一种烟酰胺核糖激酶突变体

技术领域

本发明涉及酶催化技术领域，具体领域为一种烟酰胺核糖激酶突变体。

背景技术

β-烟酰胺单核苷酸(NMN)是一种重要的天然化合物，在生物体中广泛存在。NMN作为NAD和NADP的直接前体引起了广泛关注，NMN可以为现代疗法开辟新的视野。该生物分子已经证明在几个临床前疾病模型中具有许多有益的药理活性，包括心脑缺血、神经退行性疾病，如阿尔茨海默病和糖尿病。在鼠模型中，其抗衰老、延长寿命特性的最新发现使NMN作为潜在的治疗候选物更具吸引力。它的大部分药理作用是通过促进NAD的合成而发生的，因为以较高剂量直接施用NAD有时会出现诸如失眠、疲劳和焦虑之类的副作用，并且与NMN相比，它穿透质膜的能力较差。

目前，NMN的主要生产工艺有如下几种：(1)化学合成法。因涉及引起基因畸变的原料，市场接受度较低；(2)ATP提供磷酸供体的方式，因ATP只能使用一个循环，原料单耗过高，随着产品价格的大幅下降目前已不具有实用意义；(3)乙酰磷酸循环ATP的方式，通过ATP提供磷酸基团；(4)多聚磷酸循环ATP的方式；(5)发酵法，发酵浓度低，杂质多，分离成本过高，产品品质较差造成市场上接受度较低。

乙酰磷酸做为第一代的磷酸供体用于ATP循环反应，已有40余年的历史。如日本大赛璐化学在1985发表的专利US4753757 Process for preparing solid acetylphosphate salt公布了乙酰磷酸锂盐制备方法。Crans等在1983年公布了一种乙酰磷酸的合成方法(A convenient synthesis of disodium acetyl phosphate for use in in-situ ATP cofactor regeneration)。但由于其环境不友好，目前基本不会再被工业上大规模采用。由于乙酰磷酸不会对生物酶有大的抑制，故采用高浓度的乙酰磷酸做为磷酸供体不会对体系有副面影响，因此使得产物浓度可以做到相对很高；且由于其磷酸键相对高能使得反应向下游进行更加彻底，很少出现底物残留。这是乙酰磷酸最大的两个优势，但由于乙酰磷酸的制备过程涉及易制毒原料乙酸酐，乙酰基做为副产物被浪费掉使得利用率低且成品极不稳定很难持续批量生产做为稳定原料，而其生产成本进一步决定了只能用于高附加值产品的磷酸化反应。而NMN的公斤级价格突破500元已成必然，故所有使用昂贵底物的生产工艺如乙酰磷酸等不再能满足工业化需求。

CN110373398在2019年首次公布了Kluyveromyces marxianus来源的烟酰胺核糖激酶在NMN制备中的应用，其配合大肠杆菌来源的PPK2，以多聚磷酸为磷酸供体，最终实现5％底物浓度，转化率80％，是目前较优秀的生产方案。但仍然存在底物浓度低转化率不高等缺点。

Qian等2022年同样使用了从Kluyveromyces marxianus来源的烟酰胺核糖激酶，配合嗜热硬脂芽孢杆菌的乙酰激酶，使用乙酰磷酸循环ATP的方式来制备NMN，100g/L的NR在8h内可完全磷酸化为NMN，摩尔收率达到84.2％。同样由于乙酰磷酸的参与使得此工艺竞争力不强(Qian,XL.,Dai,YS.,Li,CX.et al.Enzymatic synthesis of high-titernicotinamide mononucleotide with a new nicotinamide riboside kinase and anefficient ATP regeneration system.Bioresour.Bioprocess.9,26.2022)。

因此，寻找一种热稳定更好的烟酰胺核糖激酶突变体成为了本领域亟需解决的问题之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种烟酰胺核糖激酶突变体。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种烟酰胺核糖激酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明所述的烟酰胺核糖激酶突变体，比野生烟酰胺核糖激酶具有更高的催化活力及热稳定性，所述野生型烟酰胺核糖激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供了一种多核苷酸，可编码上述的烟酰胺核糖激酶突变体。

进一步的，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明的烟酰胺核糖激酶突变体与野生型烟酰胺核糖激酶相比，表现出更高的催化活力及热稳定性，本发明的烟酰胺核糖激酶突变体在45℃-50℃的活性更持久。

(2)本发明的烟酰胺核糖激酶突变体具有诸多优点：①加快动力学反应，能有效缩短反应周期；②简化了酶提取流程，宿主细胞蛋白在高温下变性凝结沉淀，易与目的蛋白分离；③对反应的冷却系统要求不高，因而降低了能耗并降低了成本；④稳定性提高后的蛋白可在室温下运输保存，并且有效延长保质期；⑤在高温催化反应的条件下，避免了杂菌的生长机会，从而减少了细菌的代谢产物对产品的污染；⑥高温有助于增加底物的溶解度，提高了单位体积的生产效率。

(3)本发明的烟酰胺核糖激酶可用于高温催化烟酰胺核糖生成烟酰胺单核苷酸，反应温度更高，可有效缩短反应时间，并有效灭活杂酶，减少产物的降解。

(4)本发明的烟酰胺核糖激酶用于生产烟酰胺单核苷酸的路线更加经济，具有更低的生产成本，更具规模放大前景且易于提取。

六偏磷酸钠、多聚磷酸、三聚磷酸、四聚磷酸均在工业生产上易于得到，特别是六偏磷酸钠，被广泛应用于食品添加，市售食品级公斤级价格在10元以内，且市场有多家厂商可以稳定供应。但是采用六偏磷酸钠工艺的难点主要有：①六偏磷酸钠对蛋白的抑制作用非常强，浓度一旦超过25g/L极易引起蛋白变性而失去酶活；②六偏磷酸钠易与镁离子发生络合降低体系中的浓度，但目前所有已知烟酰胺核糖激酶都需要足量的镁离子作为辅因子；③六偏磷酸钠的作用需要多磷酸激酶的辅助，才可以起作用。

而本发明找到了耐热型多聚磷酸激酶LE496进行辅助，而且AMP的成本只有ATP成本的1/5，更进一步降低了NMN的原料成本。

附图说明

图1为实施例5突变体反应6小时HPLC结果，6.2分钟为NMN峰。

图2为实施例5野生型反应6小时HPLC结果，6.1分钟为NMN，7.3分钟为底物峰。

图3为实施例6反应7小时HPLC结果。

图4为实施例7反应6小时HPLC结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例及附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本实施例中所用到的仪器、试剂，除非有特殊说明，均为市售产品。

实施例1野生型烟酰胺核糖激酶基因序列的获得

通过全基因合成的方法，对Zygosaccharomyces sp..来源的烟酰胺核糖激酶基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，以实现在大肠杆菌中的高表达。利用PrimerPremier(http://primer3.ut.ee/)和OPTIMIZER(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)进行设计，并保证退火温度(Tm)差异控制在3℃以内，引物长度控制在60base以内，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μM。

将配制好的PCR反应体系置于博日XP cycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃30s，55℃45s，72℃120s，35x。

将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeI/XhoI位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的DNA序列为SEQ ID NO：2，命名为ZYKwt，其对应的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

实施例2烟酰胺核糖激酶突变体基因序列的获得

烟酰胺核糖激酶突变体，其源于实施例1的野生型烟酰胺核糖激酶，能够高温催化烟酰胺核糖生成烟酰胺单核苷酸，能够应用于高温转化烟酰胺核糖生成烟酰胺单核苷酸。所述烟酰胺核糖激酶突变体，与野生型烟酰胺核糖激酶相比表现出更强的热稳定性。烟酰胺核糖激酶突变体和编码这种突变体的多核苷酸可以使用本领域技术人员通常使用的方法制备。突变体可以通过使编码该酶的体外重组、多核苷酸诱变、DNA改组、易错PCR和定向进化方法等获得。

通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，以实现在大肠杆菌中的高表达。利用Primer Premier(http://primer3.ut.ee/)和OPTIMIZER(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)进行设计，并保证退火温度(Tm)差异控制在3℃以内，引物长度控制在60base以内，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μM。

将配制好的PCR反应体系置于博日XP cycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃30s，55℃45s，72℃120s，35x。

将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeI/XhoI位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的DNA序列为SEQ ID NO：4，命名为ZYK，其对应的氨基酸序列为SEQ ID NO：3。

实施例3摇瓶表达测试

挑取含有表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10mL高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，添加卡那霉素至50mg/L。30℃，250rpm过夜培养。次日取1L三角瓶，按1：100的接种比例接入到100mL高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L，添加卡那霉素至50mg/L。于30℃中培养至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时。加IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养16小时。培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体。然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存。同时取少量菌体进行SDS-PAGE检测。

实施例4分批补料发酵

分批补料发酵在计算机控制的生物反应器(上海国强)中进行，反应器容量为15L，工作体积为8L，所用到的培养基为酵母抽提物24g/L，蛋白胨12g/L，葡萄糖0.4％，2.31g/L磷酸二氢酶和12.54g/L磷酸氢二钾，pH 7.0。初级接种菌种制备200mL培养物，OD2.0时接入。在整个发酵过程中，温度保持在37℃，发酵过程中溶解氧浓度由搅拌速率(rpm)和通气供应级联控制在30％自动控制，而培养基的pH值由50％(v/v)正磷酸和30％(v/v)氨水维持在7.0。发酵过程中，当出现大幅的溶氧回升时，开始补料。补料溶液含有9％w/v蛋白胨、9％w/v酵母提取物、14％w/v甘油。当OD600约为50.0(湿重约为100g/L)时，控制温度为28℃，并用0.15mM IPTG诱导表达。

实施例5反应速率的比较

10mL体系配比：60mM MgCl

实施例6

10mL体系配比：60mM MgCl

实施例7

10mL体系配比：60mM MgCl

实施例8

10mL体系配比：120mM MgCl

实施例9

10mL体系配比：120mM MgCl

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。