一种丹参生长调节菌悬液及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体来说是一种丹参生长调节菌悬液及其制备方法和应用。

背景技术

天然丹参素(tanshinol)为唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bge)的主要水溶性成分，化学名为D-(+)-β-(3,4-二羟基苯基)乳酸。丹参素，又称丹参酸A，酚性芳香酸类化合物，棕黄色粉末或黄色粉末，是中药丹参中主要的水溶性成分，适用于胸痹血瘀症候，如胸闷、心悸、心绞痛，急慢性心肌梗塞，缺血性脑中风，脑梗塞或中风后遗症。丹参素具有扩张冠状动脉，抑制血小板聚集，降低血浆粘度，加速红细胞流速的作用，从而有利于改善微循环和预防血栓的形成。

丹参酮亦称总丹参酮。是从中药丹参(唇形科植物丹参Salvia miltiorrhizaBunge根)中提取的具有抑菌作用的脂溶性菲醌化合物，从中分得丹参酮I、丹参酮ⅡA、丹参酮ⅡB、隐丹参酮、异隐丹参酮等10余个丹参酮单体，其中隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅱ，羟基丹参酮、丹参酸甲酯、丹参酮ⅡB 5个单体具有抗菌作用，尚有抗炎、降温作用。丹参酮ⅡA的磺化产物丹参酮ⅡA磺酸钠能溶于水，经临床试用证明治疗心绞痛效果显著，副作用小，为一治疗冠心病的新药；总丹参酮有抗菌、消炎、活血化瘀、促进伤口愈合等多方面作用，长期服用未见有明显副作用。

现有技术中往往通过采用植物生长调节菌悬液来对丹参进行研究，研究的重点在于如何促进丹参的快速繁殖，而结果表明采用常规的植物生长调节菌悬液往往仅能够增产，不能够提升丹参的品质；另外，采用植物生长调节菌悬液往往会导致对丹参的品质产生副作用，例如壮根灵和多效唑共同作用下易于显著的降低丹参的抗氧化活性，因此需要一种应用于丹参的生长调节菌悬液来替代现有的植物生长调节菌悬液，不仅能够促进丹参生长而且能够提升丹参内部丹参素和丹参酮成分含量，继而提升丹参的品质和药用价值。

发明内容

针对上述存在的技术不足，本发明的目的是提供一种丹参生长调节菌悬液及其制备方法和应用，本发明在丹参内生真菌菌剂、

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种丹参生长调节菌悬液，由如下重量份数的原料制成：

水溶性蛋白质10-15份；丹参内生真菌菌剂3-9份；

优选的，包括如下步骤：

(1)按照如下重量份数的原料称取：水溶性蛋白质10-15份；丹参内生真菌菌剂3-9份；

(2)将水溶性蛋白质和低聚壳寡糖依次溶解于MS液体培养基内并混合均匀，灭菌，冷却至室温，加入草酸，得到培养基础液；

(3)在培养基础液内接种丹参内生真菌菌剂和

优选的，所述步骤(2)的灭菌条件为：110-120℃下灭菌30-60s或者121℃高压蒸汽灭菌15min。

优选的，所述步骤(3)的丹参内生真菌菌剂中菌体浓度为10

本发明还保护了一种丹参生长调节菌悬液在制备丹参生长、丹参素及丹参酮成分合成促进剂中的应用。

优选的，所述应用方法为：将丹参茎尖脱毒苗于培养基质内，并于培养基质内接种所述丹参生长调节菌悬液，于2000-3000lx的光照条件下照射14-16h/天，25-28℃室温环境下培养65-75d。

优选的，所述培养基质为腐殖土和沸石的混合物，所述腐殖土与所述沸石的质量比为60-70:30-40。

优选的，所述培养基质为腐殖土和沸石的混合物，所述腐殖土与所述沸石的质量比为65:35。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：

1、本发明的放线菌能显著促进丹参生长、提高产量，能大幅度提高丹参药材质量，尤其是提高丹参素的含量；草酸诱导丹参的中丹参酮和丹酚酸含量的增加，调节细胞内外钙离子分布；丹参内生真菌实现内生真菌与丹参茎和叶共存，以促进丹参生长的目的；低聚壳寡糖能够促进丹参植物及根系的生长，促进丹参酮的生成；本发明以水溶性蛋白质为碳源和氮源，MS液体培养基提供植物生长的养分和无机盐，通过丹参内生真菌菌剂、放线菌和低聚壳寡糖共同作用促进丹参的生长，同时放线菌提升丹参素的成分生成，低聚壳寡糖提升丹参酮的成分生成，草酸诱导并促进丹参素和丹参酮成分的生成。

2、丹参采用根部入药，现有技术中通过施用化学农药进行丹参病虫害防治及连作障碍修复，导致的丹参的品质下降，本申请采用菌悬液进行培育，无化学农药，促进丹参生长的同时有效的提升了丹参品质。

具体实施方式

下面结合本发明实施例，用以较佳的实施例配合详细的说明。

所述丹参内生真菌的保藏名称为草茎点霉(Phomaherbarum)D603，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2018年11月26日，保藏编号为CGMCC No16884。

所述

丹参内生真菌的分离：

(1)体积分数为75％的乙醇浸没丹参种子1min，5wt％的NaClO处理1min，使用无菌水洗涤3次，每次1min，2.5wt％PBS-Tween20溶液灭菌后，加泡种子过夜；

(2)在无菌环境中，继续将步骤1所得供试材料用无菌水冲洗3次，取100μl最后1次冲洗的无菌水冲洗液涂布接种于PDA平板上，30℃培养24h后，进行无菌验证；

(3)如无菌落产生，则继续后续的步骤4；如有菌落产生，则返回步骤1继续表面消毒处理；

(4)在超净台将之前表面灭菌处理过的种子置于无菌研钵中，加入经过灭菌处理的石英砂，研磨成粉末，并加入5mL无菌水混匀，静置15min，取100μl上清稀释涂布于改良马丁氏培养基中，置于28-32℃培养1-3天；

(5)挑取步骤4中的单菌种于改良马丁氏培养基进行划线纯化分离，置于28-32℃培养1-3天，最终得到本发明的丹参内生真菌菌株，其保藏名称为草茎点霉(P.herbarum)D603，保藏编号为CGMCCNo.16884。

实施例1

一种丹参生长调节菌悬液的制备方法，包括如下步骤：

(1)按照如下重量份数的原料称取：水溶性蛋白质13份；丹参内生真菌菌剂3份；

(2)将水溶性蛋白质和低聚壳寡糖依次溶解于MS液体培养基内并混合均匀，于110℃下灭菌60s后，冷却至室温，加入草酸，得到培养基础液；

(3)在培养基础液内接种丹参内生真菌菌剂和

丹参生长调节菌悬液在促进丹参生长、丹参素及丹参酮成分合成的应用方法，包括如下步骤：

将丹参茎尖脱毒苗于培养基质内，并于培养基质内接种所述丹参生长调节菌悬液，培养基质与菌悬液的接种质量百分比为5％，于2000x的光照条件下照射16h/天，28℃室温环境下培养65d；

培养基质为腐殖土和沸石的混合物，所述腐殖土与所述沸石的质量比为60:40。

实施例2

一种丹参生长调节菌悬液的制备方法，包括如下步骤：

(1)按照如下重量份数的原料称取：水溶性蛋白质10份；丹参内生真菌菌剂8份；

(2)将水溶性蛋白质和低聚壳寡糖依次溶解于MS液体培养基内并混合均匀，于115℃下灭菌45s后，冷却至室温，加入草酸，得到培养基础液；

(3)在培养基础液内接种丹参内生真菌菌剂和

丹参生长调节菌悬液在促进丹参生长、丹参素及丹参酮成分合成的应用方法，包括如下步骤：

将丹参茎尖脱毒苗于培养基质内，并于培养基质内接种所述丹参生长调节菌悬液，培养基质与菌悬液的接种质量百分比为8％，于2500lx的光照条件下照射15h/天，27℃室温环境下培养70d；

培养基质为腐殖土和沸石的混合物，所述腐殖土与所述沸石的质量比为65:35。

实施例3

一种丹参生长调节菌悬液的制备方法，包括如下步骤：

(1)按照如下重量份数的原料称取：水溶性蛋白质15份；丹参内生真菌菌剂9份；

(2)将水溶性蛋白质和低聚壳寡糖依次溶解于MS液体培养基内并混合均匀，于120℃下灭菌30s后，冷却至室温，加入草酸，得到培养基础液；

(3)在培养基础液内接种丹参内生真菌菌剂和

丹参生长调节菌悬液在促进丹参生长、丹参素及丹参酮成分合成的应用方法，包括如下步骤：

将丹参茎尖脱毒苗于培养基质内，并于培养基质内接种所述丹参生长调节菌悬液，培养基质与菌悬液的接种质量百分比为10％，于3000lx的光照条件下照射14h/天，25℃室温环境下培养75d；

培养基质为腐殖土和沸石的混合物，所述腐殖土与所述沸石的质量比为70:30。

对比例1

将丹参茎尖脱毒苗于培养基质内，并于培养基质内加入水溶性蛋白质10份，MS液体培养基50份，于2500lx的光照条件下照射15h/天，27℃室温环境下培养70d；

培养基质为腐殖土和沸石的混合物，所述腐殖土与所述沸石的质量比为65:35。

对比例2

与对比例1的制备步骤相同，不同之处仅在于，还添加有丹参内生真菌菌剂8份。

对比例3

与对比例1的制备步骤相同，不同之处仅在于，还添加有

对比例4

与对比例1的制备步骤相同，不同之处仅在于，还添加有低聚壳寡糖15份。

对比例5

与对比例1的制备步骤相同，不同之处仅在于，还添加有有草酸0.1份。

本发明实施例1-实施例3均制备得到了富含丹参酮和丹参素的高品质丹参，且表型和品质相近，下面以实施例2为例，与对比例1-对比例5进行对比，对比例1为空白对照组，仅含有与实施例2等量的水溶性蛋白质和MS液体培养基，具体对比方法和结果如下所示：

随机选取对比例1-5及实施例2的样品，每组10株，测定培养7天后植株的生长状况，具体结果如表1所示：

表1对比例1-5及实施例2的样品生长状况比较表

对比例1分别与对比例2、对比例3对比例4及实施例2相比，干重增长分别为：21.95g、42.19g、33.07g及127.38g，对比例2、对比例3和对比例4的干重增长之和小于实施例2的干重增长；鲜重增长分别为：50.1g、72.71g、65.27g及239.32g，对比例2、对比例3和对比例4的鲜重增长之和小于实施例2的鲜重增长；株高增长分别为：3.51cm、7.97cm、5.42cm及20.69cm，对比例2、对比例3和对比例4的株高增长之和小于实施例2的株高增长；根长增长分别为：0.14cm、0.26cm、0.24cm及0.76cm，对比例2、对比例3和对比例4的根长增长之和小于实施例2的根长增长；丹参的长势得到了极大的提升，说明了丹参内生真菌菌剂、

丹参内的有效成分的测定方法：

分别对实施例2及对比例1-5的样品干燥、研磨后，将丹参根进行甲醇提取，具体方法为：将20mg丹参根粉末溶于2ml体积分数为70％甲醇溶液中，超声处理60分钟后，用高效液相色谱(HPLC)对丹参素和丹参酮进行分离并分析，并与空白对照组进行对比，分别研究丹参素的含量提升率和丹参酮的含量提升率，结果如表2所示：

表2丹参素的含量提升率和丹参酮的含量提升率结果表

结果表明，实施例2与对比例1相比，由于对比例1不含有放线菌菌剂、壳寡糖丹参内生真菌菌剂和草酸，因此丹参素和丹参酮的含量均与实施例2相差很大；实施例2与对比例2相比，由于对比例2中含有丹参内生真菌菌剂，因此促进丹参的生长，而对于丹参素和丹参酮含量的影响较小，与对比例1接近；实施例2与对比例3相比，由于对比例3中含有

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。