在受试者中进行神经退行性疾病的鉴别诊断的方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于在受试者中进行神经退行性疾病的鉴别诊断的方法。

背景技术

鉴别诊断的进行使临床医生可以对患者进行分类，然后该患者就有机会接受适当的治疗以治愈或至少改善他/她的医疗状况。

以神经元的结构或功能进行性丧失为特征的神经退行性疾病众多，如以下列出所示：阿尔茨海默氏病、精神抑郁症、肌萎缩性侧索硬化症、额颞痴呆、帕金森氏病、进行性核上性麻痹，伴随痴呆症的帕金森氏病等。

这些疾病之间的界限有时很难区分，因此负责患者随访的临床医生会犹豫不决，并对一名患者进行不适当的治疗。从其意味着昂贵且繁琐的实验(例如医学成像和/或腰椎穿刺术以收集脑脊髓液(CSF)样品)的意义上来说，所述诊断也很难建立。另一方面，医疗调查问卷不足以使临床医生确定所诊断的疾病。

已提出单胺能上升系统(monoaminergic ascending system)中发生的形态和功能变化与AD的生理病理之间的联系(Simic G.等人，Neuropathol.Appl.Neurobiol.,2009,35,532-554和Trillo L.等人，Neurosci Biobehav.Rev.,2013,37,1363-1379)。蓝斑(LC)中的去甲肾上腺素能神经元是大脑中许多区域的去甲肾上腺素能输入的主要来源。由于其广泛的传出神经分布，LC投射系统在压力和维持认知表现等过程中起着关键的调节作用。(Sara S.J.,Nat.Rev.Neurosci.,2009,10,211-223)。这导致对儿茶酚胺检测的需求，以开发用于神经退行性疾病诊断的新工具。

由于患者通常仅被诊断出患有单一类型的痴呆症，混合型痴呆症也不能很好地治疗。在这种情况下，医生将基于已诊断出的痴呆类型做出药物决定/处方，最终将无助于改善患者的生活状况。

发明内容

本发明的技术问题是减轻现有技术中存在的至少一个缺点。更具体地，本发明的技术问题是避免昂贵且繁琐的实验来诊断患有神经退行性疾病或患有混合型痴呆症的受试者。所述疾病可能是以下疾病之一：阿尔茨海默氏病、精神抑郁症、肌萎缩性侧索硬化症、额颞痴呆、帕金森氏病、进行性核上性麻痹，伴随痴呆症的帕金森氏病。

本发明涉及用于在受试者中进行神经退行性疾病的鉴别诊断的体外方法，所述受试者选自患有阿尔茨海默氏病、精神抑郁症、肌萎缩性侧索硬化症、额颞痴呆、帕金森氏病、进行性核上性麻痹和/或伴随痴呆症的帕金森氏病的患者。所述方法包括以下步骤：(a)确定所述受试者的至少五项标准，(b)通过计算与每种神经退行性疾病有关的整体注释(global note)，将所述受试者的所述至少五项标准与参照值进行比较，以及(c)确定所述受试者是否患有阿尔茨海默氏病、精神抑郁症、肌萎缩性侧索硬化症、额颞痴呆、帕金森氏病、进行性核上性麻痹、伴随痴呆症的帕金森氏病或混合型痴呆症。

根据优选实施方案，所述步骤(a)是确定至少八项标准的步骤。

根据优选实施方案，所述标准选自

a)所述受试者的年龄，

b)适于筛查认知功能的调查问卷(优选迷你心理状态测试调查问卷)中所述受试者的评分，

c)所述受试者的一份血液样品中的多巴胺浓度[D]，

d)所述受试者的一份血液样品中的肾上腺素浓度[A]，

e)所述受试者的一份血液样品中的去甲肾上腺素浓度[NA]，

f)所述受试者的一份血液样品中的多巴胺预期浓度[D]

g)所述受试者的一份血液样品中的肾上腺素预期浓度[A]

h)所述受试者的一份血液样品中的去甲肾上腺素预期浓度[NA]

根据优选的实施方案，所述受试者的所述血液样品是所述受试者的一份血浆样品。

根据优选的实施方案，用装有电化学检测器的HPLC测定所述多巴胺、肾上腺素和去甲肾上腺素的浓度。

根据优选的实施方案，所述多巴胺预期浓度是通过应用以下等式获得的

其中K

其中[D]

根据优选的实施方案，所述肾上腺素的预期浓度通过应用以下等式获得

其中K

其中[A]

根据优选的实施方案，所述去甲肾上腺素的预期浓度通过应用以下等式获得

其中K

其中[NA]

根据优选的实施方案，步骤(b)中使用的所述参照值如下：

a)所述受试者的年龄在29.9岁至100.3岁之间，

b)所述适于筛查认知功能的调查问卷的评分介于0到30之间，

c)所述多巴胺浓度介于0.0ng/ml和28.2ng/ml之间，

d)所述肾上腺素浓度介于0.0ng/ml和25.0ng/ml之间，

e)所述去甲肾上腺素浓度介于0.0ng/ml至114.0ng/ml之间，

f)所述多巴胺的预期浓度介于0.0ng/ml和10.0ng/ml之间，

g)所述肾上腺素的预期浓度介于0.0ng/ml至10.0ng/ml之间，

h)所述去甲肾上腺素的预期浓度介于0.0ng/ml至10.0ng/ml之间。

根据优选的实施方案，所述方法进一步包括将校正因子δ分配于所述参照值的步骤，所述校正因子δ介于0.50和1.50之间。

根据优选的实施方案，所述计算与每种神经退行性疾病有关的整体注释的步骤(b)包括以下子步骤：

a)确定针对每项标准的神经退行性疾病的虚拟值

b)将权重因子分配于上一个子步骤中确定的每个虚拟值

c)确定每个所述加权虚拟值的总和以获得与每种神经退行性疾病有关的一个整体注释。

根据优选的实施方案，如果所述受试者对于每项标准的一个测量值VAL

其中VAL

其中

其中

其中K是数学参数，K优选地介于0和0.1之间。

根据优选的实施方案，与关于所述受试者的年龄和所述受试者的评分的虚拟值相关的权重因子(w

根据优选的实施方案，所述确定所述受试者是否患有阿尔茨海默氏病、精神抑郁症、肌萎缩性侧索硬化症、额颞痴呆、帕金森氏病、进行性核上性麻痹，伴随痴呆症的帕金森氏病或混合型痴呆症的步骤通过比较与每种神经退行性疾病相关的整体注释来进行。

根据优选的实施方案，所述方法进一步包括，在所述步骤(c)和所述步骤(d)之间，确定所述受试者是否患有动脉高血压的步骤(c’)。

通常，本发明的每个目的的特定实施方案也适用于本发明的其他目的。在可能的范围内，本发明的每个目的可以与其他目的结合。

本发明特别令人感兴趣，因为当所述诊断是精确的时，对患者的鉴别诊断允许临床医生对患者进行充分的随访。一旦该患者被诊断出其患有的准确的疾病，她/他就可以得到最好的医疗护理，这将帮助她/他改善她/他的医疗状况。通过可以检测出混合型痴呆症的鉴别诊断，提供适当的“混合疗法”以对此类健康状况产生更多疗效也具有优势，特别是因为目前很难检测这种混合型痴呆症并且当检测到混合型痴呆症时很难知道哪种疾病被包含。

血液测试的使用使诊断的可重复性变得容易，其允许对患者进行随访、及早诊断(众所周知，及早诊断有利于治疗并大大改善患者和他/她的家人的生活状况)。

附图的简要说明

图1：针对训练受试者设计的算法方案，初步测试模型的性能有效性。

图2：训练模型步骤(用于建立参照表)中初始组中受试者的分布。

图3：从阿尔茨海默氏病(AD)的视角使用整体注释的点云。

图4：从对照组的视角使用整体注释的点云。

具体实施方案

本发明可以开发有效的鉴别诊断方法。

由于本发明的方法而被诊断出的疾病是以下神经退行性疾病：阿尔茨海默氏病(AD)、精神抑郁症(PSY)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、额颞痴呆(FTD)、帕金森氏病(PD)、进行性核上性麻痹(PSP)和伴随痴呆症的帕金森氏病(PD+)。所述诊断能够区分患者患有哪种神经退行性疾病。本发明的诊断方法显然还可以区分健康患者(CTRL或对照)。

在图1上，为简单起见，仅描述了AD和PSY。其余的研究疾病已纳入参照OD(其他疾病)中。这是因为在这些疾病中，训练模型步骤中的受试者人数少于15个受试者(另请参见图2)。

已经确定对于每种筛查出的神经退行性疾病的

对于阿尔茨海默氏病(AD)，最大灵敏度为76.7％且最大特异性为98.3％。

对于精神抑郁(PSY)，最大灵敏度为66.7％且最大特异性为92.9％。

对于肌萎缩性侧索硬化症(ALS)，最大灵敏度为16.7％且最大特异性为97.9％。

对于额颞痴呆(FTD)，最大灵敏度为33.3％且最大特异性为100％。

对于帕金森氏病(PD)，最大灵敏度为75.0％且最大特异性为99.0％。

对于进行性核上性麻痹(PSP)，最大灵敏度为40.0％且最大特异性为98.4％。

对于伴随痴呆症的帕金森氏病(PD+)，最大灵敏度为50％且最大特异性为100％。

最后，对于健康患者，最大灵敏度为100％且最大特异性为81.4％。

为了获得这些非常重要的统计结果，并由此提供可靠的鉴别诊断神经退行性疾病的方法，已经实现了两个不同的阶段。第一阶段对应于训练模型步骤，第二阶段对应于诊断支持步骤(见图1)。在第一阶段，测试了一组202名受试者。这202名受试者已经被用来确定本发明的诊断方法所基于的参照值。已知哪些受试者患有哪些疾病(见图2)，可以根据以下说明的标准确定参照值。在第二阶段，已在100名受试者的较小的组中测试了诊断方法，以确认模型的有效性。

在本方法中使用了以下标准：

通过明确询问患者或询问其一位熟人或在其身份证明文件中确认来收集要诊断的患者的年龄。

然后，要求所述患者对他们的认知能力进行医疗问卷调查。这些测试由一组20到30个问题组成，用于评估基本的认知功能。大多数评估要求个体给出基本的个人信息(即姓名，地址等)，根据常识回答简单的问题(即谁是美国总统？)，并记忆简单信息项目，例如三个单词或姓名和地址的列表，然后回忆。根据个体给出的响应，给出有助于临床医生对患者分类的评分。所述问卷可以是缩简的心理测试(AMT)、迷你精神状态检查(MMSE)和六项认知障碍测验(6CIT)之一。为了本鉴别诊断方法的目的，已选择MMSE，但是可以使用用于评估基本认知功能的任何其他合适的医学问卷。

其次，收集每个个体的血液样品并进行分析，以确定患者血浆中的三种儿茶酚胺(CA)水平。使用标准HPLC方法同时定量肾上腺素(adrenaline)，去甲肾上腺素(noradrenaline)和多巴胺。所述HPLC与电化学检测结合。与通常需要收集脑脊液的神经退行性疾病的标准诊断方法相比，这种筛查的优势在于，血液样品的收集易于在个体上进行，尤其是对老年人。确实应当了解的是腰椎穿刺比血液采集更具侵害性，并且腰椎穿刺并不总是适用于所有类型的患者。

个体血浆中的CA水平、MMSE结果以及个体年龄将被考虑并在以下数学模型中进行处理。

现在处理这前五项标准(年龄、医疗问卷评分、肾上腺素浓度([A])、去甲肾上腺素浓度([NA])和多巴胺浓度([D]))以确定所述受试者患有哪种神经退行性疾病。

基于儿茶酚胺浓度的参数可由此确定以改进诊断。确实要注意的是前五项标准足以提供正确的诊断。在需要改进的情况下，将对实验确定的儿茶酚胺浓度进行处理以确定那些儿茶酚胺的预期浓度。

儿茶酚胺中预期浓度的确定基于所测浓度与参照浓度之间的差异测量。选择患有阿尔茨海默氏病(AD)的患者血液样品中儿茶酚胺的浓度，尤其是血浆中的浓度作为参照浓度。已经在训练模型步骤中选择的202位受试者的初始小组中确定了这种浓度的平均值。

所述肾上腺素的预期浓度对应于以下数学函数：

其表示肾上腺素的预期浓度对应于K

其中

K

因此，所述去甲肾上腺素的预期浓度对应于以下数学函数：

其表示去甲肾上腺素的预期浓度对应于K

其中

K

因此，多巴胺的预期浓度对应于以下数学函数：

其表示多巴胺的预期浓度对应于K

其中

K

由一个受试者获得的那些值，无论是测量的(年龄、评分、[A]、[NA]和[D])还是确定的([A]

表I显示了确定的涉及五项标准(年龄、医疗调查问卷评分、[NA]、[A]和[D])与神经退行性疾病相关的最小参照值。还指出了在改进诊断方法的情况下使用的三个计算标准的最小值([NA]

表II显示了确定的涉及五项标准(年龄、医疗调查问卷评分、[NA]、[A]和[D])、与神经退行性疾病相关的最大参照值。还指出了在改进诊断方法的情况下使用的三个计算标准的最大值([NA]

因此，对于患有阿尔茨海默氏病(AD)的受试者，所述标准的参照值如下：

-年龄介于51.1岁至81.5岁之间；

-MMSE的评分介于4.0至28.0之间；

-[NA]介于0.06ng/l至11.4ng/l之间；

-[A]介于0.15ng/l至2.6ng/l之间；

-[D]介于0.12ng/l至3.5ng/l之间；

-[NA]

-[A]

-[D]

所述参照值实际上可以写为介于

对于患有精神抑郁(PSY)的受试者，所述标准的参照值如下：

-年龄介于36.8岁至63.3岁之间；

-MMSE的评分介于6.0至30.0之间；

-[NA]介于0.12ng/l至2.6ng/l之间；

-[A]介于0.35ng/l至2.7ng/l之间；

-[D]介于0.12ng/l至28.2ng/l之间；

-[NA]

-[A]

-[D]

所述参照值实际上可以写为介于

对于患有肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的受试者，所述标准的参照值如下：-年龄介于42.8岁至76.6岁之间；

-MMSE的评分介于26.0至30.0之间；

-[NA]介于0.32ng/l至1.6ng/l之间；

-[A]介于0.37ng/l至1.1ng/l之间；

-[D]介于0.32ng/l至1.2ng/l之间；

-[NA]

-[A]

-[D]

所述参照值实际上可以写为介于

对于患有额颞痴呆(FTD)的受试者，所述标准的参照值如下：

-年龄介于41.2岁至85.6岁之间；

-MMSE的评分介于15.0至30.0之间；

-[NA]介于0.22ng/l至1.9ng/l之间；

-[A]介于0.28ng/l至25.0ng/l之间；

-[D]介于0.24ng/l至12.3ng/l之间；

-[NA]

-[A]

-[D]

所述参照值实际上可以写为介于

对于患有帕金森氏病(PD)的受试者，所述标准的参照值如下：

-年龄介于29.9岁至78.5岁之间；

-MMSE的评分介于26.0至29.0之间；

-[NA]介于0.30ng/l至114.0ng/l之间；

-[A]介于0.07ng/l至0.8ng/l之间；

-[D]介于0.32ng/l至10.1ng/l之间；

-[NA]

-[A]

-[D]

所述参照值实际上可以写为介于

对于患有进行性核上性麻痹(PSP)的受试者，所述标准的参照值如下：

-年龄介于45.6岁至78.9岁之间；

-MMSE的评分介于25.0至27.0之间；

-[NA]介于0.30ng/l至8.4ng/l之间；

-[A]介于0.26ng/l至0.8ng/l之间；

-[D]介于0.35ng/l至0.8ng/l之间；

-[NA]

-[A]

-[D]

所述参照值实际上可以写为介于

对于患有伴随痴呆症的帕金森氏病(PD+)的受试者，所述标准的参照值如下：

-年龄介于56.1岁至73.0岁之间；

-MMSE的评分介于26.0至29.0之间；

-[NA]介于0.32ng/l至1.6ng/l之间；

-[A]介于0.17ng/l至0.6ng/l之间；

-[D]介于0.12ng/l至9.4ng/l之间；

-[NA]

-[A]

-[D]

所述参照值实际上可以写为介于

对于健康对照，所述标准的参照值如下：

-年龄介于40.0岁至100.3岁之间；

-MMSE的评分介于28.0至30.0之间；

-[NA]介于0.0ng/l至3.0ng/l之间；

-[A]介于0.0ng/l至0.8ng/l之间；

-[D]介于0.0ng/l至0.6ng/l之间；

-[NA]

-[A]

-[D]

所述参照值实际上可以写为介于

校正因子δ可分配于这些最低和最高参照值。所述校正因子δ可介于0.50至1.50之间。优选地，所述校正因子δ可介于0.75至1.25之间。如果校正因子δ等于1，则实际上在本发明的诊断方法中使用的参照值是表I和表II中所示的参照值。

校正因子δ用于考虑儿茶酚胺浓度的测量过程中可能发生的任何可能的偏差，或在确定MMSE评分时因疏忽而造成的可能的误差。实际上，对于不等于1的校正因子δ，表I和表II的值略有不同。在一个受试者上通过不同参照表(通过不同校正因子δ获得)对本发明的方法进行迭代可以提供更好的结果稳健性(robustness)。例如，如果患者通过3个不同的参照表被诊断为进行性核上性麻痹，那么与仅参照1个参照表就诊断出该患者患有该具体疾病相比，诊断的确定性就会提高。

参照值或校正后的参照值用于比较至少五项标准(甚至八项标准)。实际上，比较步骤是表达每种神经退行性疾病的整体注释(或整体评分)的决定因素。为了获得将用于诊断受试者的整体注释，首先为每项标准确定一个虚拟值。

如果所述受试者对一项标准的值超出参照值的范围(下限在表I中，或在校正后的表I中表示(如果应用了校正因子δ)；上限在表II中，或在校正后的表II中表示(如果应用了校正因子δ))，则将虚拟值设置为零。换句话说，所选标准不计算在内。

如果所述受试者对一项标准的值在参照值范围内(如上所述，根据(校正的)表I或(校正的)表II的参照值)，则适用以下数学等式：

其中VAL

K是数学参数，介于0到0.1之间。优选地，K介于0至0.05之间。

为了确定与每种神经退行性疾病有关的整体注释，与所有五项标准(年龄、评分、[A]、[NA]、[D])和/或三个补充标准有关的虚拟值(([A]

然后，将权重因子分配于每个虚拟值。与年龄和评分有关的虚拟值比与浓度或预期浓度有关的虚拟值的相关性更小。科学地确定血液中儿茶酚胺的浓度比向他人提出问题实际上更为客观。年龄也是一个比较主观的参数，因为它与疾病的相关性相当多变并取决于个体而不是确定的规律。由于这些原因，关于年龄和医疗调查问卷评分的虚拟值的权重因子已设置为例如0.5，而关于浓度或预期浓度的虚拟值的权重因子已设置为例如2。

与每种神经退行性疾病有关的整体注释仅通过将所有加权虚拟值相加而获得。因此，数学写法如下：

其中w

其中w

表III中示出了与针对10名受试者的样品获得的每种神经退行性疾病有关的整体注释。为了进行诊断，临床医生会比较获得的八种神经退行性疾病中每种疾病的整体注释，并得出结论，如果某具体疾病的整体注释在八种整体注释中最高，则该患者患有该具体疾病。表III的最后两列显示了诊断结论，第一个诊断是针对患者的最有可能的诊断。当整体注释之间的间隔太弱时，通常是当该间隔小于2.00(优选小于1.00，更优选小于0.50)时，则进行第二次诊断。可以进行两次诊断，甚至可以进行第三次诊断的患者(表III中未显示)通常患有混合型痴呆症。还确定了患有精神抑郁症(PSY)的患者也显示出阿尔茨海默氏病(AD)的体征，精神抑郁症是阿尔茨海默氏病(AD)的先兆。

实际上，对于每个患者，测量每个类别中患者的评分与患者云之间的距离。例如，当在公式(2)中考虑AD的参照值时(即

这就是为什么必须通过考虑所有正在研究的神经退行性疾病来计算整体注释的原因。例如，当将公式(2)中的参照值用于对照组时，对于同一组患者绘制如图4所示的表示形式。

通过将此算法应用于每位患者，最终建议的诊断是根据测量的距离得出的与患者最接近的点云(在8种可能的原始云中)的诊断。如果次优诊断(如表III所示)(可能还有第三优诊断)的评分足够接近，则也可以向临床医生指示该次优(也可能是第三优)。

因此，有可能将个体从神经退行性疾病或混合性痴呆症中诊断出。对于每种神经退行性疾病和每位患者的整体注释的归属使临床医生不仅可以将患者分类为疾病中一类(例如，通过评估，所述患者患有AD)，还可以洞察同一患者可能患有的其他疾病(基于次优和可能的第三优诊断)。

使用的另外的标准是确定所讨论的受试者是否患有动脉高血压。确实已经注意到的是患有AD的患者中动脉高血压的患病率低四倍。这可能与大脑中聚集体的形成以及这些聚集体的清除率低有关(由于这些患者的血压(极)低)。因此，确定所述受试者中的血压可以是进一步的参数，以确定所述受试者是否患有AD。

同时准确地检测和鉴定血液中的儿茶酚胺为研究AD和儿茶酚胺之间的潜在联系奠定了坚实的基础。在这项探索性研究中，通过一群患有痴呆症和其他神经退行性疾病的患者(n＝202)，我们证明了血浆儿茶酚胺测定对于开发侵害性更小且可及的解决方案以诊断AD和其他神经退行性疾病(例如PSY、ALS、FTD、PD、PSP和PD+，以及混合型痴呆症)的益处。对儿茶酚胺信号的统计利用，再加上简单的数据(例如年龄、迷你精神状态检查(MMSE)和血压测定)可以实现具有高灵敏度和特异性(即分别为76.8％和98.2％)的AD诊断。

本发明的诊断方法不仅对诊断受试者非常有用，而且还是提供这些受试者的随访的工具。特别要强调的是，由于是基于简单的血液检查，因此样品的制备是很容易进行的。从医学研究的角度来看，这种诊断方法也是非常实用的，因为由于使用了简单的检测方法，可以轻松地评估新疗法和新药。

分析方法

将在肝素锂试管中收集的血液在+4℃以3500rpm离心10分钟。将1mL血浆和100μL的2,3-二羟基苯甲酸(DHBA)内标物(来自100nM DHBA储备液)添加到含有100mg氧化铝的萃取管中，其中100mg氧化铝根据已知方法(Anton A.H.等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1962,138(3),360-375)，预先用500μL TRIS 3M和100μL EDTA 10％(5：1)的混合物活化。将样品搅拌10分钟，并在4℃以2000rpm离心。然后将具有结合的儿茶酚胺的氧化铝用5mL蒸馏水洗涤3次，然后离心。儿茶酚胺的洗脱是通过添加500μL HClO

样品制备说明

在HPLC分析之前，通过吸附在氧化铝上从血浆基质中提取儿茶酚胺(肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺)。样品制备很简单，因为无需调节血浆样品的pH。此外，样品制备仅需要使用洗涤缓冲液进行洗涤步骤。选定的HPLC色谱柱与流动相结合，针对此特定分离进行了优化，可确保进行准确可靠的色谱定量。使用经过认证的HPLC试剂盒，每人每天可以分析多达100个血浆样品。