一种小分子肽及其衍生物在制备骨健康产品中的应用

技术领域

本发明涉及食品和医药健康技术领域，尤其是涉及一种小分子肽及其衍生物在制备骨健康产品中的应用。

背景技术

骨骼是人体结构的重要组成部分，同时也是人体各项机能的支撑支架。骨骼健康对人体健康具有举足轻重的作用，骨骼的代谢异常可影响心血管系统等其他系统的代谢与健康状况，其中，骨质疏松症是一种最常见的全身性的骨骼代谢异常疾病，其以骨密度值(Bone mineral density，BMD)降低、骨强度下降、骨骼矿化受损及骨折风险增加为主要病理特征。骨质疏松引起的脊柱、髋部、腕部等多部位的脆性骨折，严重影响患者的运动功能和生活质量，也为社会带来巨大的经济及医疗负担。目前骨质疏松的治疗主要基于两种策略，一种是增加成骨细胞分化和矿化，促进骨形成，旨在通过增加成骨细胞和骨细胞以补充缺失的骨组织，增加骨量，相关市售药物主要是甲状旁腺激素(PTH)；另一种策略则是通过促进破骨细胞凋亡、抑制破骨细胞活化，旨在降低骨吸收，缓解骨量持续丢失，改善骨质疏松及相关症状，相关临床用药主要为双磷酸盐类。然而这些药物长期使用副作用较多，如长期使用双磷酸盐类药物对肾脏、肝脏和胃肠道等组织器官产生毒副作用，长期使用甲状旁腺激素类药物会增加骨肉瘤的发生风险。

相关技术中，生物活性肽的研究和产业化应用备受关注，生物活性肽通常含有2-20个氨基酸残基，分子量小于6000Da。食源性生物活性肽因具有安全性高、吸收良好及营养丰富等特点，在食品、保健食品及生物医药领域具有广泛的应用前景。相关研究表明，鸡肽具有抗氧化、抗炎、免疫调节等广泛的生物活性，但是市场上多以低聚混合肽为主，且其在骨骼疾病中的作用机制及物质基础并不明确。

因此，开发一种安全性高、副作用低、适合长期服用的小分子肽用于制备骨健康产品是非常必要且迫切的。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种小分子肽及其衍生物在制备骨健康产品中的应用，其能够有效增加斑马鱼脊柱椎骨的骨密度、逆转地塞米松诱导的斑马鱼脊椎骨骨密度降低以及显著促进转基因斑马鱼(osx:cy25)骨生成，对预防和改善骨质疏松症状具有显著的效果。

本发明还提出一种小分子肽或其衍生物在制备促进成骨细胞前体细胞增殖的产品中的应用。

本发明还提出一种小分子肽或其衍生物在制备促进动物骨生成的产品中的应用。

本发明还提出一种小分子肽或其衍生物在制备增加动物骨密度的产品中的应用。

本发明还提出一种小分子肽或其衍生物在制备预防和/或改善骨质疏松症状产品中的应用。

本发明的第一方面，提供一种小分子肽及其衍生物在制备骨健康产品中的应用，所述小分子肽为二肽Cyclo(L-Phe-L-Phe)。

根据本发明实施例的应用，至少具有如下有益效果：本发明提供的寡肽CPP(即二肽Cyclo(L-Phe-L-Phe))在促进骨生成、增加骨密度等方面具有优异的效果，具体包括以下方面：

(1)本发明提供的寡肽CPP在低剂量时能促进成骨细胞前体细胞MC3T3-E1增殖，在较高浓度时没有表现出明显的毒性；

(2)本发明提供的寡肽CPP对斑马鱼幼鱼没有显现出明显的毒性作用；

(3)本发明提供的寡肽CPP能有效增加斑马鱼脊柱椎骨的骨密度；

(4)本发明提供的寡肽CPP能有效逆转地塞米松诱导的斑马鱼脊椎骨骨密度降低；

(5)本发明提供的寡肽CPP显著促进转基因斑马鱼(osx:cy25)骨生成。

本发明的第二方面，提供一种小分子肽或其衍生物在制备促进成骨细胞前体细胞增殖的产品中的应用，所述小分子肽为二肽Cyclo(L-Phe-L-Phe)。

本发明的第三方面，提供一种小分子肽或其衍生物在制备促进动物骨生成的产品中的应用，所述小分子肽为二肽Cyclo(L-Phe-L-Phe)。

本发明的第四方面，提供一种小分子肽或其衍生物在制备增加动物骨密度的产品中的应用，所述小分子肽为二肽Cyclo(L-Phe-L-Phe)。

本发明的第五方面，提供一种小分子肽或其衍生物在制备预防和/或改善骨质疏松症状产品中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述二肽Cyclo(L-Phe-L-Phe)的结构式为：

在本发明的一些实施方式中，所述产品包括药品和功能性食品

在本发明的一些实施方式中，所述药品的剂型为固体、半固体或液体的形式；

优选地，所述药品的剂型为水溶液、非水溶液、混悬液或膏体；

更优选地，所述药品的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液、乳剂、干混悬剂、干浸膏剂或注射剂。

在本发明的一些实施方式中，所述药品的制备原料还可以包括药用辅料。

在本发明的一些优选实施方式中，所述药用辅料为本领域常规药用载体，可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料；

优选地，所述药用辅料选自崩解剂、稀释剂、润滑剂、粘合剂、湿润剂、矫味剂、助悬剂、表面活性剂、防腐剂中的至少一种；

更优选地，所述崩解剂选自玉米淀粉、马铃薯淀粉、交联聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联羧甲纤维素钠、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、藻酸中的至少一种；

更优选地，所述稀释剂选自乳糖、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、磷酸钙、柠檬酸钙、结晶纤维素中的至少一种；

更优选地，所述润滑剂选自微粉硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、滑石粉、无水硅胶中的至少一种；

更优选地，所述粘合剂选自阿拉伯胶、明胶、糊精、羟丙基纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种；

更优选地，所述湿润剂选自十二烷基硫酸钠；

更优选地，所述矫味剂选自阿斯巴甜、甜菊甙、蔗糖、麦芽糖醇、柠檬酸中的至少一种；

更优选地，所述助悬剂选自阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶中的至少一种；

更优选地，所述表面活性剂选自卵磷脂、山梨糖醇酐单油酸酯、单硬脂酸甘油酯中的至少一种；

更优选地，所述防腐剂选自对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述功能性食品的形式包括汤剂、饮料、糖果、口服液、胶囊剂、片剂、粉剂中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述二肽Cyclo(L-Phe-L-Phe)包括由动物、植物或微生物来源的天然产物。

在本发明的一些实施方式中，所述二肽Cyclo(L-Phe-L-Phe)包括由发酵合成、真核表达系统合成或人工合成的具有相同结构或相似结构的化合物。

在本发明的一些实施方式中，所述二肽Cyclo(L-Phe-L-Phe)的提取方法为采用有机试剂从鸡肉中提取二肽Cyclo(L-Phe-L-Phe)，所述有机试剂为醋酸、乙醚、柠檬酸、甲酸、酒石酸、苹果酸、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷、苯和石油醚中的一种或多种。

在本发明的一些实施方式中，所述二肽Cyclo(L-Phe-L-Phe)的提取方法为采用醋酸和乙醚作为有机试剂从鸡肉中提取二肽Cyclo(L-Phe-L-Phe)。

在本发明的一些实施方式中，所述二肽Cyclo(L-Phe-L-Phe)的提取方法为：

步骤1、将鸡肉干燥粉碎处理成鸡肉粉末；

步骤2、在鸡肉粉末中加入有机试剂进行寡肽及其衍生物萃取，收集有机溶剂并干燥，得到寡肽及其衍生物粗品粉末；

步骤3、将所述粉末溶于缓冲溶液中，经过Sephadex hh-20色谱柱洗脱，收集馏分并干燥，得到寡肽及其衍生物半成品粉末；

步骤4、将所述半成品溶于缓冲溶液中，经过ODS-HG-5液相色谱柱洗脱，收集馏分并干燥，得到二肽Cyclo(L-Phe-L-Phe)粉末。

在本发明的一些实施方式中，所述缓冲溶液为80wt％的乙腈水溶液。

本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明寡肽CPP对成骨细胞前体细胞MC3T3-E1细胞活力的影响结果图；

图2为本发明寡肽CPP对增加斑马鱼骨密度影响结果图；

图3为本发明实施例4斑马鱼脊椎骨的荧光显微镜图；

图4为本发明实施例4斑马鱼脊椎骨的荧光面积统计结果图；

图5为本发明实施例5斑马鱼硬骨显微镜图；

图6为本发明实施例5斑马鱼硬骨荧光强度统计图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明实施例中，寡肽CPP是从鸡肉中提取获得，其具体获取方法如下：

步骤S1、制备鸡肉粉末：取新鲜的鸡肉剪碎后干燥，然后用粉碎机以10000rpm/min进行粉碎，每粉碎2分钟，暂停一分钟，累计粉碎5分钟后，得到干燥粉末，随后将粉末过40目筛后，筛下部分即为鸡肉粉末。

步骤S2、萃取小分子肽：称取上述制得的鸡肉粉末135g，随后加入浓度为1摩尔/升(mol/L)的醋酸溶液制备得到浓度为200mg/mL的鸡肉醋酸溶液，紧接着加入等体积的乙醚溶液后立刻振荡以便充分萃取，静置10分钟后收集乙醚层溶液并用旋转蒸发仪将其干燥，所得干燥粉末即为小分子肽粗品粉末。

步骤S3、含CPP的活性部位制备：将上述所得的干燥粉末溶解在80％的乙腈/水溶液中，并以80％的乙腈/水溶液作为缓冲液平衡，然后将样品加载到Sephadex hh-20色谱柱(6×18cm)上，等温洗脱，每80mL体积收集洗脱馏分并利用质谱鉴定出含有CPP的馏分，将含有CPP的馏分干燥制备得小分子肽半成品粉末。

步骤S4、CPP的制备：将步骤S3制备得到的干燥粉末溶解于8％乙腈/水中，并以8％的乙腈/水溶液作为缓冲液平衡，随后将样品加载到ODS-HG-5液相色谱柱上，用相同的缓冲液进行平衡，比对CPP标准品，在CPP相应的保留时间处收集洗脱馏分，然后干燥CPP，制备得到CPP粉末。

步骤S5、CPP粉末鉴定：将步骤S4制备得到的CPP粉末溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，随后利用高效液相色谱串联紫外检测器检测CPP粉末的纯度，色谱条件为：液相采用反相系统分离，以0.1％甲酸水为洗脱A相，乙腈为洗脱B相。色谱柱型号为(HSS T3 1.8μm，C18，100×2.1mm，Waters Acquity)。洗脱程序如下：0min：25％B；0.25min:25％B；1.5min:55％B3min:65％B；5.5min:99％B；9min:99％B；9.5min:25％B；15min:25％B。流速为0.25mL/min。柱温为40℃。进样量2μL。紫外检测器的检测波长为254nm。紧接着，利用高效液相色谱串联质谱对CPP粉末进行表征验证，色谱及质谱条件为：赛默飞(Thermo FisherScientific)双三元高效液相色谱(DGLC)串联四极杆轨道阱高分辨质谱仪(Q-Exactive)进行LC-MS/MS分析。液相采用反相系统分离，以0.1％甲酸水为洗脱A相，乙腈为洗脱B相。色谱柱型号为(HSS T31.8μm，C18，100×2.1mm，Waters Acquity)。洗脱程序如下：0min：25％B；0.25min:25％B；1.5min:55％B；3min:65％B；5.5min:99％B；9min:99％B；9.5min:25％B；15min:25％B。流速为0.25mL/min。柱温为40℃。进样量2μL。质谱扫描模式为正、负离子切换全扫。一级质谱扫描质量范围为100-1000m/z，分辨率为35000，最大注射时间35ms；MS2扫描分辨率为17,500，最大注射时间50ms，碰撞能35eV，扫描隔离窗口设置为0.8m/z。正、负离子毛细管喷雾电压均设定为3.0kV，毛细管温度为350℃，辅助器加热温度为320℃，S-lens Rf设置为60。质谱鉴定结果表明，本实施例所获得的产品为CPP，化学结构为：

其纯度大于95％。

实施例1：寡肽CPP促进成骨细胞前体细胞MC3T3-E1增殖实验

本实施案例采用经典的MTT(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromi de)实验检测细胞活力。MTT是一种黄色粉末，全称为噻唑兰，MTT实验的检测原理是MT T可透过细胞膜进入细胞内，被活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶还原为难溶于水的蓝紫色的针状结晶甲臜并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。活细胞形成的结晶物能被二甲基亚砜(DMSO)溶解，其检测出来的光吸收值可间接反映细胞存活和生长的状况。

寡肽CPP对成骨细胞前体细胞MC3T3-E1细胞活力影响实验具体过程如下：

(1)选择状态良好、处于对数生长期，且培养皿中生长密度达80％左右的小鼠成骨细胞前体细胞MC3T3-E1(细胞购买于江苏凯基生物技术股份有限公司)铺于96孔板中，每孔8000个细胞，置于培养箱中培养(培养基：α-MEM培养基+10％胎牛血清，5％CO

(2)将96孔板中的细胞培养液弃去，每孔加入100μL配制好的系列浓度CPP溶液，其CPP溶液系列浓度分别为0.06μM、0.6μM、6μM、10μM、20μM、40μM、60μM、80μM和100μM，每个剂量组设置5～6个复孔，置于培养箱继续培养24小时。

(3)药物作用结束后，每孔加入10μL配制好的5mg/ml MTT溶液，置于培养箱继续培养3h后弃去原液，每孔加入200μl DMSO，室温振荡10分钟后用酶标仪检测570nm各孔的光吸收值(A)。按照以下公式计算细胞存活率(％)＝(A

结果如图1所示，当寡肽CPP浓度较低时(≤20μM)时，CPP对MC3T3-E1细胞增殖均具有一定的促进作用。当CPP浓度大于20μM小于100μM，成骨细胞前体细胞MC3T3-E1细胞活力仍维持在80％以上。表明CPP在较低浓度时具有促进成骨细胞增殖效果，在较高浓度时成骨细胞前体细胞MC3T3-E1细胞仍维持较高的活力，CPP具有较好的安全性。

实施例2：寡肽CPP对斑马鱼幼鱼的毒性影响实验

本实施例检测了寡肽CPP对斑马鱼幼鱼的毒性，具体检测方法如下：

(1)将斑马鱼饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为450～550μS/cm；pH为6.5～8.5；硬度为50～100mg/L CaCO

(2)随机选取3dpf转基因硬骨绿色荧光斑马鱼(cy25)于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。水溶给予寡肽CPP，实验组寡肽CPP的浓度设置为3.75μM、7.50μM、15.0μM、30.0μM、60.0μM，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL。除正常对照组外，其余各组均水溶给予地塞米松(Dex，10μM)建立斑马鱼成骨损伤模型，其中地塞米松(Dex)给药处理时间为4天，每天换一次液。5dpf换液一次。样品处理期间，每天统计各实验组的斑马鱼死亡数量并及时移除。28℃处理4天后，检测CPP对斑马鱼幼鱼毒性的影响。

实验结果如表1所示。

表1：寡肽CPP对斑马鱼幼鱼的毒性结果(n＝30)

结果显示寡肽CPP在最高浓度为60μM时亦未见斑马鱼幼鱼死亡，表明CPP的用药浓度窗口大，安全性高。

实施例3：寡肽CPP对斑马鱼脊椎骨骨密度影响实验

本实施例检测了寡肽CPP对斑马鱼脊椎骨骨密度影响，具体检测方法如下：

(1)将野生型斑马鱼(AB型)饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为450～550μS/cm；pH为6.5～8.5；硬度为50～100mg/L CaCO

(2)选取4dpf斑马鱼若干，随机分为6组，置于24孔板中，每孔6条鱼。用胚胎培养液配制不同浓度的CPP溶液(10nM，100nM，1μM，10μM，20μM)。将24孔板中的胚胎培养液换成不同浓度的CPP溶液(其中对照组不添加)，连续给药5天，每天换液，并记录斑马鱼死亡率。于9dpf，用0.1％钙黄绿素(pH＝8.2)染色90分钟后再用胚胎培养液清洗三次去除多余染料，于荧光显微镜下拍摄斑马鱼脊柱骨骼生长情况，随后用imageJ统计脊椎骨的荧光面积。统计学处理结果采用means±SD表示。用SPSS25.0软件进行统计学分析，P<0.05(标记为“*”)表明差异具有统计学意义。

实验结果如图2所示，从图中可以看出CPP处理后则能有效增加斑马鱼脊椎骨生成，并显著增加斑马鱼的骨密度。

实施例4：寡肽CPP对地塞米松诱导的斑马鱼脊椎骨骨密度影响实验

本实施例检测了寡肽CPP对地塞米松诱导的斑马鱼脊椎骨骨密度的影响，具体检测方法如下：

(1)将野生型斑马鱼(AB型)饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为450～550μS/cm；pH为6.5～8.5；硬度为50～100mg/L CaCO

(2)随机选取5dpf AB型斑马鱼于12孔板中，每孔5尾斑马鱼。水溶给予寡肽CPP(0.01μM、0.1μM和1μM)，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为2mL。除正常对照组外，其余各组均水溶给予地塞米松(Dex，10μM)建立斑马鱼成骨损伤模型。每天换液一次。28℃处理4天后，用1％钙黄绿素溶液对斑马鱼进行染色，并置于荧光显微镜下观察以检测斑马鱼脊椎骨的荧光面积。统计学处理结果采用means±SD表示。用SPSS25.0软件进行统计学分析，P<0.05表明差异具有统计学意义。

实验结果如图3和图4所示，Dex显著抑制斑马鱼脊椎骨的生成，而给予CPP处理后则能有效逆转斑马鱼脊椎骨生成抑制，有效增加斑马鱼的骨密度。

实施例5：寡肽CPP对促进转基因斑马鱼(osx:cy25)骨生成影响实验

本实施例检测了寡肽CPP对促进转基因斑马鱼(osx:cy25)骨生成效果，具体检测方法如下：

(1)将斑马鱼饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为450～550μS/cm；pH为6.5～8.5；硬度为50～100mg/L CaCO

(2)随机选取3dpf转基因硬骨绿色荧光斑马鱼(osx:cy25)于6孔板中，每孔均处理30尾斑马鱼。水溶给予CPP处理，其CPP溶液浓度设置分别为7.5μM、15μM和30μM，阳性对照阿仑膦酸钠5.00μg/mL，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL。除正常对照组外，其余各组均水溶给予Dex(10μM)建立斑马鱼成骨损伤模型。5dpf换液一次。28℃处理4天后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照，使用NIS-Elements D 3.20高级图像处理软件分析并采集数据，分析斑马鱼硬骨荧光强度，以该指标的统计学分析结果评价样品促成骨功效。统计学处理结果采用means±SD表示。用SPSS25.0软件进行统计学分析，P<0.05表明差异具有统计学意义。

实验结果如图5和图6所示，从图中可以看CPP能有效促进斑马鱼骨生成。

综上所述，本发明提供的寡肽CPP在促进骨生成、增加骨密度等方面具有优异的效果，本发明提供的寡肽CPP在低剂量时能促进成骨细胞前体细胞MC3T3-E1增殖，在较高浓度时没有表现出明显的毒性；本发明提供的寡肽CPP对斑马鱼幼鱼没有显现出明显的毒性作用；本发明提供的寡肽CPP能有效增加斑马鱼脊柱椎骨的骨密度；本发明提供的寡肽CPP能有效逆转地塞米松诱导的斑马鱼脊椎骨骨密度降低；本发明提供的寡肽CPP显著促进转基因斑马鱼(osx:cy25)骨生成。

上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。