一种荧光/比色双模式酶级联传感器及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于新型纳米复合材料与生物传感检测技术领域，尤其涉及一种荧光/比色双模式酶级联传感器及其制备方法和应用。

背景技术

前列腺癌是指发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤，是全世界诊断出的最常见的癌症之一，尿液前列腺癌抗原3(PCA3)、早期前列腺抗原(EPCA)等生物标志物逐步走进了大众的视野，但是由于其检测手段有限，检测灵敏度和特异性存在较大问题，许多患者因此进行了不必要的活检，限制了在临床上的使用。因此急需一种新的标志物检测方法和有效的筛查手段。近年来通过代谢组学发现肌氨酸可被用作前列腺癌患者生物标志物，2009年，一项试点研究创建了一种非侵入性方法来识别前列腺癌的存在和发展过程，并表明甘氨酸的代谢物肌氨酸可以在患者尿液和血液中检测，可以作为前列腺癌预测的标志物。

乙酰胆碱为中枢及周边神经系统中常见的神经传导物质，在自主神经系统及体运动神经系统中参与神经传导，稳定体内乙酰胆碱含量能够有效的治疗和改善老年痴呆症，因此乙酰胆碱的检测在基础性研究和临床应用中具有重要的意义。葡萄糖监测是诊断糖尿病的主要依据。胆固醇是动物组织细胞所不可缺少的重要物质，它不仅参与形成细胞膜，而且是合成胆汁酸、维生素D以及甾体激素的原料，但长期大量摄入胆固醇，不利于身体健康，会使血清中的胆固醇含量升高，增加患心血管疾病的风险。尿酸是嘌呤碱的氧化分解产物，在人体中无生理功能。临床研究表明尿酸的增高，直接与痛风、高血压、高血脂、糖尿病等病人有着直接的关系，因此检测血液中尿酸的含量对临床诊断具有非常重要的意义。

目前，对于与人类疾病密切相关的疾病标志物的检测方法主要有电化学方法、电泳法等，但这些方法对仪器成本要求高，技术操作复杂，检测时间长，因此急需研发一种成本低、操作简便、灵敏度高的疾病标志物检测方法。

发明内容

针对上述不足，本发明的目的在于提供一种荧光/比色双模式酶级联传感器及其制备方法和应用。本发明提供的荧光/比色双模式酶级联传感器具有高灵敏度、高选择性、高专一性和检测限低等优点，能够应用于疾病的早期诊断与检测。

为实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：

一方面，本发明提供一种荧光/比色双模式酶级联传感器，该酶级联传感器包括磷掺杂的类石墨相氮化碳PCN纳米片，负载于PCN纳米片的多金属有机框架FeMn-ZIF-8，以及具有聚集诱导发光效应的铜纳米簇Cu NCs；其中多金属有机框架中包埋有能够催化疾病标志物产生过氧化氢的天然酶，铜纳米簇固定在多金属有机框架的表面和/或内部。

金属有机框架(MOFs)是一类由无机金属中心(金属离子或金属簇)与有机配体通过自组装相互连接，形成的一类具有周期性网络结构的晶态多孔材料，其中ZIF-8指2-甲基咪唑与锌离子配位生成的正十二面体有序结构，本发明对ZIF-8用铁离子和锰离子修饰，生成多金属有机框架FeMn-ZIF-8，赋予ZIF-8类过氧化物酶活性。为了减少酶级联反应中间产物的损失，以及加速酶级联反应的进行，将天然酶包载在FeMn-ZIF-8中，可提高酶级联反应效率。磷掺杂的类石墨相氮化碳(PCN)是一种典型的聚合物半导体，将Enzyme@FeMn-ZIF-8负载到PCN纳米片上，并在多金属有机框架上固定CuNCs，由于铜纳米簇的聚集诱导发光效应，可提高CuNCs/Enzyme@FeMn-ZIF-8/PCN的荧光强度。由此设计的纳米复合材料，既增加了荧光强度，又提高了纳米材料的类过氧化物酶活性，避免了直接使用天然过氧化物酶检测疾病标记物，对温度、pH适应性低的缺点。

本发明荧光/比色双模式酶级联传感器是利用级联反应中产生的过氧化氢引起体系荧光强度与吸光度的变化从而对待测的标志物进行定量检测。荧光与比色两种检测信号既可独立响应，又能相互验证，提高了检测的可靠性。因此设计合成的CuNCs/Enzyme@FeMn-ZIF-8/PCN复合材料传感器，具有高灵敏度、高选择性、高专一性，且检测限低，解决了现有检测方法操作复杂，成本高的缺点。基于以上所述，本发明以CuNCs/Enzyme@FeMn-ZIF-8/PCN纳米复合材料为平台，制备了一种荧光/比色双模式酶级联传感器，并应用于疾病的早期诊断与检测。

优选的，铜纳米簇的粒径为1～3nm。

优选的，天然酶为肌氨酸氧化酶，乙酰胆碱酯酶，胆碱氧化酶，黄嘌呤氧化酶，葡萄糖氧化酶，胆固醇氧化酶，β半乳糖苷酶、尿酸氧化酶中的一种。

另一方面，本发明还提供一种上述荧光/比色双模式酶级联传感器的制备方法，包括以下步骤：

分别制备铜纳米簇CuNCs和磷掺杂的类石墨相氮化碳PCN纳米片；

将天然酶加入到2-甲基咪唑溶液中，再向其中加入硝酸锌溶液，室温下充分搅拌混合，固液分离后得到包埋天然酶的单金属有机框架Enzyme@ZIF-8；

将包埋天然酶的单金属有机框架Enzyme@ZIF-8与硫酸铁溶液和硝酸锰溶液混合搅拌，固液分离后得到包埋天然酶的多金属有机框架Enzyme@FeMn-ZIF-8；

将磷掺杂的类石墨相氮化碳PCN纳米片、包埋天然酶的多金属有机框架Enzyme@FeMn-ZIF-8和铜纳米簇CuNCs混合均匀后，得到所述荧光/比色双模式酶级联传感器，记为CuNCs/Enzyme@FeMn-ZIF-8/PCN。

优选的，包埋天然酶的单金属有机框架的制备中，硝酸锌与2-甲基咪唑的摩尔比为1：(4～12)，所述天然酶的用量为0.2～1mg。

优选的，包埋天然酶的多金属有机框架的制备中，硫酸铁溶液和硝酸锰溶液的浓度均为2～3mg/mL，加入体积为100～300μL。

优选的，荧光/比色双模式酶级联传感器的制备方法包括：

取150～250mg磷掺杂的类石墨相氮化碳PCN纳米片溶于5mL超纯水中，得到PCN纳米片分散液；

将Enzyme@FeMn-ZIF-8溶于5mL超纯水中，得到Enzyme@FeMn-ZIF-8溶液；

移取2～3mL Enzyme@FeMn-ZIF-8溶液加入所述PCN纳米片分散液中，超声10-15min后，固液分离，得到Enzyme@FeMn-ZIF-8/PCN；

将Enzyme@FeMn-ZIF-8/PCN溶于超纯水中，加入1～2mLCuNCs，超声10-15min后，固液分离，得到CuNCs/Enzyme@FeMn-ZIF-8/PCN。

本发明第三方面提供一种上述的荧光/比色双模式酶级联传感器在检测疾病标志物中的应用。

优选的，上述荧光/比色双模式酶级联传感器在检测疾病标志物中的应用，包括以下步骤：

酶级联荧光/比色双模式传感器荧光法检测疾病标志物：

配置一系列不同浓度的疾病标志物标准溶液加入到荧光比色双模式酶级联传感器的缓冲溶液中，检测反应体系荧光强度的变化，根据荧光强度随疾病标志物标准品溶液浓度的变化绘制标准曲线，得到疾病标志物浓度的荧光标准曲线方程；将待测标志物样品加入到所述酶级联传感器的缓冲溶液中，检测反应体系的荧光强度，根据疾病标志物浓度的荧光标准曲线方程，计算出待测标志物样品的浓度；

酶级联荧光/比色双模式传感器比色法检测疾病标志物：

配置一系列不同浓度的疾病标志物标准溶液和一定浓度的TMB溶液加入到荧光比色双模式酶级联传感器的缓冲溶液中，检测反应体系吸光度的变化；根据吸光度随疾病标志物标准品溶液浓度的变化绘制标准曲线，得到疾病标志物浓度的吸光度标准曲线方程；将待测标志物样品和一定浓度的TMB溶液加入到所述酶级联传感器的缓冲溶液中，检测反应体系的吸光度，根据疾病标志物浓度的吸光度标准曲线方程，计算出待测标志物样品的浓度。

优选的，荧光法检测疾病标志物时，检测反应体系在430nm处的荧光强度；比色法检测疾病标志物时，检测反应体系在652nm处的吸光度。

本发明的有益效果是：

本发明通过构建多金属有机框架FeMn-ZIF-8，赋予ZIF-8类过氧化物酶活性；将天然酶包载在FeMn-ZIF-8中，增加了固定化酶的稳定性，减少了酶级联反应的中间产物的损失，以及加速酶级联反应的进行，提高了酶级联反应效率；将Enzyme@FeMn-ZIF-8负载到PCN纳米片上，并在多金属有机框架上固定铜纳米簇CuNCs，由于CuNCs的聚集诱导发光效应，使CuNCs/Enzyme@FeMn-ZIF-8/PCN的荧光效果增强，可以提高传感器的灵敏度，降低检测限。

本发明提供的荧光/比色双模式酶级联纳米传感器既可产生荧光信号，也可产生比色信号，丰富了检测方式，且两种检测信号既可独立响应，又能相互验证，提高了检测结果的可靠性；利用天然酶与底物的特异性结合，提高了检测方法的特异性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例的附图作简单的介绍。

图1为本发明荧光/比色双模式酶级联传感器用于检测疾病标记物含量的原理示意图；

图2为本发明实施例制备的SOX@FeMn-ZIF-8、CuNCs、PCN和CuNCs/SOX@FeMn-ZIF-8/PCN的透射电镜图；

图3为CuNCs和Cu NCs/SOX@FeMn-ZIF-8/PCN的荧光光谱图；

图4为CuNCs/SOX@FeMn-ZIF-8/PCN的XPS图；

图5为本发明实施例2中肌氨酸浓度与荧光强度线性关系示意图；

图6为本发明实施例2中肌氨酸浓度与吸光度线性关系示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，均属于本发明保护的范围。

本发明实施例提供一种荧光/比色双模式酶级联传感器，该酶级联传感器包括磷掺杂的类石墨相氮化碳PCN纳米片，负载于PCN纳米片的多金属有机框架FeMn-ZIF-8，以及具有聚集诱导发光效应的铜纳米簇Cu NCs；其中多金属有机框架中包埋有能够催化疾病标志物产生过氧化氢的天然酶，铜纳米簇固定在多金属有机框架的表面和/或内部。

如图1所示，本发明提供的荧光/比色双模式酶级联传感器用于检测疾病标记物含量的原理为：利用级联过程中产生的过氧化氢使FeMn-ZIF-8框架结构分解，铜纳米簇因脱离框架结构而减弱AIE效应，从而使得荧光强度降低，待测的标志物浓度与荧光强度呈负响应；且具有类过氧化物酶活性的纳米酶FeMn-ZIF-8可催化过氧化氢氧化无色的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)变为蓝色氧化产物(oxTMB)，待测的标志物浓度与吸光度呈正响应，由此对加入的标志物含量进行定量。荧光与比色两种检测信号既可独立响应，又能相互验证，使得荧光比色双模式酶级联传感器具有检测限低、线性范围宽、灵敏度高、操作简单，响应时间短，特异性高等特点。

本发明的天然酶为任何能够催化疾病标志物产生过氧化氢的酶，在一些较优的实施方式中，天然酶可以为肌氨酸氧化酶，乙酰胆碱酯酶，胆碱氧化酶，黄嘌呤氧化酶，葡萄糖氧化酶，胆固醇氧化酶，β半乳糖苷酶、尿酸氧化酶中的一种。当天然酶为肌氨酸氧化酶时，制备的荧光/比色双模式酶级联传感器可用于检测肌氨酸含量；当天然酶为乙酰胆碱酯酶或胆碱氧化酶时，可用于检测乙酰胆碱含量；为葡萄糖氧化酶时可以检测葡萄糖含量；为胆固醇氧化酶时可以检测胆固醇含量；为β半乳糖苷酶时可检测乳糖含量；为尿酸氧化酶时可以检测尿酸含量。

为本发明实施例提供的荧光/比色双模式酶级联传感器的制备方法，包括以下步骤：

分别制备铜纳米簇Cu NCs和磷掺杂的类石墨相氮化碳PCN纳米片；

将天然酶加入到2-甲基咪唑溶液中，再向其中加入硝酸锌溶液，室温下充分搅拌混合，固液分离后得到包埋天然酶的单金属有机框架Enzyme@ZIF-8；其中硝酸锌与2-甲基咪唑的摩尔比为1：(4～12)，天然酶的用量为0.2～1mg；

将包埋天然酶的单金属有机框架Enzyme@ZIF-8与100～300μL浓度均为2～3mg/mL硫酸铁溶液和硝酸锰溶液混合搅拌，固液分离后得到包埋天然酶的多金属有机框架Enzyme@FeMn-ZIF-8；

取150～250mg磷掺杂的类石墨相氮化碳PCN纳米片溶于5mL超纯水中，得到PCN纳米片分散液；将Enzyme@FeMn-ZIF-8溶于5mL超纯水中，得到Enzyme@FeMn-ZIF-8溶液；移取2～3mL Enzyme@FeMn-ZIF-8溶液加入PCN纳米片分散液中，超声10-15min后，固液分离，得到Enzyme@FeMn-ZIF-8/PCN；将Enzyme@FeMn-ZIF-8/PCN溶于超纯水中，加入1～2mLCuNCs，超声10-15min后，固液分离，得到荧光/比色双模式酶级联传感器，记为CuNCs/Enzyme@FeMn-ZIF-8/PCN。

在一些较优的实施方式中，铜纳米簇是由谷胱甘肽稳定的铜纳米簇，平均粒径为1～3nm，其制备方法包括：将谷胱甘肽和CuSO

在一些较优的实施方式中，磷掺杂的类石墨相氮化碳PCN纳米片的制备方法，包括：将尿素和磷酸二氢铵混合超声后，真空干燥得到沉淀物，将沉淀物在550℃马弗炉中煅烧2h，得到P-g-C

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种荧光/比色双模式酶级联传感器，制备方法如下：

(1)制备铜纳米簇Cu NCs

取33.2mg/mL的谷胱甘肽2mL，装于50mL的圆底烧瓶中；取25mg/mL的CuSO

(2)制备包埋肌氨酸氧化酶的单金属有机框架SOX@ZIF-8

取10mg ZnNO

(3)制备包埋肌氨酸氧化酶的多金属有机框架SOX@FeMn-ZIF-8

将SOX@ZIF-8溶于5mL超纯水中，向其中加入2.75mg/mL的FeSO

(4)制备磷掺杂的类石墨相氮化碳PCN纳米片

将1g尿素溶解在10mL蒸馏水中，常温下磁力搅拌30min，向该尿素溶液中加入0.3g磷酸二氢铵，然后超声处理10min。将制备好的混合溶液60℃旋蒸20min除去水分，然后放入70℃的真空干燥箱中干燥2h。得到的沉淀物冷却后在550℃的坩埚中反应2h，关掉马弗炉后散热1h，得到块状P-g-C

将上述得到的P-g-C3N4材料进行剥离，并用浓盐酸(37%)质子化处理：块状P-g-C

(5)制备荧光/比色双模式酶级联传感器Cu NCs/SOX@FeMn-ZIF-8/PCN

取200mg PCN纳米片溶解于5mL超纯水中，超声15min，使其分散均匀，得到PCN纳米片分散液；将SOX@FeMn-ZIF-8溶于5mL超纯水中，得到SOX@FeMn-ZIF-8溶液，取2mL Enzyme@FeMn-ZIF-8溶液加入PCN纳米片分散液中，超声15min后8000rpm离心10min，得到的固体溶于1mL超纯水中，向其中加入1mL Cu NCs，超声10min后，10000rpm离心10min，得到Cu NCs/SOX@FeMn-ZIF-8/PCN。Cu NCs/Enzyme@FeMn-ZIF-8/PCN的透射电镜图如图2(D)所示，图4为XPS图，由XPS可知，复合纳米材料中同时含有C、N、O、P、Cu、Zn、Fe、Mn元素，表明成功制备得到复合材料。图3为荧光光谱图，可以看出，本发明制备的传感器复合材料通过将铜纳米簇固定，表现出其聚集诱导发光(AIE)性质，具有较强的荧光强度。

实施例2

一种荧光/比色双模式酶级联传感器用于检测肌氨酸，包括以下步骤：

(1)荧光法检测肌氨酸浓度

荧光标准曲线的绘制：将实施例1制备的CuNCs/SOX@FeMn-ZIF-8/PCN，溶于1mL超纯水中，再将其稀释10倍，备用。向试管中加入pH＝8.0的Tris缓冲液200μL，不同浓度的标准肌氨酸溶液50μL，再加入CuNCs/SOX@FeMn-ZIF-8/PCN溶液50μL，避光孵育20min后，使用多功能酶标仪检测荧光值。多功能酶标仪检测的参数设置为：激发波长为350nm，发射波长为430nm。

配制的标准肌氨酸溶液的浓度依次增加，分别为1、10、30、50、75、100、125、150、175、200μM，以标准肌氨酸浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线，根据标准曲线来确定待测肌氨酸的浓度，确定检测限，本实施例中荧光检测肌氨酸的线性范围为1-100μM，检测限为0.34μM，线性关系见图5。

向试管中加入pH＝8.0的Tris缓冲液200μL，CuNCs/SOX@FeMn-ZIF-8/PCN溶液50μL，待测肌氨酸溶液50μL，避光孵育20min后，使用多功能酶标仪检测荧光值。多功能酶标仪检测的参数设置为：激发波长为350nm，发射波长为430nm。读取荧光强度值，带入图5的标准曲线中，计算肌氨酸的浓度。

(2)比色法检测肌氨酸浓度

比色标准曲线的绘制：将实施例1制备的CuNCs/SOX@FeMn-ZIF-8/PCN，溶于1mL超纯水中，再将其稀释10倍，备用。向试管中加入pH＝8.0的Tris缓冲液200μL，不同浓度的标准肌氨酸溶液50μL(分别为1、10、30、50、75、100、125、150、175、200μM)，再分别加入Cu NCs/SOX@FeMn-ZIF-8/PCN溶液50μL，避光孵育20min。取不同试管中的溶液各200μL，分别加入pH＝4.0的HAC-NaAC缓冲溶液100μL，30mM的TMB溶液30μL，37℃孵育15min后，使用多功能酶标仪检测652nm处的吸光度值。

以标准肌氨酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，根据标准曲线来确定待测肌氨酸的浓度，确定检测限，本实施例中比色法检测肌氨酸的线性范围为1-200μM，检测限为0.59μM，线性关系见图6。

向试管中加入pH＝8.0的Tris缓冲液200μL，CuNCs/SOX@FeMn-ZIF-8/PCN溶液50μL，待测肌氨酸溶液50μL，避光孵育20min。取待测液200μL，加入pH＝4.0的HAC-NaAC缓冲溶液100μL，30mM的TMB溶液30μL，37℃孵育15min后，使用多功能酶标仪检测652nm处的吸光度值。读取吸光度值，代入图6的标准曲线中，计算肌氨酸的浓度。

实施例3

一种荧光/比色双模式酶级联传感器应用于检测人体尿液肌氨酸含量，包括以下步骤：

(1)取新鲜人体尿液样本，10000rpm下离心15min后取上清液，将上清稀释10倍后备用。

(2)将实施例1制备的Cu NCs/SOX@FeMn-ZIF-8/PCN溶于1mL超纯水中，再将其稀释10倍备用。向试管中加入pH＝8.0的Tris缓冲液200μL，Cu NCs/SOX@FeMn-ZIF-8/PCN溶液50μL，待测的人体尿液50μL，避光孵育20min后，使用多功能酶标仪检测荧光值。多功能酶标仪检测的参数设置为：激发波长为350nm，发射波长为430nm。读取荧光强度值，带入图4标准曲线中，计算人体尿液中肌氨酸的浓度。

(3)取步骤(2)反应后的溶液200μL，加入pH＝4.0的HAC-NaAC缓冲溶液100μL，加入30mM的TMB溶液30μL，37℃孵育15min后，使用多功能酶标仪检测652nm处的吸光度，读取吸光度值，代入图5的标准曲线中，计算人体尿液中肌氨酸的浓度。

如表1所示，荧光/比色双模式酶级联传感器比现有大多数用于检测肌氨酸的方法更灵敏，具有更宽的检测范围和更低的检测限。

表1不同方法对肌氨酸的检测结果

实施例4

一种荧光/比色双模式酶级联传感器，与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于，将肌氨酸氧化酶替换为乙酰胆碱酯酶(AchE)，得到CuNCs/AchE@FeMn-ZIF-8/PCN。将本实施例制备的荧光/比色双模式酶级联传感器按照与实施例2相同的方法检测乙酰胆碱。

实施例5

一种荧光/比色双模式酶级联传感器，与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于，将肌氨酸氧化酶替换为葡萄糖氧化酶(GOD)，得到CuNCs/GOD@FeMn-ZIF-8/PCN。将本实施例制备的荧光/比色双模式酶级联传感器按照与实施例2相同的方法检测葡萄糖含量。

实施例6

一种荧光/比色双模式酶级联传感器，与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于，将肌氨酸氧化酶替换为胆固醇氧化酶(COD)，得到CuNCs/COD@FeMn-ZIF-8/PCN。将本实施例制备的荧光/比色双模式酶级联传感器按照与实施例2相同的方法检测胆固醇含量。

需要说明的是，以上各实施例均属于同一发明构思，各实施例的描述各有侧重，在个别实施例中描述未详尽之处，可参考其他实施例中的描述。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。