一种肿瘤免疫微环境调控剂的制备及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肿瘤免疫微环境调控剂的制备及其应用。

背景技术

近年来，免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors,ICI)在实体瘤治疗中的应用和研究如火如荼，自国外药物帕博利珠单抗(Pembrolizumab,商品名KEYTRUDA)、纳武单抗(Nivolumab,商品名OPDIVO)等相继被FAD批准用于多个实体瘤治疗，国内也有多个类似药物如达伯舒(信迪利单抗注射液)、拓益(特瑞普利单抗)等在尿路上皮癌、非小细胞肺癌等多个实体瘤的治疗和临床试验开展，然而，在未经生物标记物筛选的情况下(比如TMB、PD-L1、dMMR/MSI-H等biomarkers)，ICI单药治疗实体瘤，各个瘤种中的有效率基本都在30％以下，而经筛选后，即便有效率有所提高，但是，能够筛选到的潜在响应患者比例很小，比如，结直肠癌中，dMMR/MSI-H的这类患者，虽然是ICI的潜在获益人群，但结直肠癌中，这类患者不过占到所有结直肠癌患者中10％以下，即多数实体瘤患者依然难以从ICI的治疗中获益。因此，各种联合治疗方案在不同瘤种中的探索和应用日益重要，也取得了一定成效，比如ICI联合抗血管生成的药物，ICI联合化疗。这类联合治疗的机制，部分是因为两种或者三种抗肿瘤药物各自抗癌作用的叠加，另外，应该是联合药物发挥一定程度的免疫调控，使得患者原本的肿瘤免疫微环境格局发生改变，使得原本对ICI不响应的患者，转变为ICI响应者(responder)。然而这类联合治疗一方面增加了副作用的风险，另一方面，增加了患者用药成本，因此，本发明制备了一种新的能够调控肿瘤免疫微环境的佐剂，用于增敏ICI治疗泛实体瘤，使得更多实体瘤患者从ICI治疗中获益。

发明内容

本发明第一目的在于提供一种以菲牛蛭活体冻干粉为主要成分的肿瘤免疫微环境调控剂的制备方法；

本发明第二目的在于提供一种由本发明方法所制备的肿瘤免疫微环境调控剂，具有良好免疫调控作用，能够达到肿瘤免疫微环境重塑、免疫层面上的祛邪扶正的效果。

本发明第三目的在于提供一种所述的肿瘤免疫微环境调控剂在增敏ICI治疗实体瘤的效果。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种肿瘤免疫微环境调控剂，由以下成分组成：保护剂、菲牛蛭粉碎物；

所述保护剂包括以下成分：脱脂乳粉，蔗糖，维生素C，蜂胶、甘油。

进一步的，保护剂中各原料比例为(与生理盐水质量体积比)：5％脱脂乳粉，3％蔗糖，0.5％维生素C，0.1％蜂胶，8％甘油。

进一步的，所述蜂胶替换设置为明胶。

进一步的，肿瘤免疫微环境调控剂的制备方法为：

S1.保护剂配置：脱脂乳粉，蔗糖，维生素C，蜂胶、甘油按比例溶解配置于与生理盐水中，搅拌均匀，置于4°条件下预冷；

S2.菲牛蛭粉碎物制备：将新鲜菲牛蛭清水浸泡8-12小时，排尽污物；置于二氧化氯水溶液浸泡消毒2-3分钟，后滤纸吸干水分，然后置于摄氏0-4度冷藏箱中预冷4-6小时，从0-4℃的低温保存箱中取出，打浆制成菲牛蛭粉碎浆液，待用；

S3.将等体积S1所述的保护剂溶液和S2所述的菲牛蛭粉碎浆液搅拌混匀，放入超低温保存箱内2小时，冻结获得冻干样品；将冻干样品置于冷冻架中进行真空冷冻干燥，冻干后再经100目筛的粉碎机粉碎后获得调控剂冻干粉；调控剂冻干粉即为肿瘤免疫微环境调控剂。

进一步的，所述超低温保存箱温度设定为-45℃。

进一步的，所述二氧化氯水溶液浓度为50ppm。

进一步的，制备方法中所述蜂胶替换设置为明胶。

进一步的，所述的肿瘤免疫微环境调控剂，其为单独存在的粉剂或单独存在的片剂或复合存在的添加剂。

进一步的，所述的肿瘤免疫微环境调控剂，其使用方法为：与免疫检查点抑制剂联合使用。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

本发明可以通过调控肿瘤免疫微环境，驱动正向免疫，即增加CD8阳性T淋巴细胞(CD8+T)、自然杀伤细胞(NK)在肿瘤微环境中的浸润比例，并，抑制M2型肿瘤相关巨噬细胞(Tumor immune macrophage,TAM)，以此，增敏免疫检查点抑制剂(ICI)如帕博丽珠单抗、纳武单抗等药物的抗肿瘤效应，提高ICI在实体瘤治疗中的总体响应率(ORR)。

附图说明

图1为多重免疫荧光技术标记的肿瘤组织及其中的免疫细胞代表图；

图2为本发明物作为肿瘤免疫微环境调控剂的动物实验(荷瘤小鼠)研究结果图。

图3为本发明物作为肿瘤免疫微环境调控剂增敏ICI抗肿瘤疗效的动物实验(荷瘤小鼠)研究结果图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

如图所示：

实施例1：

一种肿瘤免疫微环境调控剂，由以下成分组成：保护剂、菲牛蛭粉碎物；所述保护剂包括以下成分：脱脂乳粉，蔗糖，维生素C，蜂胶、甘油。

实施例2：

在实施例1的基础上，保护剂中各原料比例为(与生理盐水质量体积比)：5％脱脂乳粉，3％蔗糖，0.5％维生素C，0.1％蜂胶，8％甘油。

实施例3：

在实施例1-2的基础上，所述蜂胶替换设置为明胶。

实施例4：

在实施例1-3的基础上，所述肿瘤免疫微环境调控剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.保护剂配置：脱脂乳粉，蔗糖，维生素C，蜂胶、甘油按比例溶解配置于与生理盐水中，搅拌均匀，置于4°条件下预冷；

S2.菲牛蛭粉碎物制备：将新鲜菲牛蛭清水浸泡8-12小时，排尽污物；置于二氧化氯水溶液浸泡消毒2-3分钟，后滤纸吸干水分，然后置于摄氏0-4度冷藏箱中预冷4-6小时，从0-4℃的低温保存箱中取出，打浆制成菲牛蛭粉碎浆液，待用；

S3.将等体积S1所述的保护剂溶液和S2所述的菲牛蛭粉碎浆液搅拌混匀，放入超低温保存箱内2小时，冻结获得冻干样品；将冻干样品置于冷冻架中进行真空冷冻干燥，冻干后再经100目筛的粉碎机粉碎后获得调控剂冻干粉。调控剂冻干粉即为肿瘤免疫微环境调控剂。

实施例5：

在实施例1-4的基础上，所述超低温保存箱温度设定为-45℃。

实施例6：

在实施例1-5的基础上，所述二氧化氯水溶液浓度为50ppm。

实施例7：

在实施例1-6的基础上，制备方法中所述蜂胶替换设置为明胶。

实施例8：

在实施例1-7的基础上，肿瘤免疫微环境调控剂，其为单独存在的粉剂或单独存在的片剂或复合存在的添加剂。

实施例9：

在实施例1-10的基础上，肿瘤免疫微环境调控剂，其使用方法为：与免疫检查点抑制剂联合使用。

实施例10：

一种肿瘤免疫微环境调控粉剂的制备方法：

S1.保护剂配置：脱脂乳粉，蔗糖，维生素C，蜂胶、甘油按比例溶解配置于与生理盐水中，搅拌均匀，置于4°条件下预冷；保护剂中各原料比例为(与生理盐水质量体积比)：5％脱脂乳粉，3％蔗糖，0.5％维生素C，0.1％蜂胶，8％甘油。

S2.菲牛蛭粉碎物制备：将新鲜菲牛蛭清水浸泡12小时，排尽污物；置于二氧化氯水溶液浸泡消毒3分钟，后滤纸吸干水分，然后置于摄氏0度冷藏箱中预冷5小时，从0度的低温保存箱中取出，打浆制成菲牛蛭粉碎浆液，待用；

S3.将等体积S1所述的保护剂溶液和S2所述的菲牛蛭粉碎浆液搅拌混匀，放入超低温保存箱内2小时，冻结获得冻干样品；将冻干样品置于冷冻架中进行真空冷冻干燥，冻干后再经100目筛的粉碎机粉碎后获得调控剂冻干粉。

验证实验：

实验小鼠，皮下种植肿瘤细胞系T24，分为四组，每组10只小鼠，第一组饮用纯净水，第二组饮用纯净水同时予以ICI药物尾静脉干预，第三组饮用溶有本发明冻干粉的纯净水，第四组饮用溶有本发明冻干粉的纯净水，同时予以ICI药物尾静脉干预，在皮下肿瘤生长的不同时间取肿瘤测量评估并作组间比较，同时取不同组肿瘤通过多重免疫荧光染色(四次重复实验总共每组40个样本)，分析不同肿瘤组织免疫细胞的浸润比例和数量。

图1为多重免疫荧光技术标记的肿瘤组织及其中的免疫细胞代表图A为阳性对照，B为阴性对照，C为样本染色，D为CD8+T细胞染色，E为NK细胞染色，F为巨噬细胞；

图2为本发明物作为肿瘤免疫微环境调控剂的动物实验(荷瘤小鼠)研究结果，对所有入组小鼠肿瘤组织染色计数的免疫细胞数量；

表1和图3为本发明物作为肿瘤免疫微环境调控剂增敏ICI抗肿瘤疗效的动物实验(荷瘤小鼠)研究结果，对不同小组小鼠肿瘤的面积比较，表一内容如下。

表一：免疫调控数据(肿瘤面积mm

综上所述，本发明物可以调控CD8+T细胞及具杀伤能力的NK细胞在肿瘤中浸润数量增加，同时表现出对促进肿瘤生长的M2型巨噬细胞数量的抑制，以此方式对肿瘤免疫微环境发挥调节作用，达到肿瘤免疫微环境的改善，为ICI提供适用条件。本发明物联合ICI，表现出优于ICI单药的抗肿瘤效果，本发明物可作为免疫微环境调控剂，并对ICI起到增敏作用。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。