一种基于纳米材料修饰电极快速定量检测单增李斯特菌的电化学发光检测方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种快速检测单增李斯特菌的方法。

背景技术

单核增生李斯特菌是一种革兰氏阳性细菌，普遍存在于空气、水、土壤等环境 中，即使在低温下也可以繁殖，它可导致新生儿、老年人和免疫功能受损患者的脑 膜炎和败血症。因此，开发一种快速、高灵敏度、低成本、高特异性的分析方法将 是控制和预防单增李斯特菌食物中毒的关键因素。

传统的单核增生李斯特菌检测方法包括传统培养技术、酶联免疫吸附试验(ELISA)、环介导等温扩增和聚合酶链反应技术。本发明构建一种基于纳米材料修饰 电极快速定量检测单增李斯特菌的电化学发光检测方法(1)ZnO-3DNGH复合材料 具备较好的三维结构、较大的比表面积、较高的机械强度和导电性。(2)将适配体 与ZnO-3DNGH复合材料通过共价结合连接在电极表面，使得修饰电极同时兼顾适配 体的生物活性和电化学发光信号的顺利输出。(3)该方法具有较高的特异性和灵敏 度，能够用于猪肉和牛奶中单增李斯特菌的定量检测。首先，以石墨粉为原料，采 用Hummers法制备氧化石墨烯，然后又以氧化石墨烯为原料，以甘氨酸为还原剂， 采用一步还原法制备氧化锌三维氮掺杂石墨烯ZnO-3DNGH，用ZnO-3DNGH复合材 料修饰电极。然后，以联吡啶钌为发光材料，戊二醛作为交联剂，将氨基化的单增 李斯特菌适配体固定在铂电极表面，完成电极的修饰。通过加入目标物前后引起交 流阻抗谱值的变化实现信号输出。本申请将高特异性适配体和ZnO-3DNGH纳米材料 联用，在保证高特异性的同时极大地提高了灵敏度，且检测成本较低，可以实现快速检测。本方法具有高灵敏度、高特异性、成本低、线性范围广，S/N＝3时，检测限 为5CFU.mL

相较于CN109211989A专利，本申请最大的优势是在氧化石墨烯的基础上构建了氧化锌三维氮掺杂石墨烯(ZnO-3DNGH)，用ZnO-3DNGH复合材料修饰电极，大大 增加了电极的比表面积、机械强度和导电性。相较于CN104634847A构建的基于抗体 夹心模式传感，本申请最大的优势是将单增李斯特菌的适配体固定在修饰电极表面， 适配体较抗体合成快速，成本较低，易于修饰。基于ZnO-3DNGH复合材料和核酸适 配体识别实现食品中单增李斯特菌的快速超灵敏检测方法还未见报道。

发明内容

本发明提供了一种基于纳米材料和核酸适配体的电化学发光生检测方法用于单增李斯特菌的检测。本方法具有灵敏度高、特异性好、易操作的优点。鉴于此，本 申请提供以下技术方案：

本申请提供一种基于纳米材料修饰电极快速定量检测单增李斯特菌的电化学检测方法，主要包括：(1)纳米材料(2)电极的修饰(3)单增李斯特菌的检测

所述纳米材料是指负载氧化锌的氮掺杂石墨烯纳米颗粒；

具体的，是通过两步实现的，首先，采用Hummers法制备氧化石墨烯，然后又 以氧化石墨烯为原料，硝酸锌为锌源，甘氨酸为还原剂，采用一步还原法制备，用 于提高检测方法的灵敏度。

所述电极的修饰是指将负载氧化锌的氮掺杂石墨烯纳米颗粒、金属钌配合物、 修饰化核酸适配体在电极表面进行层层组装；

所述电极为处理后的铂电极，是指用0.05～1.0μm的氧化铝抛光粉浆在麂皮上进行打磨抛光，乙醇、超纯水冲洗，将其作为工作电极，置于2～5mmol/L的铁氰化钾 和0.1～0.5mol/L的氯化钾混合溶液中，循环伏安法检测电位差小于80mV，直径为2～5 mm的铂电极。

优选的：用0.05μm的氧化铝抛光粉浆在麂皮上进行打磨抛光，乙醇、超纯水冲 洗，将其作为工作电极，置于5.0mmol/L的铁氰化钾和0.2mol/L的氯化钾混合溶液 中，循环伏安法检测电位差小于80mV的电极。

所述修饰化核酸适配体，是指能够与单增李斯特菌特异性识别的单链DNA，序 列为：5’-NH2-(CH2)6-SEQ ID NO：1-3’。

ATCCATGGGGCGGAGATGAGGGGGAGGAGGGCGGGTACCCGGTTGAT(SE Q ID NO：1)

所述层层组装是指将负载氧化锌的氮掺杂石墨烯纳米颗粒、联吡啶钌、氨基化 核酸适配体在处理后的铂电极表面依次滴涂、干燥，进行层层组装，纳米材料的浓 度是1.0～5.0mg/mL，用量2～10μL，滴涂到电极表面进行孵育的时间是5～30min,温度 是15～37℃。联吡啶钌的浓度是0.5～5.0mmoL/L，用量2～10μL，滴涂到电极表面进 行孵育的时间是5～30min,温度是15～37℃。氨基化核酸适配体的浓度是2～10 μmoL/L，用量是2～10μL，避光孵育0.5～4h。

优选的：纳米材料的浓度是2.0mg/mL，用量5μL，滴涂到电极表面进行孵育的 时间是15min,温度是37℃。联吡啶钌的浓度是1.0mmol/L，用量5μL，滴涂到电极 表面进行孵育的时间是15min,温度是37℃。氨基化核酸适配体的浓度是5μmol/L， 用量是5μL，避光孵育2h。

所述单增李斯特菌的检测是指将修饰电极置于发光底液中，由于适配体与靶标的特异性结合，使得电化学发光信号发生一定程度的改变，从而实现定量测定。

所述底液可以满足联吡啶钌稳定发光的底液，包括：10～100mmol/L TPA，0.1 ～1mol/L PBS，pH＝6～8。；

优选的：50mmol/L TPA，0.1mol/L PBS，pH＝7.4。

该检测方法在畜产品中单增李斯特菌检测中的应用。

最后，利用该策略成功实现了牛奶和猪肉中单增李斯特的检测，检测限达到5CFU/mL。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

1.本方法与传统的检测方法相比，具有高灵敏度、高特异性、成本低、线性范 围广等特点，可快速地实现对单增李斯特菌的定量检测。

2.本发明中的传感策略共包含有三重级联放大：ZnO-3DNGH复合材料电信号 增强、核酸适配体识别、电致发光信号捕捉，这对灵敏度和特异性提供了双重保障。

3.构建复合纳米材料时适当加入氧化锌，能够改善电极导电性能，有利于输出 信号的放大。

4.选择ZnO-3DNGH修饰电极，Ru(bpy)3

5.通过使用目标菌对应的具有高亲和力的核酸适配体，并将其构建到修饰电极表面，有效地解决了传感系统的特异性和灵敏度差的难题。

6.本发明中样品无需提取目标菌的基因组，样品前处理简单，易于操作，成本 低，效果明显。

7.本发明建立的方法对纯培养中的单增李斯特菌在15to 1.5×10

附图说明

图1为本发明所建方法快速检测单增李斯特菌原理图。

图2为利用SEM和XPS对ZnO-3DNGH复合材料的表征结果图。A：GO形貌图 B：ZnO-3DNGH形貌图C:ZnO-3DNGH形貌图D：ZnO-3DNGH能谱分析C元素

E：ZnO-3DNGH能谱分析N元素F：ZnO-3DNGH能谱分析Zn元素

图3为利用IR和Uv-vis对ZnO-3DNGH复合材料的表征结果图。A:红外光谱图B: 紫外可见光谱图

图4为不同修饰电极的奈奎斯特图谱

图5为该方法的可行性验证结果图。A:不同修饰电极示意图B:裸电极发光图C: 修饰电极发光图D：修饰电极检测靶标发光图

图6为实验条件的优化。A:适配体连接到电极表面时间的优化B:适配体浓度的 优化C:适配体与靶标孵育时间的优化D:TPA浓度的优化

图7为不同单增李斯特菌浓度与电化学发光强度变化量的线性关系及其对应光谱图。A:不同浓度单增李斯特菌的电化学发光图B：单增李斯特菌浓度对数与发光 强度变化值线性拟合图

图8为方法特异性结果。

具体实施方式

本发明公开了一种单增李斯特菌的快速检测方法，本领域技术人员可以借鉴 本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对 本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及 应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神 和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发 明技术。

实施例1快速检测单增李斯特菌方法的原理

快速检测单增李斯特菌方法的原理如图1所示，首先，在处理后的铂电极表面修饰上ZnO-3DNGH复合材料，以壳聚糖作为固化剂，将Ru(bpy)

实施例2负载氧化锌的氮掺杂石墨烯纳米颗粒的制备及表征

首先，称取1g的石墨粉于烧杯中，依次加入120mL的浓硫酸溶液和15mL的磷 酸，充分搅拌30min，控制其混合时温度不超过10℃，此时反应溶液呈粘稠状黑色 液体，再称取6g的高锰酸钾，多次缓慢加入，2h内加完，充分搅拌，保证反应温度 不超过20℃，此时溶液由黑色变为墨绿色。将烧杯至于50℃的油浴锅中，磁力搅 拌12h，之后转至室温冷却，此时，反应溶液呈粘稠状，颜色为深紫色。接着，在搅 拌的状态下向反应溶液中缓慢加入100mL超纯水，以除去未反应完的高锰酸钾，反 应体系温度会逐渐升高，控制其反应温度在95℃，搅拌1h后冷却至室温，此时反应 体系的颜色变为深棕色。然后再向反应体系滴加少量的30％过氧化氢溶液，此时溶 液颜色会由深棕色变为亮黄色，且伴随着气体的放出。将上述溶液进行抽滤，弃去 滤液，将滤饼分别用5％的稀盐酸、超纯水和无水乙醇进行洗涤，以除去多余的杂质 和SO

称取上述制备的GO固体粉末20mg，配制10mL的2mg/mL的GO溶液，超声分 散，再称取80mg的甘氨酸加入到GO溶液中继续超声，使其分散均匀，然后再向上 述溶液中加入100mg的Zn(NO

为了确保本发明设计的可行性，利用扫描电镜、能谱、红外和紫外对ZnO-3DN GH的成功制备进行了验证，如图2，图3所示，GO表面具有丰富的含氧集团，呈现良 好的层状结构，ZnO-3DNGH纳米材料呈现明显的交联孔状三维结构，且元素分散均 匀。均说明纳米材料制备成功。

实施例3电化学发光适配体修饰电极的构建

将2mg的ZnO-3DNGH固体溶解到1mLDMF溶液中配置成2.0mg/mL的溶液， 取5μL的ZnO-3DNGH溶液滴加在表面干燥的裸电极表面，37℃培育15min，再在 修饰电极表面滴加5μL的浓度为1.0mmoL/L的Ru(bpy)

实施例4快速检测单增李斯特菌方法的可行性

为了验证快速检测单增李斯特菌方法的可行性，记录了不同修饰电极的奈奎斯特图谱。采用三电极体系，修饰后的铂电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/Ag Cl电极为参比电极，置于含有5mmol/L铁氰化钾和0.2mol/L的氯化钾的探针溶液中， 然后以0.05V/s的扫描速率记录1～106Hz频率范围内的EIS图谱，裸铂电极表面电子 传递电阻(Ret)为128Ω，见图4a；当ZnO-3DNGH复合材料加载在电极表面时，其 电子传递电阻约为76Ω，见图4b；当适配体连接在电极表面时，电阻值增强约为17 9Ω，见图4c；当修饰电极与2.1×105CFU/mL单增李斯特菌孵育30min后，用无菌 水冲洗电极表面后测定阻值为280Ω，见图4d。

将修饰电极与浓度为1.7×10

实施例5快速检测单增李斯特菌方法的条件优化

随后，对适配体连接到电极表面时间在0.5～2.5h范围内、适配体浓度在1～8μmol/L范围内，适配体与靶标孵育时间在5～40min范围内和TPA浓度在0.01～0.10mol/L 范围内的优化实验。

1.适配体连接到电极表面时间的优化

将2mg的ZnO-3DNGH固体溶解到1mLDMF溶液中配置成2.0mg/mL的溶液， 取5μL的ZnO-3DNGH溶液滴加在表面干燥的裸电极表面，37℃培育15min，再在 修饰电极表面滴加5μL的浓度为1.0mmoL/L的Ru(bpy)

2.适配体浓度的优化

将2mg的ZnO-3DNGH固体溶解到1mLDMF溶液中配置成2.0mg/mL的溶液， 取5μL的ZnO-3DNGH溶液滴加在表面干燥的裸电极表面，37℃培育15min，再在 修饰电极表面滴加5μL的浓度为1.0mmoL/L的Ru(bpy)

3.适配体与靶标孵育时间的优化

电极的修饰与上述相同。将5根修饰电极与同一浓度的单增李斯特菌液室温下分别孵育5～40min，用超纯水冲洗电极表面，在50mmol/L TPA(0.1mol/L PBS，p H＝7.4)溶液中采用三电极体系进行循环伏安检测，三电极系统是由修饰的铂电极作 为工作电极，铂丝电极作为对电极和Ag/AgCl电极作为参比电极，设定扫速为0.1V/ s、高电位为1.2V、低电位为0.2V，测定发光强度。随着适配体与靶标孵育时间的 增长，ECL信号逐渐减弱，当到达30min以后，ECL信号基本保持不变，因此，本实 验选择30min为单增李斯特菌最佳孵育时间，如图6C所示。

4.TPA浓度的优化

电极的修饰与上述相同。将5根修饰电极与同一浓度的单增李斯特菌液室温下孵育30min，用超纯水冲洗电极表面，分别在0.01～0.1mol/L TPA(0.1mol/L PBS，p H＝7.4)溶液中采用三电极体系进行循环伏安检测，三电极系统是由修饰的铂电极作 为工作电极，铂丝电极作为对电极和Ag/AgCl电极作为参比电极，设定扫速为0.1V/ s、高电位为1.2V、低电位为0.2V，测定发光强度。在不同浓度的TPA溶液中检测E CL信号发现，随着浓度的增加，ECL信号逐渐增强，当TPA浓度为0.05mol/L时，E CL信号达到最强，之后随着TPA浓度继续加强，ECL信号反而下降，因此，TPA的最 佳浓度为0.05mol/L，如图6D所示。

通过适配体连接时间、适配体浓度、适配体靶标孵育时间和TPA浓度的优化，得 到最佳适配体连接到电极表面时间为2h，适配体浓度为5μmol/L，适配体与靶标孵 育时间为30min，TPA浓度为0.05mol/L。

实施例6快速检测单增李斯特菌方法的灵敏度

首先将单增李斯特菌菌液以七倍梯度稀释，同时做平板计数，将修饰电极与不 同浓度的单增李斯特菌液室温下孵育30min，用超纯水冲洗电极表面，在50mmol/ L TPA(0.1mol/L PBS，pH＝7.4)溶液中采用三电极体系进行循环伏安检测，三电 极系统是由修饰的铂电极作为工作电极，铂丝电极作为对电极和Ag/AgCl电极作为参 比电极，设定扫速为0.1V/s、高电位为1.2V、低电位为0.2V。测定发光强度，记 做I

实施例7快速检测单增李斯特菌方法的特异性

为了评估所提出方法的特异性，选择可能存在于畜产品中的四种常见的致病微生物(金黄色葡萄球菌CICC21600、大肠杆菌CICC10389、福氏志贺菌CMCC51302、 枯草芽孢杆菌CICC10732、沙门氏菌CICC21482)作为阴性参考，将6根修饰电极 分别与同一浓度(1×10

实施例8畜产品中单增李斯特菌的快速测定

将上述优化的实验方法应用于猪肉和牛奶中单增李斯特菌的测定。样品测定采用加标回收方法进行，分别称取三份25.0g猪肉样品，再分别取1mL三个不同浓度 梯度的单增李斯特菌菌液放入猪肉样品中，然后将其放入盛有225mL的无菌生理盐 水的均质袋中，用均质机进行拍打1～2min混匀，然后对该三份样品进行测定，并与 平板计数方法进行结果验证。对于牛奶样品的检测，分别称取三份25mL牛奶，再分 别取1mL三个不同浓度梯度的单增李斯特菌加入到牛奶中，然后将其放入盛有225 mL的无菌生理盐水的均质袋中，用均质机进行拍打1～2min混匀，最后对选取三个 梯度进行样品测定，同时进行平板培养计数，进行结果验证。与上述测定条件一致， 测定发光强度差值，计算加标回收率，猪肉汤中不同浓度单增李斯特菌检测回收率 在91.4％～104.2％之间；牛奶中不同浓度单增李斯特菌检测回收率在96.7％～103.6 ％之间，表明该方法对于实际检测具有良好的应用前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进 和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业大学

河南牧业经济学院

<120> 一种基于纳米材料修饰电极快速定量检测单增李斯特菌的电化学发光检测方法

<130> 1

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atccatgggg cggagatgag ggggaggagg gcgggtaccc ggttgat 47