SlTCP14基因或其相关生物材料在改良番茄性状中的应用

技术领域

本发明属于生物技术和遗传育种领域，具体涉及SlTCP14基因或其相关生物材料在改良番茄性状中的应用。

背景技术

番茄作为中国主要的设施栽培农作物，是典型的喜光植物。目前对番茄品质和产量的研究主要集中在番茄果实上，对叶片的研究较少。叶片是植物的重要器官，植物可以通过光合作用等功能为其生长发育提供源源不断的动力。在植物的进化过程中，其叶片千差万别，不同植物的叶片在形状、大小甚至颜色存在差异；同一植株不同发育时期叶片也不尽相同。番茄叶片的叶绿素含量影响番茄的光合作用以及淀粉积累，进而影响番茄的果实发育和果实品质。

叶片颜色主要受叶绿素、类胡萝卜素等化其组织内的化学物质的共同影响，正常光合作用的叶片大多呈现绿色，但在不同环境中叶片颜色也有较大差异。Os PL6基因突变，可导致水稻中花色苷积累，叶片呈紫色，使水稻叶片的光合效率降低。在番茄中，沉默BR受体SlBRI1，可以导致番茄叶片蜷曲和深绿。转录因子作为基因启动子区的结合蛋白，也可以调控植物中叶绿素含量，例如，在番茄中过表达GLK2基因可增加色素含量。

TCPs是一类植物特有的转录调控因子，在植物发育过程中具有重要作用。1999年,Cubas等首次报道了TCP基因家族。拟南芥的AtTCP14和AtTCP15调节节间长度和叶片形状；玉米中的BAD1通过促进叶枕中的细胞增殖，可调节玉米侧枝从主茎分化的角度从而影响玉米株型。TCP蛋白作用的分子途径及其与DNA互作模式的相关研究已经取得了较大进展，但是在番茄中的作用尚未见报道。

发明内容

本发明的目的之一是提供SlTCP14基因或其相关生物材料在改良番茄性状中的应用，所述生物材料为含有所述SlTCP14基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；

所述性状包括株高、叶片干物质重和叶绿素含量；

所述SlTCP14基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，所述SlTCP14基因在番茄中的活性和/或表达量提高，所述番茄的株高、叶片干物质重和叶绿素含量提高。

本发明的目的之二是提供一种改良番茄性状的方法，包括上调所述SlTCP14基因的表达，从而使番茄株高、叶片干物质重和叶绿素含量提高，所述SlTCP14基因的序列如SEQID NO.1所示。

进一步的，上调SlTCP14基因的表达包括：将所述SlTCP14基因或含有该基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系转入番茄中。

本发明的目的之三是提供一种定向选择或鉴定优良性状番茄的方法，所述方法包括：鉴定测试番茄中SlTCP14基因的表达，所述SlTCP14基因的序列如SEQ ID NO.1所示；

若是该测试番茄的SlTCP14基因表达显著高于该类番茄的平均表达值，则为优良性状番茄，表现为株高、叶片干物质重和叶绿素含量提高。

进一步的，通过荧光定量PCR法鉴定测试番茄中SlTCP14基因的表达。

更进一步的，荧光定量PCR法鉴定所用引物的序列如SEQ ID NO.4-5所示。

本发明具有如下有益效果：

本发明公开了一种番茄TCP转录因子家族成员在调控番茄生长发育的应用。本发明所提供的应用为SlTCP14基因提高番茄株高、叶片干物质重和叶绿素含量的应用。本发明利用引导外源基因在植物中表达的载体，将SlTCP14基因导入番茄细胞中进行过表达，可提高番茄株高、叶片干物质重和叶绿素含量。本发明对番茄高产的分子机制研究，以及高品质品种选育具有重要的理论及实际意义。

附图说明

图1为pBWA(V)HS-SlTCP14大肠杆菌菌液PCR产物凝胶电泳图，M:DL2000DNAmarker；1-4，目的片段。

图2为番茄转基因植株的获得，A：无菌苗；B：共培养；C：生芽培养；D：生根培养；E：炼苗；F：移栽。

图3为SlTCP14过表达植株叶片的表达量分析，与正常AC番茄叶片相比，*表示差异达显著水平(P<0.05),**表示差异极显著水平(P<0.01)

图4为AC和OE-SlTCP14番茄株高发育对比(A)及定量统计(B)。

图5为SlTCP14过表达植株叶绿素含量，与正常AC番茄叶片相比，*表示差异达显著水平(P<0.05),**表示差异极显著水平(P<0.01)。

图6为AC和OE-SlTCP14番茄干物质重，正常AC番茄叶片相比，*表示差异达显著水平(P<0.05),**表示差异极显著水平(P<0.01)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：过表达载体pBWA(V)HS-SlTCP14的构建

提取番茄RNA，并反转录cDNA，以cDNA为模板，扩增SlTCP14目的片段(序列如SEQID NO.1所示)；将目标片段与线性化的pBWA(V)HS载体连接(粘性末端Bsa I/Eco31 I)，获得重组质粒pBWA(V)HS-SlTCP14。然后进行大肠杆菌转化，筛选单克隆的大肠杆菌菌液进行PCR扩增鉴定(如图1)，菌液均扩增出与目的基因(798bp)大小一致的条带。然后进行测序，将测序正确的菌液提取质粒，采用液氮冻融法将重组质粒转入农杆菌感受态GV3101中，用于番茄的遗传转化。

扩增SlTCP14目的片段的引物序列如下：

SlTCP14-F(SEQ ID NO.2):5'-ATGTCGACGTCTGCAGA-3'；

SlTCP14-R(SEQ ID NO.3):5'-ACGTCCGTCGTCGTC-3'。

实施例2：番茄的遗传转化

以AC番茄(以下或简称为AC)为试材，将重组载体质粒通过叶盘法转化入番茄中，获得稳定遗传转化材料。待培养基中的番茄幼苗生长至子叶完全舒展时(图2A)，切取0.5cm长的子叶放置于预培养基中暗培养2d后，农杆菌侵染番茄子叶，侵染后叶背面朝上放置于共培养基中，暗培养2d后，转入生芽培养基中培养(图2B)，之后间隔两周更换一次培养基。当长出不定芽后将其转移到生芽瓶中(图2C)，当不定芽生长至2-3cm时，从茎基部切下不定芽，放入生根培养基中培养(图2D)。待不定芽生根后，将完整的植株从培养瓶中取出洗净培养基后置于山崎营养液中炼苗(图2E)，当植株适应外界环境后移植在营养钵中培养，获得过表达SlTCP14转基因番茄植株(图2F)。

实施例3：过表达转基因番茄叶片中SlTCP14表达量的分析

为了明确SlTCP14的表达水平，以正常AC番茄叶片为对照，提取RNA并反转录为cDNA。利用SlTCP14的实时定量引物(F(SEQ ID NO.4)：TCGACGTCTGCAGAGGG；R(SEQ IDNO.5)：CTGAAAAACTCTTGCCGCA))，以Actin基因为内参，进行qRT-PCR分析。

如图3所示，过表达转基因株系叶片中的表达量与AC相比均显著升高，这表明过表达载体pBWA(V)HS-SlTCP14已成功转化到AC番茄中。其中4号，17号，18号株系表达量水平显著高于AC番茄14—17倍，其他株系也提高了5倍左右。因此选择4号，17号，18号这三株过表达效率高的转基因株系进行后续试验。

实施例4：过表达转基因番茄性状测定

1、株高测量

通过对选择的三株转基因株系表型初步分析。与野生型相比转基因株系的株高较高(图4，A)，通过对3株高的测量发现，转基因株系的株高显著高于AC番茄(图4，B)。

2、叶片叶绿素含量的测定

称取0.2g叶片，放入50ml离心管中，离心管中事先加入25ml在95％的乙醇溶液，将离心管放在避光处，过夜浸泡，直至叶片全部退绿脱色。用紫外分光光度计测量溶液分别在470nm，649nm和665nm波长处的吸光值，用95％的乙醇溶液做为对照。按以下公式计算叶绿素含量：

Ca＝13.95*D665-6.88*D649

Cb＝24.96*D649-7.32*D665

叶绿素含量(mg/g)＝色素浓度C*提取液体积(L)/样品鲜重

通过对T0代转基因株系的叶绿素含量测定发现，其叶绿素含量显著高于AC番茄(图5)。

3、干物质测定

为了验证叶绿素含量的升高是否对叶片干物质重产生影响。称取AC番茄和OE4，OE17,OE18三株转基因株系各1.5g新鲜叶片，105℃杀青30分钟，65℃烘箱5小时对叶片进行烘干，称量干物质重量。如图6所示，转基因株系的叶片干重显著高于AC番茄。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。