一种特异性鉴定嘉兴槜李种质的ISSR分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及一种特异性鉴定嘉兴槜李种质的ISSR分子标记及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

槜李(Prunus salicina Lindl.)是蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus L.)植物，原产于浙江省嘉兴市，桐乡槜李于2011年获农产品地理标志保护登记。槜李果实熟透后果肉化成浆液，有酒香味，品质上乘，经济价值高。目前除浙江嘉兴的桐乡、海宁、海盐、湖州等地有槜李栽培外，在江苏、安徽等省也有少量引种。

槜李多采用嫁接繁殖，在不同栽培区域进行引种嫁接，极易造成同名异物及同物异名的现象。另外槜李受不同栽培管理方法、土壤及气候条件的影响，果实在成熟期的生物学特性及品质外观方面呈现一定的差异，市场上鱼目混珠给消费者带来极大困惑。

传统的植物分类方法是借助于对植物形态构造、生活习性等进行比较研究，随着科技的不断进步，植物分类方法逐步发展到分子生物学方法。由于槜李的果实外观受不同栽培管理方法、土壤及气候条件的影响，果实色泽往往不同，仅仅依靠果实形态来区分槜李与其他品种李难度较大，依靠传统的形态分类学方法在嘉兴槜李的鉴别上存在局限性。鉴于嘉兴槜李在地方特产及农业领域的重要地位，针对嘉兴槜李建立一套可靠的分子鉴定方法势在必行，对于嘉兴槜李的种质资源保护具有重要意义。

由于植物性状通常受环境因素和遗传基因的影响导致品种特性发生改变，仅靠形态特征较难区分开来，不利于种质资源保护及开发利用。分子标记技术不受环境条件和植物生长发育的影响，已被广泛用于植物种质资源的遗传多样性及亲缘关系分析，为分子辅助育种提供技术支持。ISSR是由Zietkiewicz等人于1994年创建的一种简单序列重复区间扩增多态性分子标记，具有实验操作快速简单高效、遗传重复性好、多态性高等优点，二十余年来已广泛地应用于品种鉴定、系统发育、分子标记育种等方面。乔玉山及

发明内容

本发明提供了一种ISSR分子标记引物，使用该引物可以简单方便地通过PCR方法来鉴别嘉兴槜李种质。所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述ISSR分子标记引物特征在于，序列为：5’-NAGAGAGAGAGAGAGAGYT-3’，其中Y＝(C,T),N＝(A,G,C,T)。

本发明通过设计和筛选获得一个可以特异性鉴定嘉兴槜李种质的ISSR分子标记，该标记包含一条引物，利用该引物对李品种的基因组DNA进行PCR扩增，通过扩增产物大小的多态性即可鉴定嘉兴槜李种质。

本发明提供了一种ISSR分子标记引物在鉴定嘉兴槜李或在制备鉴定嘉兴槜李的产品中的应用，所述引物序列为：5’-NAGAGAGAGAGAGAGAGYT-3’，其中Y＝(C,T),N＝(A,G,C,T)。

本发明还提供了一种用于嘉兴槜李的分子鉴定试剂盒，所述试剂盒含有上述ISSR分子标记引物，所述引物序列为：5’-NAGAGAGAGAGAGAGAGYT-3’，其中Y＝(C,T),N＝(A,G,C,T)。

在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒中还含有PCR扩增所需试剂。

在本发明的一种实施方式中，所述PCR扩增的体系为：2.0μL 10×PCR缓冲液，0.5μLdNTP混合液，2.0μL ISSR分子标记引物，1.0μL样品DNA模板，0.2μL Taq DNA聚合酶，补ddH

本发明还提供了一种鉴别嘉兴槜李种质的方法，所述方法为，提取待测样本的基因组DNA作为模板，用ISSR分子标记引物进行PCR扩增并检测，若出现一条大小为400bp的特异性条带，则待检测李样品为嘉兴槜李，所述引物序列为：5’-NAGAGAGAGAGAGAGAGYT-3’，其中Y＝(C,T),N＝(A,G,C,T)。

在本发明的一种实施方式中，所述PCR扩增的体系为：2.0μL 10×PCR缓冲液，0.5μLdNTP混合液，2.0μL ISSR分子标记引物，1.0μL样品DNA模板，0.2μL Taq DNA聚合酶，补ddH

在本发明的一种实施方式中，所述PCR扩增条件为：

94℃预变性90s；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃延伸5min。

在本发明的一种实施方式中，所述样品DNA模板的浓度为20ng/μL。

在本发明的一种实施方式中，所述ISSR分子标记引物的浓度为2.5μM。

在本发明的一种实施方式中，提取DNA时，可以采用李的叶片、茎、花等组织。对李DNA的提取方法也没有特殊要求，可以为CTAB法、SDS提取法、ROSE一管法、TPS提取法等，也可以直接采用商用试剂盒进行DNA的提取。

在本发明的一种实施方式中，所述PCR扩增的体系和条件影响鉴别的准确性。

在本发明的一种实施方式中，由于本发明在设计时，产生的特异性片段的大小为400bp左右，因此，可采用一般的琼脂糖凝胶进行电泳分析即可，琼脂糖的浓度可以为1.5％。

本发明还提供了上述试剂盒或上述方法在鉴定嘉兴槜李种质中的应用。

有益效果

(1)本发明ISSR标记引物能够有效鉴别嘉兴槜李种质，且使用PCR的方法与传统的测序等方法相比，检测速度快、成本低、操作简单。

(2)本发明的ISSR标记引物具有特异性好、稳定性好的优点，使用所述分子鉴定试剂盒和方法，可以实现对嘉兴槜李的快速鉴定，避免因居群间的多样性而导致假阳性的发生，适用于市场上及生产中对嘉兴槜李种质的快速鉴定。

附图说明

图1：嘉兴槜李果实照片。

图2：本发明的ISSR标记对嘉兴槜李及其他品种李的PCR扩增结果电泳图，其中，泳道2～26分别为：浙江嘉兴槜李(早熟)(P1)、浙江嘉兴槜李(中熟)(P2)、浙江嘉兴槜李(晚熟)(P3)、浙江宁波茄皮李(P4)、浙江舟山金塘李(P5)、福建芙蓉李(P6)、湖北玉皇李(P7)、贵州九阡李(P8)、浙江桐乡黄姑李(P9)、安徽麦黄李(P10)、江西朱砂李(P11)、山东牛心李(P12)、黑龙江龙园秋李(P13)、日本大石早生(P14)、日本白李(P15)、日本秋姬(P16)、日本珍珠李(P17)、美国恐龙蛋(P18)、美国拉罗达(P19)、美国红心(P20)、美国幸运(P21)、美国威克生(P22)、美国玫瑰皇后(P23)、美国安哥里诺(P24)、新西兰密斯李(P25)，M为DL2000plus DNAmarker，箭头所示条带为槜李种质特异性条带。

图3：ISSR-1～ISSR28标记引物筛选结果。

图4：本发明筛选的12条ISSR标记引物对嘉兴槜李的分子鉴定结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式进一步阐释本发明。下述实施例中所涉及的PCR缓冲液为TAKARACode:DR100A附带的缓冲液。

下述实施例中所涉及的样品信息如表1所示：

表1：实施例中所涉及的样品信息

下述实施例中所涉及的CTAB法提取DNA的方法如下：

(1)取不同品种李新鲜叶片，加液氮研磨成粉末状，迅速移入2.0mL Eppendorf管中；

(2)加入800μL CTAB提取缓冲液,混匀(CTAB在65℃水浴预热)，每5min轻轻震荡几次,20min后12000r/min，离心15min；

(3)小心吸取上清液，加入等体积的酚：氯仿(各400μL)溶液，混匀，4℃，12000r/min，离心10min；

(4)小心吸取上清液，加入等体积的氯仿，混匀，4℃，12000r/min，离心10min。

(5)重复步骤(4)1-2次，以不出现蛋白层为止；

(6)取上清，-20℃沉淀1h，4℃，12000r/min，离心10min；

(7)弃去上清液，用70％乙醇洗涤沉淀2次；

(8)室温干燥5-15min，溶于50μLDEPC去离子水中，于-20℃保存备用。

实施例1：嘉兴槜李的分子鉴定所需引物的筛选

选取文献报道的28条ISSR引物，部分引物进行改造后，用于嘉兴槜李分子鉴定候选引物(表2)。其中ISSR-1～ISSR-28的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.28所示。选取从浙江省嘉兴市李子园艺科学研究所取样的表1中的嘉兴槜李(早熟)(P1)、浙江嘉兴槜李(中熟)(P2)样品作为筛选样品。

表2：ISSR引物序列

Note：N＝(A,G,C,T)，R＝(A,G)，Y＝(C,T)，B＝(C,G,T)，D＝(A,G,T)，H＝(A,C,T)，V＝(A,C,G)。

具体步骤如下：

(1)利用CTAB法分别提取P1、P2样品基因组DNA。

(2)PCR扩增使用rTaq(Takara，大连，中国，TAKARACode:DR100A)。

PCR扩增体系为：10×PCRbuffer(Mg

PCR扩增条件为：94℃预变性90s；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃延伸5min。

(3)采用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

结果如图3所示，结果显示：ISSR-3、ISSR-8、ISSR-11、ISSR-12、ISSR-15、ISSR-20、ISSR-24、ISSR-28引物扩增条带少或不清晰。

从28条引物中筛选出ISSR-1、ISSR-4、ISSR-5、ISSR-7、ISSR-9、ISSR-10、ISSR-13、ISSR-14、ISSR-18、ISSR-19、ISSR-23、ISSR-26共12条引物用于鉴定嘉兴槜李的候选标记引物。

实施例2：嘉兴槜李的分子鉴定

分别从浙江省嘉兴市李子园艺科学研究所取样，25个鉴定样品(表1)分别为浙江嘉兴槜李(早熟)(P1)、浙江嘉兴槜李(中熟)(P2)、浙江嘉兴槜李(晚熟)(P3)、浙江宁波茄皮李(P4)、浙江舟山金塘李(P5)、福建芙蓉李(P6)、湖北玉皇李(P7)、贵州九阡李(P8)、浙江桐乡黄姑李(P9)、安徽麦黄李(P10)、江西朱砂李(P11)、山东牛心李(P12)、黑龙江龙园秋李(P13)、日本大石早生(P14)、日本白李(P15)、日本秋姬(P16)、日本珍珠李(P17)、美国恐龙蛋(P18)、美国拉罗达(P19)、美国红心(P20)、美国幸运(P21)、美国威克生(P22)、美国玫瑰皇后(P23)、美国安哥里诺(P24)、新西兰密斯李(P25)。槜李果实照片参见附图1。

具体步骤如下：

(1)利用CTAB法分别提取上述P1～P25李叶片的基因组DNA，采用去离子水将样品DNA浓度稀释至20ng/μL。

(2)利用实施例1筛选得到的12条ISSR引物进行PCR扩增，PCR扩增使用rTaq(Takara，大连，中国，TAKARACode:DR100A)。

ISSR引物序列为：

ISSR-1：5’-AGAGAGAGAGAGAGAGT-3’；

ISSR-4：5’-GAGAGAGAGAGAGAGAT-3’；

ISSR-5：5’-ACACACACACACACACC-3’；

ISSR-7：5’-TGTGTGTGTGTGTGTGC-3’；

ISSR-9：5’-NAGAGAGAGAGAGAGAGYT-3’；

ISSR-10：5’-DAGAGAGAGAGAGAGAGYA-3’；

ISSR-13：5’-NCACACACACACACACARC-3’；

ISSR-14：5’-DCACACACACACACACARG-3’；

ISSR-18：5’-ACACACACACACACACYT-3’；

ISSR-19：5’-NACACACACACACACACYG-3’；

ISSR-23：5’-GGGTGGGGTGGGGTG-3’；

ISSR-26：5’-DBDACACACACACACAC-3’；

PCR扩增体系为：10×PCRbuffer(Mg

PCR扩增条件为：94℃预变性90s；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃延伸5min。

(3)不同样品的ISSR分析

将得到的PCR扩增产物使用1.5％琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行检测，鉴定。其中电泳缓冲液为：1×TAE，时间为：45min，电泳图谱如图4所示。

结果显示：ISSR-9分子标记引物能在不同成熟期嘉兴槜李(P1、P2、P3)中扩增获得一条特异的400bp左右的特异条带(图4中用箭头标出)，为了清楚表示，将ISSR-9标记序列的结果放置于图2显示，结果显示，其他品种李中未能扩增获得该条带。

其他11条标记引物在嘉兴槜李中均未检测到特异条带。

因此，ISSR-9可以作为一种特异性鉴定嘉兴槜李种质的ISSR分子标记，使用该标记在本发明所述的检测条件下获得的400bp左右的条带为嘉兴槜李特异条带。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。