白菜耐抽薹开花相关基因BrAHL24、BrGLK2及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及白菜耐抽薹开花相关基因BrAHL24、BrGLK2及其应用。

背景技术

白菜(Brassica campestris syn.B.rapa)属于十字花科芸薹属作物，主要包含(结球)大白菜和(不结球)白菜两大类群，前者包括散叶大白菜、半结球大白菜、花心大白菜和结球大白菜等类型，后者又包括(普通)白菜、菜心、紫菜薹、薹菜、塌菜、分蘖菜等。它们不仅是重要的蔬菜和油料作物，在生产上有较高的经济价值，而且与十字花科模式植物拟南芥有较近的亲缘关系，在植物基础科学中也有重要研究意义。其中，不结球白菜在我国全年均可生产，深受种植户和消费者青睐。由于生长周期短、复种指数高，且产量高、品质好、口感佳，因此在我国，尤其是南方地区占据很高的生产及消费比重，绝大部分不结球白菜以营养生长时期的叶片、嫩茎为食用器官，少数以菜薹为食用器官(菜心、紫菜薹类)。

抽薹开花是一年生或二年生草本植物进入生殖生长的重要标志，受诸多内源因子和外源环境因素的影响。以拟南芥为例，开花过程受到光周期、激素、春化、自主和年龄途径等影响，根据外在温度、光质、土壤盐分、自身糖分积累以及植物的年龄等一系列次要因素进行调控，模式植物拟南芥与其他十字花科植物具有密切关系。白菜的萌动种子经一段持续时间的低温处理(春化过程)，即可抽薹开花。而在生产中，由于品种选用不当、栽培时期或者栽培环境不适宜，会促进储存在植物营养器官中的物质向生殖器官转移，使之提早抽薹开花，导致产品产量和品质的降低。也正因如此，越冬、早春及高山高原栽培品种极易发生未熟抽薹。对于食用叶片和嫩茎为主的白菜变种来说，筛选低温春化耐受和发育转变较晚的晚抽薹品种是育种关键。

现有技术中，有较多研究针对植物的抽薹、开花机制进行探寻。以专利申请为例，公开号为CN111996200A的中国专利文献公开了拟南芥TGA7基因在调控植物开花期中的应用，拟南芥TGA7基因点突的植株与野生型植株相比延迟开花；公开号为CN106701782A的中国专利文献公开了拟南芥基因SPOC1在调控植株开花期中的应用，该发明研究发现，拟南芥中敲除SPOC1基因的植株与野生型植株相比延迟开花。但是上述研究只适用于调控拟南芥的花期，无从得知其是否可以应用于其他植物。

有研究表明，植物AHL家族成员的过表达会导致下胚轴变短等性状变化，例如拟南芥AHL22可以结合FT基因启动子的AT-rich DNA序列，或招集组蛋白去乙酰化酶HDA1和HDA6，从而改变FT gDNA的组蛋白甲基化水平和乙酰化水平；Golden2-like(GLK)属于GARP转录因子家族，有两个功能冗余的同源基因：GLK1和GLK2。由于这两个基因功能冗余严重，只能在glk1glk2双突变体中观察到明显的表型。拟南芥GLK基因在拟南芥中的过表达也会引起各种变化，如叶片向上发育以及花青素积累导致的应激反应等。目前，关于AHL家族基因和GLK2基因的研究大多集中在针对模式植物(如拟南芥、水稻和番茄)的研究中。而以白菜为材料，针对这两个基因是否参与抽薹开花过程还尚未有研究。

发明内容

本发明提供了白菜耐抽薹开花相关基因在推迟十字花科植物抽薹和开花过程中的应用，所述白菜耐抽薹开花相关基因为白菜BrAHL24a基因、白菜BrAHL24b基因、白菜BrGLK2a基因或白菜BrGLK2b基因，在受体十字花科植物中过表达白菜BrAHL24a基因、白菜BrAHL24b基因、白菜BrGLK2a基因或白菜BrGLK2b基因，能够推迟受体植物的抽薹和开花时间，为选育植物新品种提供了宝贵资源。

具体采用的技术方案如下：

本发明首先提供了白菜耐抽薹开花相关基因在推迟十字花科植物抽薹和开花过程中的应用，所述白菜耐抽薹开花相关基因为白菜BrAHL24a基因、白菜BrAHL24b基因、白菜BrGLK2a基因或白菜BrGLK2b基因，其中，白菜BrAHL24a基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，白菜BrAHL24b基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，白菜BrGLK2a基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，白菜BrGLK2b基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

通过农杆菌介导法将所述白菜耐抽薹开花相关基因导入十字花科植物中，获得相应基因过表达的转基因株系，结果发现，白菜BrAHL24a基因、白菜BrAHL24b基因、白菜BrGLK2a基因或白菜BrGLK2b基因的表达变化可以明显改变植株的抽薹开花时间，具体为延迟植株抽薹开花，其中，十字花科植物可以是拟南芥、白菜或芸薹种其他变种，也即，将该基因应用于十字花科蔬菜育种，具有良好的应用前景。

白菜BrAHL24a基因、白菜BrAHL24b基因、白菜BrGLK2a基因、白菜BrGLK2b基因中的至少一种过表达可以推迟十字花科植物抽薹和开花过程。

进一步优选的，所述的十字花科植物为白菜，经实验证明，白菜BrAHL24a基因、白菜BrAHL24b基因、白菜BrGLK2a基因、白菜BrGLK2b基因中的至少一种过表达能够明显推迟白菜的抽薹和开花过程，有助于为白菜新材料创制和新品种选育奠定基础。

将白菜BrAHL24a基因、白菜BrAHL24b基因、白菜BrGLK2a基因或白菜BrGLK2b基因连入植物过表达载体中，构建得到重组过表达载体，然后将重组过表达载体转化到受体植物中，其中，植物过表达载体为pAC004，将重组过表达载体转化农杆菌，然后用获得的重组农杆菌侵染受体植物。

本发明还提供了所述白菜耐抽薹开花相关基因在植物育种中的应用，筛选白菜BrAHL24a基因、白菜BrAHL24b基因、白菜BrGLK2a基因或白菜BrGLK2b基因过表达的植物，育种目的为推迟抽薹和开花时间。

本发明还提供了一种推迟十字花科植物抽薹和开花的方法，包括以下步骤：

(1)将白菜BrAHL24a基因、白菜BrAHL24b基因、白菜BrGLK2a基因或白菜BrGLK2b基因连入植物过表达载体中，构建得到重组过表达载体；

(2)将步骤(1)构建的重组过表达载体转化到作为受体植物的十字花科植物中。

其中，植物过表达载体可以选择pAC004。

步骤(2)中将重组过表达载体转化农杆菌，然后用获得的重组农杆菌侵染受体植物细胞

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明通过克隆白菜BrAHL24基因或白菜BrGLK2基因，并利用转基因的方式鉴定了该基因的功能，发现了其在控制十字花科植物抽薹开花时间上的作用，过量表达外源白菜BrAHL24a基因、白菜BrAHL24b基因、白菜BrGLK2a基因、白菜BrGLK2b基因中的至少一种，能够显著推迟白菜等十字花科植物抽薹开花，借助基因工程技术使所述白菜耐抽薹开花相关基因在受体植物中过表达，推迟开花进程，保证了十字花科蔬菜的品质，在基因工程育种中具有良好的应用前景。

(2)本发明为后续阐明白菜成花转变的遗传基础及分子机制奠定了研究基础，具有一定的理论意义，且经实验证明，本发明方法可以推迟白菜的抽薹和开花过程，在推迟十字花科植物抽薹和开花过程中也具有一定的应用潜力。

附图说明

图1中的A和B分别为白菜BrAHL24和BrGLK2在基因组中两个拷贝(白菜BrAHL24a基因、白菜BrAHL24b基因、白菜BrGLK2a基因和白菜BrGLK2b基因)的PCR电泳图，其中M泳道为DNA marker。

图2的A为白菜BrAHL24a基因和白菜BrAHL24b基因表达特征分析结果，B为白菜BrGLK2a基因和白菜BrGLK2b基因表达特征分析结果。

图3为重组过表达载体pAC004-BrAHL24a、pAC004-BrAHL24b、pAC004-BrGLK2a和pAC004-BrGLK2b示意图。

图4中的A为BrAHL24a、BrAHL24b转基因白菜植株的PCR检测结果；B为BrAHL24a转基因白菜植株的BrAHL24a相对表达量分析结果；C为BrAHL24b转基因白菜植株的BrAHL24b相对表达量分析结果；D为BrGLK2a、BrGLK2b转基因白菜植株的PCR检测结果；E为BrGLK2a转基因白菜植株的BrGLK2a相对表达量分析结果；F为BrGLK2b转基因白菜植株的BrGLK2b相对表达量分析结果；1、2、3、4代表筛选出的阳性株系编号，CK为对照。

图5为转基因株系(35S：：BrAHL24a、35S：：BrAHL24b、35S：：BrGLK2a和35S：：BrGLK2b)与对照植株的抽薹开花情况观察与时间统计，其中，A为表型图，B为统计图，a、b表示在5％水平上具备显著性差异。

具体实施方式

下面结合实施例与附图，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。

实施例1白菜BrAHL24a过表达载体及白菜BrAHL24b过表达载体的构建

(1)取白菜(‘byq97-02’白菜或市场上可以购买到的品种)的叶片组织样品用TRIzol试剂提取总RNA，cDNA的合成用TAKARA反转录试剂盒完成，具体方法如下：5×gDNAEraser Buffer 2μL，gDNA Eraser 1μL，RNA 1μg，RNase Free H

(2)以白菜叶片cDNA为模板，用表1中的引物通过高保真酶进行PCR扩增获得BrAHL24基因两个拷贝的目的片段(图1中的A)，分别命名为BrAHL24a和BrAHL24b。并对BrAHL24两个拷贝在不同组织中的表达特征进行了分析，结果表明，BrAHL24a在根中的表达丰度最高，茎和下胚轴中次之；BrAHL24b在根中表达丰度最高，而在花序和下胚轴中次之(图2中的A)。

(3)将图1中的A对应的目的片段回收后连接pMD18T并测序分析，白菜BrAHL24a基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述白菜BrAHL24b基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，确认获得目的序列后；分别以其为模板再次扩增回收后，用相应的限制性内切酶酶切。酶切体系如下：Buffer 4μL，回收PCR产物约2μg，KpnI和SaII酶各2μL，双蒸水补足至40μL。37℃水浴1h后回收酶切产物。pAC004载体也用同样方法酶切并回收后，与基因的酶切产物反应连接，反应体系如下：10×Buffer1μL，T4连接酶1μL，加入酶切后回收的基因片段与酶切后pAC004载体片段的摩尔比约为3:1，总量约为0.5μg。双蒸水补足至10μL，4℃连接过夜后转化大肠杆菌。取阳性菌落PCR检测并测序证明连接正确后，菌液扩繁并抽提质粒(图3)，获得重组过表达载体pAC004-BrAHL24a和pAC004-BrAHL24b，-20℃保存备用。

表1白菜BrAHL24基因CDS序列的PCR扩增所用引物

实施例2通过真空浸花法进行白菜遗传转化

(1)重组过表达载体转化农杆菌

将实施例1中得到的载体pAC004-BrAHL24a、pAC004-BrAHL24b及pAC004空载体转入农杆菌GV3101中，具体方法如下：取解冻的农杆菌感受态细胞与5μL实施例1中获得的质粒混匀后，冰浴10min，在液氮中反应5min，28℃水浴5min；在超净工作台上加入1mL不含任何抗生素的液体LB培养基，28℃摇床200rpm培养4～5h；离心10000rpm，1min，弃大部分上清液，剩余约100μL将菌体重悬后涂于含Rif(利福平，50mg·L

(2)浸花法转化白菜

侵染前两天，从超低温冰箱中分别取出含有pAC004-BrAHL24a质粒、pAC004-BrAHL24b质粒、pAC004空载体质粒的农杆菌GV3101菌种，在超净工作台上用接种环将菌种接种于含有终浓度的利福平(Rif,50mg·L

侵染当天，去除抽薹开花后的白菜的开放花，并对未开放花进行剥蕾；将菌液室温离心(4000rpm，10min)，加入50mL的1mM MgCl

侵染时，将白菜花序浸入装有上述菌液的离心管中，于真空泵中抽真空10分钟，中途放气一次。移出花序后，擦干菌液，横放于铺有湿纸巾的穴盘中，避光放置24h，授粉后正置放回人工气候室，正置培养约30天后停止浇水并套袋收种，将种子按照植株收集后编号。

(3)转基因阳性白菜植株的筛选检测

取样：将本实施例中步骤(2)处理后的白菜种子播种于基质中，待长出一片真叶后，取半片子叶进行DNA提取。

DNA提取：采用DNA简易提取法提取DNA，首先，配制DNA提取缓冲液，取20％质量分数的SDS溶液0.5mL，0.5mol·L

转基因阳性植株检测：利用针对过表达载体的特异性引物(表2)进行PCR检测，PCR体系如下：T5 Mix 12.5μL，正反向引物(见表2)各0.5μL，DNA模板2μL，双蒸水补足至25μL，98℃3min，35个循环(98℃10s，55℃10s，72℃15s)，72℃3min，4℃保温。PCR产物通过1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增片段的长度，只有阳性植株用于进行后续实验。

表2转基因白菜PCR检测所用引物

实时荧光定量PCR分析转基因白菜植株中BrAHL24a、BrAHL24b基因的相对表达量：取移栽后通过PCR检测的阳性株系叶片于1.5mL EP管中，做好标记后，迅速置入液氮中固定，全部取材完成后，提取总RNA并合成cDNA后，进行qRT-PCR分析。qRT-PCR分析所用引物通过Primer Premier 5设计，如表3所示。反应体系为15μL：7.5μL of SYBR Green MasterMix，正向和反向引物各0.3μL，模板1μL，5.9μL双蒸水。qRT-PCR反应流程：95℃：30s,40个循环(95℃：5s，55℃：45s)。通过熔融曲线确定反应的特异性，内参基因为BrUBC10，基因的相对表达量通过2

表3转基因白菜植株qRT-PCR分析所用引物

结果如图4中的A、B和C所示，表明转基因株系(35S：：BrAHL24a，35S：：BrAHL24b)中BrAHL24基因均发生了过表达。

实施例3转基因株系(35S：：BrAHL24a，35S：：BrAHL24b)的抽薹开花时间统计

将实施例2中已获得的白菜BrAHL24a基因或白菜BrAHL24b基因过表达转基因植株种子于28℃催芽过夜后，点播于72孔穴盘中，15d时移至15孔穴盘中。以现蕾后薹高1cm时的生长天数作为抽薹开花时间，对转基因植株进行抽薹开花时间统计，采用转入pAC004载体的转基因白菜植株作为对照植株(CK)。结果如图5中的A和B所示，BrAHL24a和BrAHL24b过表达转基因植株抽薹开花时间均明显延后。

实施例4白菜BrGLK2a过表达载体及白菜BrGLK2b过表达载体的构建

(1)采用实施例1中的方法提取白菜叶片组织中的cDNA。

(2)以白菜叶片cDNA为模板，用表4中的引物通过高保真酶进行PCR扩增获得BrGLK2基因两个拷贝的目的片段(图1中的B)，分别命名为BrGLK2a和BrGLK2b。并对BrGLK2两个拷贝在不同组织器官中的表达特征进行了分析，结果表明，BrGLK2a在叶中的表达丰度最高，茎和茎尖分生组织次之；BrGLK2b在茎尖分生组织中表达丰度最高，而在茎和叶中次之(图2中的B)。

(3)将图1中的B对应的目的片段回收后连接pMD18T并测序分析，白菜BrGLK2a基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述白菜BrGLK2b基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，确认获得目的序列后；分别以其为模板再次扩增回收后，用相应的限制性内切酶酶切。酶切体系如下：Buffer 4μL，回收PCR产物约2μg，KpnI和SaII酶各2μL，双蒸水补足至40μL。37℃水浴1h后回收酶切产物。pAC004载体也用同样方法酶切并回收后，与基因的酶切产物反应连接，反应体系如下：10×Buffer 1μL，T4连接酶1μL，加入酶切后回收的基因片段与酶切后pAC004载体片段的摩尔比约为3:1，总量约为0.5μg。双蒸水补足至10μL，4℃连接过夜后转化大肠杆菌。取阳性菌落PCR检测并测序证明连接正确后，菌液扩繁并抽提质粒(图3)，获得重组过表达载体pAC004-BrGLK2a和pAC004-BrGLK2b，-20℃保存备用。

表4白菜BrGLK2基因CDS序列的PCR扩增所用引物

实施例5采用真空浸花法进行白菜遗传转化

(1)重组过表达载体转化农杆菌

按照实施例2中的方法将实施例4中得到的载体pAC004-BrGLK2a、pAC004-BrGLK2b及pAC004空载体转入农杆菌GV3101中，得到含有pAC004-BrGLK2a质粒、pAC004-BrGLK2b质粒或pAC004空载体质粒的农杆菌GV3101菌种并于-75℃保存备用。

(2)浸花法转化白菜

利用含有pAC004-BrGLK2a质粒、pAC004-BrGLK2b质粒或pAC004空载体质粒的农杆菌GV3101菌种按照实施例2中的浸花法转化白菜，将种子按照植株收集后编号。

(3)转基因阳性白菜植株的筛选检测

取样：将本实施例中步骤(2)处理后的白菜种子播种于基质中，待长出一片真叶后，取半片子叶进行DNA提取。

DNA提取：同样按照实施例2中的方法提取DNA。

转基因阳性植株检测：利用针对过表达载体的特异性引物(表5)进行PCR检测，PCR体系如下：T5 Mix 12.5μL，正反向引物(见表5)各0.5μL，DNA模板2μL，双蒸水补足至25μL，98℃3min，35个循环(98℃10s，55℃10s，72℃15s)，72℃3min，4℃保温。PCR产物通过1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增片段的长度，只有阳性植株用于进行后续实验。

表5转基因白菜PCR检测所用引物

实时荧光定量PCR分析转基因白菜植株中BrGLK2a、BrGLK2b基因的相对表达量：取移栽后通过PCR检测的阳性株系叶片于1.5mL EP管中，做好标记后，迅速置入液氮中固定，全部取材完成后，提取总RNA并合成cDNA后，进行qRT-PCR分析。qRT-PCR分析所用引物通过Primer Premier 5设计，如表6所示。反应体系为15μL：7.5μL of SYBR Green Master Mix，正向和反向引物各0.3μL，模板1μL，5.9μL双蒸水。qRT-PCR反应流程：95℃：30s,40个循环(95℃：5s，55℃：45s)。通过熔融曲线确定反应的特异性，内参基因为BrUBC10，基因的相对表达量通过2

表6转基因白菜植株qRT-PCR分析所用引物

结果如图4中的D、E和F所示，表明转基因株系(35S：：BrGLK2a，35S：：BrGLK2b)中BrGLK2基因均发生了过表达。

实施例6转基因株系(35S：：BrGLK2a，35S：：BrGLK2b)的抽薹开花时间统计

将实施例6中已获得的白菜BrGLK2a基因或白菜BrGLK2b基因过表达转基因植株种子于28℃催芽过夜后，点播于72孔穴盘中，15d时移至15孔穴盘中。以现蕾后薹高1cm时的生长天数作为抽薹开花时间，对转基因植株进行抽薹开花时间统计，同样采用转入pAC004载体的转基因白菜植株作为对照植株(CK)。结果如图5中的A和B所示，BrGLK2a和BrGLK2b过表达转基因植株抽薹开花时间均明显延后。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述的仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。