂，偶合反应中的反应物、催化剂、增敏剂的方法。

发明内容

本发明主要是解决现有技术所存在的技术问题，从而提供一种信号放大的免疫层析检测试纸盒检测装置，可以提高免疫层析平台检测的特异性和灵敏度。

本发明的上述技术问题主要是通过下述技术方案得以解决的：一种信号放大的免疫层析检测试纸，包括结合垫一、结合垫二、包被C线和T线的硝酸纤维素膜、吸样垫和底板，所述结合垫一、结合垫二、包被C线和T线的硝酸纤维素膜、吸样垫依次放置于底板上，结合垫二的头部与结合垫一的尾部重叠，硝酸纤维素膜的头部与结合垫二的尾部重叠，吸样垫的头部与硝酸纤维素膜的尾部重叠；

其中结合垫一固定有待检测抗原的抗体A偶联氧化葡聚糖；

结合垫二固定有ConA-偶联量子点荧光微球，以及抗DNP抗体偶联量子点荧光微球；

T线包被有待检测抗原的抗体B；

C线包被有DNP。

优选的，所述底板为PVC。

优选的，所述结合垫一、结合垫二采用玻璃纤维、无纺布或滤纸制成。

优选的，所述吸样垫为滤纸。

优选的，所述氧化葡聚糖为葡聚糖经高碘酸钠氧化而成。

优选的，所述抗体A偶联氧化葡聚糖为氧化葡聚糖与抗体A混合后，加入NaCNBH3反应，再加入乙二胺反应，然后加入NaBH4还原而成。

本发明还公开了一种信号放大的免疫层析检测试剂盒，包括上述的免疫层析检测试纸，以及卡盒，所述试纸置于卡盒内，卡盒在试纸的结合垫一对应部位露出加样孔，在试纸的结合垫二对应部位露出稀释液添加孔，在试纸的硝酸纤维素膜包被C线和T线对应部位露出观察窗。

本发明还公开了上述信号放大的免疫层析检测试纸的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1、制备结合垫一

1.2葡聚糖氧化：用高碘酸钠氧化葡聚糖，反应后加入过量乙二醇终止氧化反应，透析获得氧化葡聚糖；

1.2氧化葡聚糖偶联抗体：氧化葡聚糖与抗目标抗原的抗体A混合反应后，用NaCNBH

1.3结合垫一制备：将上一步获得的氧化葡聚糖偶联抗体固定到玻璃纤维垫上，制得结合垫一；

2、制备结合垫二

2.1ConA/抗DNP抗体偶联量子点荧光微球：量子点荧光微球活化后，加入ConA或抗DNP抗体进行偶联反应，然后封闭，备用；

2.2结合垫二制备：将ConA偶联量子点荧光微球以及抗DNP抗体偶联量子点荧光微球固定到玻璃纤维垫上，制得结合垫二；

3、制备包被C线和T线的硝酸纤维素膜

3.1用包被缓冲液稀释抗目标抗原的抗体B，获得T线抗体；

3.2用包被缓冲液稀释DNP-BSA，获得C线抗体；

3.3将C线抗体、T线抗体分别包被在硝酸纤维素膜上，干燥，获得包被C线和T线的硝酸纤维素膜；

4、组装

将结合垫一、结合垫二、包被C线和T线的硝酸纤维素膜、吸样垫依次放置于底板上，结合垫二的头部与结合垫一的尾部重叠，硝酸纤维素膜的头部与结合垫二的尾部重叠，吸样垫的头部与硝酸纤维素膜的尾部重叠，获得量子点荧光免疫层析检测试纸。

优选的，步骤1.1葡聚糖氧化具体为：用pH7.0的20mmol/L磷酸缓冲液溶解一定量的葡聚糖，并配置100mg/mL的高碘酸钠水溶液，将高碘酸钠水溶液加入上述葡聚糖溶液中，使NaIO

优选的，步骤1.2氧化葡聚糖偶联抗体具体为氧化葡聚糖与抗目标抗原的抗体A混合反应2小时后，用NaCNBH

优选的，步骤2.1ConA/抗DNP抗体偶联量子点荧光微球具体为：取量子点荧光微球加MES，离心后加入少量MES超声重悬，然后先加入NHS混匀后再加EDC，活化反应时间不小于半小时，加MES，离心，去上清，再依次用LMES、缓冲液超声清洗后，加缓冲液重悬，然后加入Con-A或抗DNP抗体开始偶联反应，再加入甘氨酸和乙醇胺，加入BSA封闭，用PBST清洗后，加保存液清洗，用保存液重悬保存。

优选的，步骤3.1中用包被缓冲液将抗目标抗原的抗体B稀释至1.0～2.0mg/mL。

优选的，步骤3.2中用包被缓冲液将DNP-BSA稀释至1.0～2.0mg/mL。

本发明还公开了一种信号放大的量子点荧光免疫层析检测方法，基于上述的免疫层析检测试剂盒进行，其特征在于其步骤包括：

(1)打开量子点荧光免疫分析仪；

(2)取50μL待测样品滴加到免疫层析试纸条的加样孔，5～10min后取100μL稀释液滴加到稀释液添加孔。

(3)继续孵育10～15min，将试剂盒放入量子点荧光免疫分析仪中读取检测结果。

本发明的伴刀豆球蛋白与葡萄糖反应信号放大的荧光免疫检测方法技术路线为：首先将某一特定抗原特异的抗体A与氧化葡聚糖偶联，固定在结合垫一上；分别将伴刀豆球蛋白(ConA)与量子点荧光微球偶联，抗DNP抗体与量子点荧光微球偶联，将两种量子点荧光标记物混合后固定在结合垫二上；然后将另一种针对此抗原的抗体B包被于硝酸纤维素膜的特定区带形成检测线(T线)，将DNP-BSA包被于硝酸纤维素膜的特定区带形成质控线(C线)，与T线平行，组装和制备量子点荧光免疫层析试纸。在结合垫一处加入样品后，偶联氧化葡聚糖的抗体A就会与样品中的抗原反应，生成抗原-抗体A-氧化葡聚糖的复合物，继续向前移动，经过结合垫二时，该复合物上的氧化葡聚糖就会与ConA-量子点荧光复合物结合，形成抗原-抗体A-氧化葡聚糖-ConA-量子点荧光复合物。此时在结合垫二处加入稀释液，样品在稀释液的作用下，继续向前移动，层析到固定有另一抗体B的T线区域时，样品中的抗原就会与这一抗体B发生反应，最后生成抗体B-抗原-抗体A-氧化葡聚糖-ConA-量子点荧光复合物，若样品中无待检抗原，则T线处不会形成荧光复合物；样品继续向前移动，无论样品中是否含有待测抗原，标记量子点荧光的抗DNP抗体均会与C线包被的DNP-BSA结合。C、T线的信号强度可以用配套的量子点荧光免疫分析仪读取，并根据SD卡中预先设定好的标准曲线计算出样品浓度，给出定量检测结果。该技术由于引入了葡聚糖、ConA系统，ConA为四聚体球蛋白，每个亚基含1个糖结合部位，每个ConA有4个糖结合部位，从而增强检测信号，实现信号放大，提高检测灵敏度。适于多种产品种类的检测，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明的信号放大的免疫层析检测试纸的结构示意图。

图2为本发明的免疫层析检测试剂盒。

图3为白介素-6试剂盒检测结果的回归方程。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的优选实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

所用试剂或仪器，未特别注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1：葡聚糖氧化

用pH7.0的20mmol/L磷酸缓冲液溶解一定量的葡聚糖，并配置100mg/mL的高碘酸钠水溶液(避光)。将一定量高碘酸钠水溶液加入上述葡聚糖溶液中，使NaIO

实施例2：氧化葡聚糖偶联抗体A

氧化葡聚糖与抗体按1:1的摩尔比混合，4℃反应2小时，加入蛋白浓度10倍摩尔量的NaCNBH

实施例3：结合垫一制备

将实施例2中的偶联物用结合垫固定液稀释到0.02～0.04mg/mL固定在玻璃纤维垫上，置于37℃烘箱中干燥24h。结合垫固定液为pH＝7.2-7.4的50mMPB缓冲液，含0.5％吐温-20，0.5％PVPK-30,5％蔗糖，1％casein-Na，2％蛋白保护剂，0.02％PC-300。

实施例4：伴刀豆球蛋白(ConA)偶联量子点荧光微球

①量子点荧光微球BUFF更换：取10mg量子点荧光微球，加满MES缓冲液pH5.5-6.0离心(200nm14000rpm30min，120nm，20000rpm30min)。加入200μLMES超声重悬，待用。

②活化：每10mg量子点荧光微球加入0.5～1mgEDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、0.6mgNHS(N-羟基琥珀酰亚胺)(先加NHS混合后再加EDC，大量活化EDC必须滴加，边滴边搅拌)，大量反应EDC可以更少。以10mg量子点荧光微球为例，补MES定容到400-500μL体积，37度旋转反应1hr左右(转速40-60rpm)。

③清洗：活化结束后，加满MES缓冲液，离心(14000rpm30min)，去上清，加入200μLMES超声重悬，重复一次，加入50mMHEPES(以下皆为50mM)pH8.0超声重悬，补满HEPES离心，加HEPES重悬后待用。

④偶联：加入0.1～0.5mgConA，定容至400～500μL，混匀后37度反应3hr。

⑤封闭1：加入2M甘氨酸70μL和1M乙醇胺140μL37度封闭1hr。

⑥封闭2：加入200μL200mg/mLBSA，4度过夜封闭。

⑦清洗：加入PBST清洗两次，加缓冲液清洗一次后定容至3-4mL左右保存待用。

实施例5：抗DNP抗体偶联量子点荧光微球

①量子点荧光微球BUFF更换：取10mg量子点荧光微球，加满MES pH5.5-6.0离心(200nm14000rpm30min，120nm，,20000rpm30min)。加入200μLMES超声重悬，待用。

②活化：每10mg量子点荧光微球加入0.5～1mgEDC0.6mgNHS(先加NHS混下后再加EDC)，大量反应EDC可以更少。以10mg量子点荧光微球为例，补MES定容到400-500μL体积，37度旋转反应1hr左右(转速40-60rpm)。

③清洗：活化结束后，加满MES，离心(14000rpm30min)，去上清，加入200μLMES超声重悬，重复一次，加入50mMHEPES(以下皆为50mM)pH8.0超声重悬，补满HEPES离心，加HEPES重悬后待用。

④偶联：加入0.1～0.5mg抗体，定容至400～500μL，混匀后37度反应3hr。

⑤封闭1：加入2M甘氨酸70μL和1M乙醇胺140μL37度封闭1hr。

⑥封闭2：加入200μL200mg/mlBSA，4度过夜封闭。

⑦清洗：加入PBST清洗两次，加缓冲液清洗一次后定容至3-4mL左右保存待用。

实施例6：结合垫二制备

将实施例4、实施例5中的偶联物混合，用结合垫固定液稀释，终浓度均为0.02～0.04mg/mL，固定在玻璃纤维垫上，置于37℃烘箱中干燥24h。结合垫固定液为pH＝7.2-7.4的50mMPB缓冲液，含0.5％吐温-20，0.5％PVPK-30,5％蔗糖，1％casein-Na，2％蛋白保护剂，0.02％PC-300。

实施例7：包被C线和T线的硝酸纤维素膜制备

用包被缓冲液将抗体B稀释至1.0～2.0mg/mL；C线划线液配制：用包被缓冲液将DNP-BSA稀释至1.0～2.0mg/mL；所述包被缓冲液为10mMPB，含1％蔗糖。采用喷金划膜仪，将C线抗体、T线抗体分别包被在固定于底板上的硝酸纤维素膜上；将划好的大板置于鼓风干燥箱中37℃干燥24h，裁成所需尺寸。

实施例8：组装

如图1所示，将结合垫一1、结合垫二2、包被C线3和T线4的硝酸纤维素膜5、吸样垫6依次放置于底板7上，结合垫二的头部与结合垫一的尾部重叠，硝酸纤维素膜的头部与结合垫二的尾部重叠，吸样垫的头部与硝酸纤维素膜的尾部重叠。底板选用PVC，吸样垫选用吸水性良好的滤纸，完成量子点荧光免疫层析检测试纸的制备。

如图2所示，将组装后的试纸装入卡盒8内，在试纸的结合垫一对应部位露出加样孔9和稀释液添加孔10，在试纸的硝酸纤维素膜包被C线和T线对应部位露出观察窗11，完成量子点荧光免疫层析检测装置的制备。

实施例9：白介素-6试剂盒检测结果

采用以上实施例1-8的方法制备白介素-6检测试剂盒，取50μL标准样本滴加到免疫层析试纸条的加样孔9，5～10min后取100μL稀释液滴加到稀释液添加孔10，继续孵育10～15min，将试剂盒放入量子点荧光免疫分析仪中读取检测结果。测试结果见表1。以浓度为横坐标，信号值(T/C)为纵坐标，进行4参数Logistic曲线拟合，R2值为0.999，回归曲线见图3，回归方程为：

方程:y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D

其中：

A ＝ 88.76990

B ＝ -1.01141

C ＝ 3719.90518

D ＝ 0.35346

r^2＝0.99908。

表1白介素-6试剂盒标准样本测试结果