缩合单宁在制备鲈鱼黄曲霉毒素中毒治疗药物、制剂或饲料中的应用

技术领域

本发明涉及水产养殖领域，具体涉及缩合单宁在制备鲈鱼黄曲霉毒素中毒治疗药物、制剂或饲料中的应用。

背景技术

黄曲霉毒素是由黄曲霉和寄生曲霉产生的一类毒性极强、可致突变和致癌的物质。产毒黄曲霉菌可产生黄曲霉毒素B1和B2，产毒寄生曲霉菌可产生黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2。通常动物中毒的后果表现为生长缓慢、贫血、产生血液凝块、淤血、肝脏及一些器官受损、免疫功能降低、死亡率增加。大豆、小麦、玉米等原料是鱼类饲料的主要成分，也是可能携带黄曲霉毒素较多的植物源性饲料原料，如玉米中最高可含有6000μg/kg的黄曲霉毒素。此外，饲料在湿热环境下(尤其是南方)保存也很容易霉变而产生黄曲霉毒素，因此黄曲霉毒素传染到鱼类的可能性较大。

相关技术中，检测所有与真菌毒素有关的原料是现行的预防水产动物黄曲霉毒素中毒的唯一方法，由于鱼苗对黄曲霉毒素的敏感性较高，因此，对检测精度的要求极高，所以导致在预防水产动物黄曲霉毒素中毒的前期工作中会耗费大量的人力物力，成本极高。

因此，急需开发一种能够直接起到预防及治疗水产动物黄曲霉毒素中毒的制剂，以减少大量的前期工作，提高水产养殖的安全性，降低损失。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出缩合单宁在制备水产动物黄曲霉毒素中毒治疗药物或制剂中的应用，通过在饲料或其他制剂中加入 0.1％～0.2％的缩合单宁，从而有效缓解或治疗水产动物黄曲霉毒素中毒。

本发明的第一个方面，提供缩合单宁在制备水产动物黄曲霉毒素中毒治疗药物或制剂中的应用。

在一些具体实施方式中，上述缩合单宁的结构式如式I所示：

式I中，n取自大于等于14的任意整数；

R基团为羟基(-OH)或氢基(-H)，包括顺式cis和反式trans两种结构。

根据R基团的选择，式I中的重复单元可以包括儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素或表没食子儿茶素中的一种或多种。

根据本发明的第一个方面，在一种具体实施方式中，至少具有以下有益效果：

本发明公开了0.1％～0.2％的缩合单宁能够有效治疗或缓解黄曲霉毒素对鲈鱼肝脏及肠道的伤害，从而避免鲈鱼因黄曲霉毒素中毒导致的营养不良、生长缓慢等问题，提高鲈鱼黄曲霉毒素中毒后的生存率，降低水产养殖中黄曲霉毒素对养殖业的危害和经济损失。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些优选的实施方式中，所述缩合单宁来源于植物，所述植物包括紫色达利菊、酿酒葡萄渣、柱花草中的一种或多种。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些优选的实施方式中，式I中，n取自14、15 或17，使式I中的化合物的聚合度达到17、18或20。

在本发明的一些更优选的实施方式中，缩合单宁的聚合度为17。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些优选的实施方式中，上述缩合单宁中原花青定单宁：原翠雀定单宁的质量比大于3.3。

在本发明的一些更优选的实施方式中，上述缩合单宁中原花青定单宁：原翠雀定单宁的质量比大于4.2。

在本发明的一些优选的实施方式中，上述缩合单宁中延伸单元表儿茶素含量大于62.3％。

在本发明的一些更优选的实施方式中，上述缩合单宁中延伸单元表儿茶素含量大于 68.8％。

在本发明的一些优选的实施方式中，上述缩合单宁中延伸单元表没食子儿茶素含量大于 23.5％。

在本发明的一些更优选的实施方式中，上述缩合单宁中延伸单元表没食子儿茶素含量大于28.0％。

在本发明的一些优选的实施方式中，上述缩合单宁的分子量为1～20kDa。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些优选的实施方式中，上述水产动物黄曲霉毒素中毒治疗药物、制剂或饲料中的缩合单宁的质量浓度小于0.3％。

在本发明的一些优选的实施方式中，上述水产动物黄曲霉毒素中毒治疗药物、制剂或饲料中的缩合单宁的质量浓度为0.1％～0.2％。

在本发明的一些更优选的实施方式中，上述水产动物黄曲霉毒素中毒治疗药物、制剂或饲料中的缩合单宁的质量浓度为0.2％。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些优选的实施方式中，上述黄曲霉毒素包括黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2、GM、P1、Q1、黄曲霉毒素毒醇及其衍生物。

在本发明的一些更优选的实施方式中，上述黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1。

本发明的第二个方面，提供一种水产饲料，该水产饲料中含有进口鱼粉、豆粕、菜籽粕、面粉、磷酸二氢钙、豆油、鱼油、大豆卵磷脂、维生素预混料、矿物质预混料、VC磷酸酯、氯化胆碱、甜菜碱、赖氨酸、蛋氨酸、微晶纤维素和缩合单宁。

其中，维生素预混料中含有VA、VB、VD、VE、VK、泛酸钙、肌醇或生物素中的至少一种；矿物质预混料中含有镁、钙、碘、钾、铜、锌、铁、钴或硒元素中的至少一种。

在本发明的一些优选的实施方式中，上述维生素预混料中含有VA，VB

根据本发明的第二个方面，在本发明的一些优选的实施方式中，按质量份计，上述水产饲料中含有进口鱼粉25～30份、豆粕25～28份、菜籽粕8～12份、面粉25～30份、磷酸二氢钙1～2份、豆油1～4份、鱼油1～3份、大豆卵磷脂1～3份、维生素预混料0.1～0.5份、矿物质预混料0.1～1份、VC磷酸酯0.1～0.2份、氯化胆碱0.1～1份、甜菜碱0.1～1份、赖氨酸0.01～0.1 份、蛋氨酸0.1～1份、微晶纤维素1～2份，缩合单宁0.1～0.3份。

根据本发明的第二个方面，在本发明的一些优选的实施方式中，按质量份计，上述水产饲料中含有进口鱼粉25～30份、豆粕25～28份、菜籽粕8～10份、高筋面粉25～26份、磷酸二氢钙1～1.5份、豆油1～3份、鱼油1～2份、大豆卵磷脂2～3份、维生素预混料0.1～0.2份、矿物质预混料0.1～0.5份、VC磷酸酯0.1～0.15份、氯化胆碱0.1～0.5份、甜菜碱0.1～0.5份、赖氨酸0.01～0.05份、包膜蛋氨酸0.1～0.25份、微晶纤维素1～2份、缩合单宁0.1～0.2份。

在本发明的一些更优选的实施方式中，上述水产饲料中含有：进口鱼粉28％、豆粕24％、菜籽粕10％、高筋面粉26％、磷酸二氢钙1.5％、豆油3％、鱼油2％、大豆卵磷脂2％、维生素预混料0.1％、矿物质预混料0.5％、VC磷酸酯0.14％、氯化胆碱0.5％、甜菜碱0.5％、赖氨酸0.03％、包膜蛋氨酸0.22％、微晶纤维素粉1.31％、缩合单宁0.2％。

根据本发明的第二个方面，在一种具体实施方式中，至少具有以下有益效果：

本发明通过在饲料中加入0.2％的缩合单宁，能够有效治疗或缓解黄曲霉毒素对鲈鱼肝脏及肠道的伤害，从而避免鲈鱼因黄曲霉毒素中毒导致的营养不良、生长缓慢等问题，提高鲈鱼黄曲霉毒素中毒后的生存率，降低水产养殖中黄曲霉毒素对养殖业的危害和经济损失。

本发明的第三个方面，提供本发明的第二个方面所述水产饲料的制备方法，包括如下步骤：

(1)称取本发明的第二个方面所述水产饲料的配方中的各组分，粉碎，混合；

(2)将混合好的各组分进行微波调质，高温膨化，冷却，即得。

其中，步骤(2)中的微波调质的功率为800-1200W，微波调质时间为80-100s。

步骤(2)中的膨化温度为110℃，膨化腔内压力1.83Mpa。

微波调质是指通过利用微波电磁场场所产生的热效应来改善饲料品质。与传统的蒸汽调质方法相比，其优越性在于：

(1)调质时间缩短。微波加热属于内部加热方式，电磁能直接作用于介质分子转换成热能，且透射使介质内外同时受热，不需要热传导，所以能够达到快速均匀加热的目的。

(2)均匀加热。微波调质不限制饲料形状，无论微波形状如何，微波都能均匀渗透，因此大大改善了加热的均匀性。

(3)节能高效。微波调质的加热室对电磁波来说是个封闭的腔体，电磁波不能外泄，只能被加热物体吸收，加热室内的空气与金属壁面都不会被加热，所以热效率高。同时，调质器以外的环境温度也不会因此而升高，使节能和环保得以双赢。

(4)易于控制。微波功率的控制是由开关、旋钮调节，即开即用，无热惯性，功率连续可调，易于自动化。

(5)降低营养物质损失率。相比传统蒸汽调质，微波调质时间大大缩短，有利于保护饲料中维生素、微量元素、缩合单宁等营养素，提高饲料品质。

本发明的第四个方面，提供本发明的第二个方面所述水产饲料或本发明的第三个方面所述制备方法制备得到的水产饲料在水产动物养殖中的应用。

在本发明的一些优选的实施方式中，上述水产动物为鲈鱼。

本发明的第五个方面，提供缩合单宁作为饲料添加剂在制备预防或治疗水产动物黄曲霉毒素中毒饲料中的应用。

在本发明的一些优选的实施方式中，上述水产动物为鲈鱼。

附图说明

图1为本发明实施例中的缩合单宁的核磁共振图谱；

图2为本发明实施例中的G0组鲈鱼肝细胞HE染色切片(×200倍)；

图3为本发明实施例中的G1组鲈鱼肝细胞HE染色切片(×200倍)；

图4为本发明实施例中的G2组鲈鱼肝细胞HE染色切片(×200倍)；

图5为本发明实施例中的G3组鲈鱼肝细胞HE染色切片(×200倍)；

图6为本发明实施例中的G4组鲈鱼肝细胞HE染色切片(×200倍)；

图7为本发明实施例中的G0组鲈鱼结肠组织病理HE染色切片(×40倍)；

图8为本发明实施例中的G1组鲈鱼结肠组织病理HE染色切片(×40倍)；

图9为本发明实施例中的G2组鲈鱼结肠组织病理HE染色切片(×40倍)；

图10为本发明实施例中的G3组鲈鱼结肠组织病理HE染色切片(×40倍)；

图11为本发明实施例中的G4组鲈鱼结肠组织病理HE染色切片(×40倍)。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

实验材料

(1)缩合单宁的制备：

①将植物样品冻干，粉碎至全部通过1.0mm标准筛。

②加入提取液(漆酶10U/mL、纤维素酶150U/mL、果胶酶20U/mL)进行提取40min，其中，提取温度45℃，提取液pH为5.0，料液比为1:20g/mL。将提取液进行真空抽滤，冻干，得到粗提物。

③将粗提物溶于80％甲醇溶液中，过滤除杂，将滤液加入到交联葡聚糖柱中，充分搅拌，静置30min，真空抽滤。反复重复多次，直至真空抽滤后得到的溶液变为无色为止。弃去滤液。

④用50％丙酮溶液(含0.1％抗坏血酸)反复冲洗交联葡聚糖柱，直至洗脱液变为无色为止。

⑤将洗脱液蒸发浓缩(40℃，30min)，冻干，即得到高纯度植物缩合单宁。

其中，步骤①中的植物包括紫色达利菊、酿酒葡萄渣、柱花草中的一种或多种。

(2)缩合单宁的鉴定：

采用

结果表明，上述实施例制备得到的缩合单宁纯度为96.5％。缩合单宁聚合度为17，缩合单宁中原花青定单宁与原翠雀定单宁的质量比为3.3，延伸单元表儿茶素含量为68.8％，延伸单元表没食子儿茶素含量为28.0％。

实施例1

一种水产饲料，该水产的配方为：进口鱼粉28％、豆粕24％、菜籽粕10％、高筋面粉26％、磷酸二氢钙1.5％、豆油3％、鱼油2％、大豆卵磷脂2％、维生素预混料0.1％、矿物质预混料 0.5％、VC磷酸酯0.14％、氯化胆碱0.5％、甜菜碱0.5％、赖氨酸0.03％、包膜蛋氨酸0.22％、微晶纤维素粉1.31％、缩合单宁0.2％。

其中，维生素预混料为本领域中常规的肉鱼维生素预混料，其中含有VA，VB

按照上述组分含量称取各组分原料，粉碎机粉碎后混合均匀。将混合好的各组分原料进行微波调质，微波功率为1000W，微波处理时间90s。然后将微波处理后的各组分原料放入膨化机内，膨化温度110℃，膨化腔压力1.83Mpa，冷却即得预防或治疗水产动物黄曲霉毒素中毒饲料。

实施例2

一种水产饲料，该水产的配方为：进口鱼粉28％、豆粕24％、菜籽粕10％、高筋面粉26％、磷酸二氢钙1.5％、豆油3％、鱼油2％、大豆卵磷脂2％、维生素预混料0.1％、矿物质预混料 0.5％、VC磷酸酯0.14％、氯化胆碱0.5％、甜菜碱0.5％、赖氨酸0.03％、包膜蛋氨酸0.22％、微晶纤维素粉1.41％、缩合单宁0.1％。

其中，维生素预混料为本领域中常规的肉鱼维生素预混料，其中含有VA，VB

按照上述组分含量称取各组分原料，粉碎机粉碎后混合均匀。将混合好的各组分原料进行微波调质，微波功率为1000W，微波处理时间90s。然后将微波处理后的各组分原料放入膨化机内，膨化温度110℃，膨化腔压力1.83Mpa，冷却即得预防或治疗水产动物黄曲霉毒素中毒饲料。

对比例1

一种水产饲料，该水产的配方为：进口鱼粉28％、豆粕24％、菜籽粕10％、高筋面粉26％、磷酸二氢钙1.5％、豆油3％、鱼油2％、大豆卵磷脂2％、维生素预混料0.1％、矿物质预混料 0.5％、VC磷酸酯0.14％、氯化胆碱0.5％、甜菜碱0.5％、赖氨酸0.03％、包膜蛋氨酸0.22％、微晶纤维素粉1.51％。

制备方法如实施例1所示。

对比例2

一种水产饲料，该水产的配方为：进口鱼粉28％、豆粕24％、菜籽粕10％、高筋面粉26％、磷酸二氢钙1.5％、豆油3％、鱼油2％、大豆卵磷脂2％、维生素预混料0.1％、矿物质预混料 0.5％、VC磷酸酯0.14％、氯化胆碱0.5％、甜菜碱0.5％、赖氨酸0.03％、包膜蛋氨酸0.22％、微晶纤维素粉1.21％、缩合单宁0.3％。

对比例3

一种水产饲料，该水产的配方为：进口鱼粉28％、豆粕24％、菜籽粕10％、高筋面粉26％、磷酸二氢钙1.5％、豆油3％、鱼油2％、大豆卵磷脂2％、维生素预混料0.1％、矿物质预混料 0.5％、VC磷酸酯0.14％、氯化胆碱0.5％、甜菜碱0.5％、赖氨酸0.03％、包膜蛋氨酸0.22％、微晶纤维素粉1.41％、水解单宁0.1％。

对比例4

一种水产饲料，该水产的配方为：进口鱼粉28％、豆粕24％、菜籽粕10％、高筋面粉26％、磷酸二氢钙1.5％、豆油3％、鱼油2％、大豆卵磷脂2％、维生素预混料0.1％、矿物质预混料 0.5％、VC磷酸酯0.14％、氯化胆碱0.5％、甜菜碱0.5％、赖氨酸0.03％、包膜蛋氨酸0.22％、微晶纤维素粉1.31％、水解单宁0.2％。

效果验证

(1)构建黄曲霉毒素中毒模型：

选择均重为2.9g/尾的鲈鱼作为测试对象，养殖试验在循环水养殖系统中进行，分5组，共15个缸(容积300L水，直径80cm×高70cm)，每组3个重复，每个重复35尾鱼，养殖周期为8周。

以对比例1作为空白对照G0，仅投喂对比例1制备得到的水产饲料，不加入黄曲霉毒素 B1。

试验组为：

试验组G1投喂对比例1制备得到的水产饲料，且饲料中添加1mg/kg黄曲霉毒素B1。

试验组G2投喂实施例1制备得到的水产饲料，且饲料中添加1mg/kg黄曲霉毒素B1。

试验组G3投喂实施例2制备得到的水产饲料，且饲料中添加1mg/kg黄曲霉毒素B1。

试验组G4投喂对比例2制备得到的水产饲料，且饲料中添加1mg/kg黄曲霉毒素B1。

试验组G5投喂对比例3制备得到的水产饲料，且饲料中添加1mg/kg黄曲霉毒素B1。

试验组G6投喂对比例4制备得到的水产饲料，且饲料中添加1mg/kg黄曲霉毒素B1。

(2)鲈鱼生长情况检测：

按照上述实施例中的分组进行投喂试验，养殖8周后测定鲈鱼的增重情况，计算增重率和特定生长率，以分析黄曲霉毒素对鲈鱼生长情况的影响以及各组不同饲料对黄曲霉毒素中毒的缓解情况。

结果如表1所示。

表1各组不同饲料对黄曲霉毒素中毒鲈鱼生长的影响

注：同行数据且标不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，相同或无字母表示差异不显著(p ＞0.05)。

由上述表1可知，向鲈鱼中投喂1mg/kg黄曲霉毒素B1能显著降低鲈鱼生长水平，G1相较于G0，其增重率下降了651.7％，说明黄曲霉毒素B1能严重阻碍鲈鱼的正常生长。G2 和G3组中分别加入了0.1％和0.2％的上述实施例提取得到的缩合单宁，在其他营养成分与G1相同的情况下，G2和G3组的增重率仅下降了10.3％和69.0％，说明缩合单宁能够缓解黄曲霉毒素B1对鲈鱼生长的抑制作用，并且随着缩合单宁含量的提高，作用效果越好。但当缩合单宁的含量超过3％时(G4)，鲈鱼的末均重、增重率、特定生长率显著下降(P＜ 0.05)，说明在大于3％的限定剂量之后，过量的缩合单宁反而主要发挥抗营养的作用，使鲈鱼对营养成分的吸收更弱，导致鲈鱼生长情况更差。

而当采用与G2和G3等量的水解单宁作为添加剂加入饲料中后，G5和G6对鲈鱼的作用效果与G1无显著差异，说明水解单宁不具有解毒作用，或者说明水解单宁比缩合单宁的作用效果更弱，其原因可能是水解单宁结构简单，分子量小，容易在动物消化道内被降解而不能充分发挥其生物活性。

(3)缩合单宁对鲈鱼黄曲霉毒素中毒导致的肝脏损伤的治疗效果：

根据上述实施例的结果，进一步就缩合单宁对鲈鱼黄曲霉毒素中毒导致的肝脏损伤的治疗效果进行探究，试验设计如下：

采用上述实施例中的方法构建黄曲霉毒素中毒模型，并采用上述G0～G4的方案进行分组投喂测试，投喂8周后，随机抽取各组中的鲈鱼，取出肝脏，采用本领域常规手段制备肝脏切片(HE染色，hematoxylin-eosin staining)，与显微镜下观察肝细胞形态结构。

G0～G4的肝细胞形态如图1～5所示。

图2为正常饲养的鲈鱼肝脏，而在加入1mg/kg黄曲霉毒素B1后，可以发现，黄曲霉毒素B1会使鲈鱼肝脏发生严重病变，肝细胞形态发生显著变化，空泡化严重，并伴有炎症浸润现象(图3)。而在加入0.1％～0.2％的缩合单宁后，鲈鱼肝细胞形态为发生明显变化，说明 0.1％～0.2％的缩合单宁能有效缓解黄曲霉毒素B1对鲈鱼肝脏的损伤，缓解黄曲霉毒素B1中毒症状(图4和图5)。当缩合单宁的添加量提高至0.3％时，鲈鱼肝细胞变性，产生损伤、病变(图6)，说明缩合单宁的添加量不宜提高至0.3％或以上。

(4)缩合单宁对鲈鱼黄曲霉毒素中毒导致的肠道损伤的治疗效果：

根据上述实施例的结果，进一步就缩合单宁对鲈鱼黄曲霉毒素中毒导致的肠道损伤的治疗效果进行探究，试验设计如下：

采用上述实施例中的方法构建黄曲霉毒素中毒模型，并采用上述G0～G4的方案进行分组投喂测试，投喂8周后，随机抽取各组中的鲈鱼，取出肠道，采用本领域常规手段制备肠组织切片(HE染色)，与显微镜下观察肠绒毛形态结构。

G0～G4的肠绒毛形态如图7～11所示。

图6为正常饲养的鲈鱼结肠组织，而在加入1mg/kg黄曲霉毒素B1后，可以发现，黄曲霉毒素B1会使鲈鱼肠道绒毛形态结构发生变化，肠绒毛长度显著降低(P＜0.05)，杯状细胞数量显著减少(P＜0.05)，表明黄曲霉毒素B1损坏鲈鱼肠道形态(图8)。而在加入0.1％～0.2％的缩合单宁后，鲈鱼肠绒毛形态结构和绒毛长度均趋近于正常，说明0.1％～0.2％的缩合单宁能有效缓解黄曲霉毒素B1对鲈鱼肠道的损伤，缓解黄曲霉毒素B1中毒症状(图9和图10)。当将缩合单宁的添加量提高至0.3％时，鲈鱼肠道绒毛形态结构和肠绒毛长度会出现严重损伤 (图11)，因此，说明缩合单宁的添加量不宜提高至0.3％或以上。

综上所述，0.1％～0.2％的缩合单宁能够有效的治疗或缓解黄曲霉毒素对鲈鱼肝脏及肠道的伤害，从而避免鲈鱼因黄曲霉毒素中毒导致的营养不良、生长缓慢等问题，提高鲈鱼黄曲霉毒素中毒后的生存率，降低水产养殖中黄曲霉毒素对养殖业的危害和经济损失。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。