通过治疗性纳米生物制剂组合物抑制驯化免疫

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年11月20日提交的序列号为62/588,790的美国专利申请，以及2018年9月21日提交的序列号为62/734,664美国专利申请的优先权，二者均通过引用全部并入本文中。

关于联邦政府资助研发的声明

本发明是在美国国立卫生研究院授予的R01 HL118440资助的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。

技术领域

本发明涉及治疗性纳米生物制剂组合物和方法，其通过抑制驯化免疫，来治疗已经具有器官移植物的患者，或患有动脉粥样硬化、关节炎、炎症性肠病包括克罗恩氏(Crohn’s)症、自身免疫性疾病，和/或自发性炎症症状，或发生了心血管事件(包括中风和心肌梗塞)之后的患者，其中驯化免疫是继发性长期高反应性，表现为由代谢和表观遗传重排引起的细胞因子分泌增加，以在骨髓、脾脏和血液中的髓系细胞及其祖细胞和干细胞发生原发性损伤后进行再刺激。

背景技术

对于患有自身免疫和免疫系统功能障碍的患者，当前治疗是不足的。具有器官移植物的患者，或患有动脉粥样硬化、关节炎、炎症性肠病包括克罗恩氏病、自身免疫性疾病包括糖尿病，和/或自身炎性疾状，或发生了心血管事件(包括中风和心肌梗塞)之后的患者，需要持久的治疗模式，并且不会引起比主要治疗本身更多的副作用问题。

发明内容

因此，为了解决现有技术中的这些和其他缺陷，在本发明的优选的实施方式中，提供了使用抑制驯化免疫的治疗剂，来治疗有需要的患者的方法。

驯化免疫被定义为继发性长期高反应性，表现为由代谢和表观遗传重排引起的细胞因子分泌增加，以在骨髓、脾脏和血液中的髓系细胞及其祖细胞和干细胞发生原发性损伤后进行再刺激。驯化免疫(也称为先天免疫记忆)还被定义为，在经髓系先天免疫细胞的继发性刺激进行再刺激后，通过刺激骨髓和脾脏中的这些细胞或其祖细胞和干细胞的原发性损伤所诱导的，并通过表观遗传、代谢和转录重排所介导的，长期提高的反应性(例如，高细胞因子产生)。

在本发明的非限制性优选的实施方式中，提供了一种治疗受驯化免疫影响的患者，以降低所述患者的先天免疫应答的方法，向所述患者，以有效降低高反应性先天免疫应答的量，施用纳米生物制剂组合物其中所述纳米生物制剂组合物包括(i)纳米级组装物，具有(ii)并入所述纳米级组装物中的抑制剂药物，

其中所述纳米级组装物是多组分载体组合物，包括：

(a)磷脂，以及

(b)载脂蛋白A-I(apoA-I)或apoA-I的肽模拟物，

其中所述纳米生物制剂，在水性环境中，是尺寸为直径在约8nm至400nm之间的自组装的纳米盘或纳米球；

其中所述抑制剂药物是疏水性药物，或亲水性药物的前药，衍生有附接的脂肪族链或胆固醇或磷脂，

其中所述药物是炎症小体的抑制剂，或造血干细胞(HSC)、普通髓系祖细胞(CMP)或髓系细胞内的代谢途径或表观遗传途径的抑制剂，

其中所述纳米级组装物将药物递送至患者的骨髓、血液和/或脾脏中的髓系细胞、髓系祖细胞或造血干细胞，

并且由此降低了患者中因驯化免疫引起的高反应性(hyper-responsive)先天免疫应答。

在本发明的非限制性优选的实施方式中，提供了一种治疗受驯化免疫影响的患者，以降低所述患者的先天免疫应答的方法，其中纳米级组装物是多组分载体组合物，包括：

磷脂，

载脂蛋白A-I(apoA-I)或apoA-I的肽模拟物，以及

疏水性基质，包括一种或多种甘油三酸酯、脂肪酸酯、疏水性聚合物或甾醇酯，或其结合。

在本发明的另一个非限制性优选的实施方式中，提供了一种治疗受驯化免疫影响的患者，以降低所述患者的高反应性先天免疫应答的方法，其中纳米级组装物体是多组分载体组合物，包括：

磷脂，

载脂蛋白A-I(apoA-I)或apoA-I的肽模拟物，

疏水性基质，包括一种或多种甘油三酸酯、脂肪酸酯、疏水性聚合物或甾醇酯，或其结合，以及

胆固醇。

在本发明的非限制性优选的实施方式中，提供了一种在患者中促进同种异体移植物接受的方法，其中所述患者是移植物受体，所述方法包括：

向所述患者，以有效诱导永久同种异体移植接受的量，施用纳米生物制剂组合物，

其中所述纳米生物制剂组合物包括(i)纳米级组装物，具有(ii)并入所述纳米级组装物中的抑制剂药物，

其中所述纳米级组装物是多组分载体组合物，包括：

(a)磷脂或磷脂混合物，以及，

(b)载脂蛋白A-I(apoA-I)或apoA-I的肽模拟物，

其中所述纳米生物制剂，在水性环境中，是尺寸为直径在约8nm至400nm之间的自组装的纳米盘或纳米球；

其中所述抑制剂药物是疏水性药物，或亲水性药物的前药，衍生有附接的脂肪族链或胆固醇或磷脂，

其中所述药物是炎症小体的抑制剂，或造血干细胞(HSC)、普通髓系祖细胞(CMP)或髓系细胞内的代谢途径或表观遗传途径的抑制剂，

其中所述纳米级组装物将药物递送至患者的骨髓、血液和/或脾脏中的髓系细胞、髓系祖细胞或造血干细胞，

并且由此在移植物受体患者中，诱导永久性同种异体移植物接受。

在本发明的非限制性优选的实施方式中，提供了一种在患者中促进同种异体移植物接受的方法，其中所述患者是移植物受体，其中纳米级组装物是多组分载体组合物，包括：

磷脂或磷脂混合物，

载脂蛋白A-I(apoA-I)或apoA-I的肽模拟物，以及

基质脂质，选自一种或多种甘油三酸酯、脂肪酸酯、疏水性聚合物和甾醇酯。

在本发明的非限制性优选的实施方式中，提供了一种在患者中促进同种异体移植物接受的方法，其中所述患者是移植物受体，其中纳米级组装物是多组分载体组合物，包括：

磷脂或磷脂混合物，

载脂蛋白A-I(apoA-I)或apoA-I的肽模拟物，

基质脂质，选自一种或多种甘油三酸酯、脂肪酸酯、疏水性聚合物和甾醇酯，以及

胆固醇。

在本发明的非限制性优选的实施方式中，以本文中的任何一种方法中提供，其中将高反应性先天免疫应答降低了至少7至30天。

在本发明的非限制性优选的实施方式中，以本文中的任何一种方法中提供，其中将高反应性先天免疫应答降低了至少30至100天。

在本发明的非限制性优选的实施方式中，以本文中的任何一种方法中提供，其中使由驯化免疫(高反应性先天免疫应答)导致的髓系细胞，它们的干细胞和祖细胞的长期高反应性降低了至少100天，至多数年。

在本发明的非限制性优选的实施方式中，以本文中的任何一种方法中提供，其中所述纳米生物组合物施用一次，其中使由驯化免疫导致的髓系细胞，它们的干细胞和祖细胞的长期高反应性降低了至少30天。

在本发明的非限制性优选的实施方式中，以本文中的任何一种方法中提供，其中在多次给药方案的每一天，每天至少施用一次纳米生物制剂组合物，并且其中使由驯化免疫导致的髓系细胞、它们的干细胞和祖细胞的长期高反应性降低了至少30天。

在本发明的非限制性优选的实施方式中，以本文中的任何一种方法中提供，其中驯化免疫被定义为继发性长期高反应性，表现为通过代谢和表观遗传重排引起的细胞因子分泌增加，以在骨髓、脾脏和血液中的髓系细胞及其祖细胞和干细胞发生原发性损伤后进行再刺激。

在本发明的非限制性优选的实施方式中，以本文中的任何一种方法中提供，其中驯化免疫被定义为，在经髓系先天免疫细胞的继发性刺激进行再刺激后，通过刺激骨髓中的这些细胞或其祖细胞和干细胞的原发性损伤所诱导，并通过表观遗传、代谢和转录重排所介导的，高细胞因子产生导致的长期提高的反应性。

在本发明的非限制性优选的实施方式中，以本文中的任何一种方法中提供，其中受驯化免疫影响的患者是器官移植物的受体，或患有动脉粥样硬化、关节炎、炎性肠病包括克罗恩氏病、自身免疫性疾病包括糖尿病、自身炎症性疾病，或已经经历了心血管事件，包括中风和心肌梗塞。

在本发明的非限制性优选的实施方式中，以本文的任何一种方法提供，其中所述患者是移植物受体，或患有动脉粥样硬化、关节炎或炎性肠病，或已经经历了心血管事件。

在本发明的非限制性优选的实施方式中，以本文中的任何一种方法中提供，其中所述患者已经进行了移植，并且移植的组织是肺组织、心脏组织、肾脏组织、肝脏组织、视网膜组织、角膜组织、皮肤组织、胰腺组织、肠组织、生殖器组织、卵巢组织、骨组织、腱组织、骨髓或血管组织。

在本发明的非限制性优选的实施方式中，以本文中的任何一种方法中提供，其中该方法在移植之前进行，以将细胞因子的产生恢复到幼稚、非高反应性水平，并诱导持久的幼稚、非高反应性细胞因子的产生水平，并有利地降低患者的炎症与免疫抑制性髓系细胞比例，用于移植后接受。

在本发明的非限制性优选的实施方式中，以本文中的任何一种方法中提供，其中所述纳米生物制剂组合物以治疗方案施用，其中治疗方案包括对患者施用一次或多次剂量，以在骨髓、血液和/或脾脏中的髓系细胞、髓系祖细胞和造血干细胞中产生药物积累。

在本发明的非限制性优选的实施方式中，以本文中的任何一种方法中提供，其中抑制剂包括：炎症小体抑制剂，或代谢途径或表观遗传途径的抑制剂，例如但不限于NOD2受体抑制剂、mTOR抑制剂、核糖体蛋白S6激酶β-1(S6K1)抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂(他汀类)、组蛋白H3K27脱甲基酶抑制剂、BET溴结构域阻断抑制剂、组蛋白甲基转移酶以及乙酰转移酶抑制剂、DNA甲基转移酶和乙酰转移酶抑制剂、丝氨酸/苏氨酸激酶Akt抑制剂、缺氧诱导因子1-α(也称为HIF-1-α)抑制剂，及其一种或多种的混合物。

在本发明的非限制性优选的实施方式中，以本文中的任何一种方法中提供，包括，作为与纳米生物制剂组合物的联合治疗，与免疫治疗药物共同治疗。

在本发明的非限制性优选的实施方式中，提供了一种用于抑制驯化免疫的纳米生物制剂组合物，包括：

纳米级组装物，具有(ii)并入所述纳米级组装物中的抑制剂药物，

其中所述纳米级组装物是多组分载体组合物，包括：

(a)磷脂或磷脂混合物，以及

(b)载脂蛋白A-I(apoA-I)或apoA-I的肽模拟物，

其中所述纳米生物制剂，在水性环境中，是尺寸为直径在约8nm至400nm之间的自组分纳米盘或纳米球；

其中所述抑制剂药物是疏水性药物，或亲水性药物的前药，衍生有附接的脂肪族链或胆固醇或磷脂，

其中所述药物是炎症小体的抑制剂，或造血干细胞(HSC)、普通髓系祖细胞(CMP)或髓系细胞内的代谢途径或表观遗传途径的抑制剂。

在本发明的非限制性优选的实施方式中，提供了一种用于抑制驯化免疫的纳米生物制剂组合物，其中所述纳米级组装物是多组分载体组合物，包括：

磷脂或磷脂混合物，

载脂蛋白A-I(apoA-I)或apoA-I的肽模拟物，以及

疏水性基质，包括一种或多种甘油三酸酯、脂肪酸酯、疏水性聚合物和甾醇酯。

在本发明的非限制性优选的实施方式中，提供了一种用于抑制驯化免疫的纳米生物制剂组合物，其中所述纳米级组装物是多组分载体组合物，包括：

磷脂或磷脂混合物，

载脂蛋白A-I(apoA-I)或apoA-I的肽模拟物，

疏水性基质，包括一种或多种甘油三酸酯、脂肪酸酯、疏水性聚合物和甾醇酯，以及

胆固醇。

在本发明的非限制性优选的实施方式中，提供了一种用于抑制驯化免疫的纳米生物制剂组合物，其中代谢途径或表观遗传途径的抑制剂包括：NOD2受体抑制剂、mTOR抑制剂、核糖体蛋白S6激酶β-l(S6K1)抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂(他汀类)、组蛋白H3K27脱甲基酶抑制剂、BET溴结构域阻断抑制剂、组蛋白甲基转移酶和乙酰转移酶抑制剂、DNA甲基转移酶和乙酰转移酶抑制剂、炎症小体抑制剂、丝氨酸/苏氨酸激酶Akt抑制剂、缺氧诱导因子1-α(也称为HIF-1-α)抑制剂，及其一种或多种的混合物。

在本发明的非限制性优选的实施方式中，提供了一种制造用于抑制驯化免疫的纳米生物制剂组合物的工艺，包括以下步骤:

将抑制剂药物并入纳米级组装物中；

其中所述纳米级组装物是多组分载体组合物，包括：

(a)磷脂或磷脂混合物，以及

(b)载脂蛋白A-I(apoA-I)或apoA-I的肽模拟物，

其中所述纳米生物制剂，在水性环境中，自组装成尺寸为直径在约8nm至400nm之间的纳米盘或纳米球；

其中所述抑制剂药物亲水性药物的前药或疏水性药物，衍生有附接的脂肪族链或胆固醇或磷脂，

其中所述药物是炎症小体的抑制剂，或造血干细胞(HSC)、普通髓系祖细胞(CMP)或髓系细胞内的代谢途径或表观遗传途径的抑制剂。

在本发明的非限制性优选的实施方式中，提供了一种制造用于抑制驯化免疫的纳米生物制剂组合物的工艺，其中纳米级组装物是多组分载体组合物，包括：

磷脂或磷脂混合物，

载脂蛋白A-I(apoA-I)或apoA-I的肽模拟物，以及

疏水性基质，包括一种或多种甘油三酸酯、脂肪酸酯、疏水性聚合物和甾醇酯。

在本发明的非限制性优选的实施方式中，提供了一种制造用于抑制驯化免疫的纳米生物制剂组合物的工艺，其中纳米级组装物是多组分载体组合物，包括：

磷脂或磷脂混合物，

载脂蛋白A-I(apoA-I)或apoA-I的肽模拟物，

疏水性基质，包括一种或多种甘油三酸酯、脂肪酸酯、疏水性聚合物和甾醇酯，以及

胆固醇。

在本发明的非限制性优选的实施方式中，提供了一种制造工艺，其中使用微流体、高压均质放大微流体技术、超声处理、有机-至-水输注或脂膜水合，来组合组装物。

在本发明的非限制性优选的实施方式中，提供了一种用于对骨髓、血液和脾脏中积累物进行成像的纳米生物制剂组合物，包括：

纳米级组装物，具有(ii)并入所述纳米级组装物中的抑制剂药物，和(iii)并入所述纳米级组装物中的正电子发射断层扫描(PET)成像放射性同位素，

其中所述纳米级组装物是多组分载体组合物，包括：

(a)磷脂或磷脂混合物，以及

(b)载脂蛋白A-I(apoA-I)或apoA-I的肽模拟物，

其中所述纳米生物制剂，在水性环境中，是尺寸为直径在约8nm至400nm之间的自组装的纳米盘或纳米球；

其中所述抑制剂药物是亲水性药物的前药或疏水性药物，衍生有附接的脂肪族链或胆固醇或磷脂，

其中所述药物是炎症小体的抑制剂，或造血干细胞(HSC)、普通髓系祖细胞(CMP)或髓系细胞内的代谢途径或表观遗传途径的抑制剂，以及

其中PET成像放射性同位素选自

在本发明的另一个非限制性优选的实施方式中，提供了一种用于对骨髓、血液和脾脏中的积累进行成像的纳米生物制剂组合物，包括：

纳米级组装物，具有(ii)并入所述纳米级组装物中的抑制剂药物，和(iii)并入所述纳米级组装物中的正电子发射断层扫描(PET)成像放射性同位素，

其中所述纳米级组装物是多组分载体组合物，包括：

(a)磷脂或磷脂混合物，和

(b)载脂蛋白A-I(apoA-I)或apoA-I的肽模拟物，和

(c)疏水性基质，包括一种或多种甘油三酸酯、脂肪酸酯、疏水性聚合物和甾醇酯，

其中所述纳米生物制剂，在水性环境中，是尺寸为直径在约8nm至400nm之间的自组装的纳米盘或纳米球；

其中所述抑制剂药物是亲水性药物的前药或疏水性药物，衍生有附接的脂肪族链或胆固醇或磷脂，

其中所述药物是炎症小体的抑制剂，或造血干细胞(HSC)、普通髓系祖细胞(CMP)或髓系细胞内的代谢途径或表观遗传途径的抑制剂，以及

其中PET成像放射性同位素选自

在本发明的另一个非限制性优选的实施方式中，提供了一种用于对骨髓、血液和脾脏中的积累物进行成像的纳米生物制剂组合物，包括：

纳米级组装物，其具有(ii)并入所述纳米级组装物中的抑制剂药物，和(iii)并入所述纳米级组装物中的正电子发射断层扫描(PET)成像放射性同位素，

其中所述纳米级组装物是多组分载体组合物，包括：

(a)磷脂或磷脂混合物，和

(b)载脂蛋白A-I(apoA-I)或apoA-I的肽模拟物，

(c)疏水性基质，包括一种或多种甘油三酸酯、脂肪酸酯，疏水性聚合物和甾醇酯，和

(d)胆固醇，

其中所述纳米生物制剂，在水性环境中，是尺寸为直径在约8nm至400nm之间的自组装的纳米盘或纳米球；

其中所述抑制剂药物是亲水性药物的前药或疏水性药物，衍生有附接的脂肪族链或胆固醇或磷脂，

其中所述药物是炎症小体的抑制剂，或造血干细胞(HSC)、普通髓系祖细胞(CMP)或髓系细胞内的代谢途径或表观遗传途径的抑制剂，以及

其中PET成像放射性同位素选自

在本发明的非限制性优选的实施方式中，提供了一种正电子发射断层扫描(PET)的方法，该方法对受驯化免疫影响的患者的骨髓、血液和/或脾脏内的纳米生物制剂积累物进行成像，该方法包括：向所述患者施用纳米生物制剂组合物，用于对骨髓、血液和脾脏中积累物进行成像，所述纳米生物制剂组合物包括：

纳米级组装物，具有(ii)并入该纳米级组装物中的抑制剂药物，和(iii)并入该纳米级组装物中的正电子发射断层扫描(PET)成像放射性同位素，

其中所述纳米级组装物是多组分载体组合物，包括：

(a)磷脂或磷脂混合物，和

(b)载脂蛋白A-I(apoA-I)或apoA-I的肽模拟物，

其中所述纳米生物制剂，在水性环境中，是尺寸为直径在约8nm至400nm之间的自组装的纳米盘或纳米球；

其中所述抑制剂药物是亲水性药物的前药或疏水性药物，衍生有附接的脂肪族链或胆固醇或磷脂，

其中所述药物是炎症小体的抑制剂，或造血干细胞(HSC)、普通髓系祖细胞(CMP)或髓系细胞内的代谢途径或表观遗传途径的抑制剂，以及

其中PET成像放射性同位素选自

(2)对患者进行PET成像，以使稳定的纳米生物制剂-放射性同位素螯合物，在患者身体的骨髓，血液和/或脾脏中的生物分布可视化。

在本发明的非限制性优选的实施方式中，提供了一种正电子发射断层扫描(PET)的方法，该方法对受驯化免疫影响的患者的骨髓、血液和/或脾脏内的纳米生物制剂积累物进行成像，该方法包括：向所述患者施用，用于对骨髓、血液和脾脏中积累物进行成像的纳米生物组合物，该纳米生物组合物包括：

纳米级组装物，具有(ii)并入所述纳米级组装物中的抑制剂药物，和(iii)并入所述纳米级组装物中的正电子发射断层扫描(PET)成像放射性同位素，

其中所述纳米级组装物是多组分载体组合物，包括：

(a)磷脂或磷脂混合物，和

(b)载脂蛋白A-I(apoA-I)或apoA-I的肽模拟物，和

(c)疏水性基质，包括一种或多种甘油三酸酯、脂肪酸酯、疏水性聚合物和甾醇酯，

其中所述纳米生物制剂，在水性环境中，是尺寸为直径在约8nm至400nm之间的自组装的纳米盘或纳米球；

其中所述抑制剂药物是亲水性药物的前药或疏水性药物，衍生有附接的脂肪族链或胆固醇或磷脂，

其中所述药物是炎症小体的抑制剂，或造血干细胞(HSC)、普通髓系祖细胞(CMP)或髓系细胞内的代谢途径或表观遗传途径的抑制剂，以及

其中PET成像放射性同位素选自

(2)对患者进行PET成像，以使稳定的纳米生物制剂-放射性同位素螯合物在患者骨髓、血液和/或脾脏中的生物分布可视化。

在本发明的非限制性优选的实施方式中，提供了一种正电子发射断层扫描(PET)的方法，该方法对受驯化免疫影响的患者的骨髓、血液和/或脾脏中的纳米生物制剂积累物进行成像，该方法包括：向所述患者施用，用于对骨髓、血液和脾脏中积累物进行成像的纳米生物制剂组合物，该纳米生物制剂组合物包括：

纳米级组装物，具有(ii)并入所述纳米级组装物中的抑制剂药物，和(iii)并入所述纳米级组装物中的正电子发射断层扫描(PET)成像放射性同位素，

其中所述纳米级组装物是多组分载体组合物，包括：

(a)磷脂或磷脂混合物，和

(b)载脂蛋白A-I(apoA-I)或apoA-I的肽模拟物，

(c)疏水性基质，包括一种或多种甘油三酸酯、脂肪酸酯、疏水性聚合物和甾醇酯，以及

(d)胆固醇，

其中所述纳米生物制剂，在水性环境中，是尺寸为直径在约8nm至400nm之间的自组装的纳米盘或纳米球；

其中所述抑制剂药物是亲水性药物的前药或疏水性药物，衍生有附接的脂肪族链或胆固醇或磷脂，

其中所述药物是炎症小体的抑制剂，或造血干细胞(HSC)、普通髓系祖细胞(CMP)或髓系细胞内的代谢途径或表观遗传途径的抑制剂，以及

其中PET成像放射性同位素选自

(2)对患者进行PET成像，以使稳定的纳米生物制剂-放射性同位素螯合物在患者骨髓，血液和/或脾脏中的生物分布可视化。

附图说明

移植

图1是供体和未移植的心脏中，波形蛋白和HMGB1表达的四张免疫染色图像(三次独立实验，n＝3/小鼠每组，t-检验；**P＜0.0l)，示出波形蛋白和HMGB1在器官移植后被上调，并促进移植物浸润巨噬细胞的驯化。

图2是在供体和未移植的心脏中，波形蛋白和HMGB1表达的实时PCR中，mRNA倍数表达图(三次独立实验，n＝3/小鼠每组，t-检验；**P＜0.0l)，并示出波形蛋白和HMGB1在器官移植后被上调，并促进移植物浸润巨噬细胞的驯化。

图3是蛋白(Western)印迹分析的四张图像，旁边是供体和未移植的心脏中，波形蛋白和HMGB1表达的两张柱形图(三次独立实验，n＝3只/小鼠每组，t-检验；**P＜0.01)，并示出了波形蛋白和HMGB1在器官移植后被上调，并促进移植物浸润巨噬细胞的驯化。

图4是流式细胞术分析的四幅示意图，并且示出了移植物浸润巨噬细胞中的树突状细胞相关性C型植物凝集素-l(dectin-1)和TLR4表达(两次独立实验，n＝3只小鼠/组)。

图5是流式细胞术分析的三幅示意图，并且示出了来自WT、dectin1 KO和TLR4 KO未经治疗的受体小鼠的移植浸润巨噬细胞中的Ly-6C表达(两次独立实验，n＝3只小鼠/组)。

图6是四幅柱形示意图，示出了用波形蛋白和HMGB，以及β-葡聚糖和LPS驯化的小鼠单核细胞的炎性细胞因子产生和染色质免疫沉淀(n＝3次独立实验，单因素方差分析(one-way ANOVA)，**P<0.0l；虚线显示对照非驯化条件)。

图7是三幅柱形示意图，示出了移植物浸润巨噬细胞的细胞因子和乳酸盐的产生(2次独立实验，n＝4只小鼠/每组，单因素ANOVA，**P＜0.0l)。

图8是四幅柱形示意图，示出了移植物浸润巨噬细胞的染色质免疫沉淀(2次独立实验，n＝4只小鼠/每组，单因素ANOVA，*P＜0.05；**P＜0.0l)。

图9是抑制剂-HDL复合物、载脂蛋白A1(ApoA1，也称为载脂蛋白A-I或ApoA-I)，加上双链和单链磷酸胆碱化合物的混合物(DMPC/MHPC)，加上雷帕霉素抑制剂(mTORi)的哺乳动物靶点，以形成抑制剂-HDL复合物(作为mTORi-HDL)的一个非限制性实施方式的成分和组装物的图解说明，其具有mTORi-HDL纳米生物制剂的透射电子显微镜(TEM)的50nm尺度图像。图9在一方面示出了，mTORi-HDL纳米免疫疗法在体外阻止驯化免疫，至幼稚细胞的水平，以及对血液中的髓系细胞、和骨髓和脾脏中的干细胞和祖细胞的亲和力，以及在体内的全身分布。

图10是三幅图，示出了在体外驯化的人类巨噬细胞的细胞因子和乳酸盐的产生(n＝3次独立实验，t-检验，*P＜0.05；虚线显示了对照非β-葡聚糖驯化条件)。图10在一方面示出了mTORi-HDL纳米免疫疗法在体外阻止驯化免疫，至幼稚细胞水平，以及对血液中的髓系细胞、骨髓和脾脏中的干细胞和祖细胞的亲和力，以及在体内的全身分布。

图11是四幅图，示出了在体外驯化的人类巨噬细胞的染色质免疫沉淀(n＝3次独立实验，t-检验，*P＜0.05；虚线显示了对照非β-葡聚糖驯化条件。图11在一方面示出了，mTORi-HDL纳米免疫疗法在体外阻止驯化免疫，至幼稚细胞水平，以及对血液中的的髓系细胞、骨髓和脾脏中的干细胞和祖细胞的亲和力，以及在体内的全身分布。

图12是标记的抑制剂-HDL复合物的一个非限制性的实施例的，标记组分和组成物的示意图。用放射性同位素

图13是mTORi-HDL纳米生物制剂的显微PET/CT和细胞特异性的示意图。图13在一方面示出了，mTORi-HDL纳米免疫疗法在体外阻止驯化免疫，至幼稚细胞水平，以及对血液中的髓系细胞、在骨髓和脾脏中的干细胞和祖细胞的亲和力，以及在体内的全身分布。

图14是代表性的显微PET/CT 3D融合图像，和PET最大强度投影图(MIP)以及结果图(平均值±SEM，n＝3)。图14在一方面示出了，mTORi-HDL纳米免疫疗法在体外阻止驯化免疫，至幼稚细胞水平，以及对血液中的髓系细胞、在骨髓和脾脏中的干细胞和祖细胞的亲和力，以及在体内的全身分布。

图15是髓系细胞和淋巴样细胞(n＝5只小鼠/组，单因素ANOVA，**P＜0.0l)摄取荧光标记的DiO mTORi-HDL的四幅示意图。图15在一方面示出了，mTORi-HDL纳米免疫疗法在体外阻止驯化免疫，至幼稚细胞水平，以及对血液中的髓系细胞、在骨髓和脾脏中的干细胞和祖细胞的亲和力，以及在体内的全身分布。

图16是骨髓祖细胞摄取经荧光标记的DiO mTORi-HDL的单幅图(平均值±SEM，n＝5)。图16在一方面示出了，mTORi-HDL纳米免疫疗法在体外阻止驯化免疫，至幼稚细胞水平，以及对血液中的髓系细胞、在骨髓和脾脏中的干细胞和祖细胞的亲和力，以及在体内的全身分布。

图17是移植到完全同种异体C57BL/6受体(F12b)中的BALB/c供体心脏(H2d)的示意图。图17在一方面示出了，mTORi-HDL纳米免疫疗法靶向同种异体移植物中的髓系细胞，并阻止了驯化免疫。

图18是静脉施用

图19是静脉内

图20是同种异体移植物中的髓系细胞和淋巴样细胞摄取经荧光标记的DiOmTORi-HDL的柱形图(3次独立实验，n＝4只小鼠/组；单因素ANOVA，*P＜0.05；**P＜0.0l)。图20在一方面示出了，mTORi-HDL纳米免疫疗法靶向同种异体移植物中的髓系细胞，并阻止了驯化免疫。

图21是在移植后第6天，在接受安慰剂，或mTORi-HDL治疗的受体的同种异体移植物中，Ly-6Chi/Ly-6Clo MΦ比例的饼状图(3次独立实验，n＝4只小鼠/组；单因素ANOVA，*P0.05；**P＜0.01)。图21在一方面示出了，mTORi-HDL纳米免疫疗法靶向同种异体移植物中的髓系细胞，并阻止了驯化免疫。

图22是接受安慰剂或mTORi-HDL治疗的受体(n＝3只小鼠/组)的，内部-移植物MΦ中的mTOR和糖酵解途径的，一对GSEA基因阵列分析图之一。图22在一方面示出了，mTORi-HDL纳米免疫疗法靶向同种异体移植物中的髓系细胞，并阻止驯化免疫。

图23是接受安慰剂或mTORi-HDL治疗的受体(n＝3只小鼠/组)的内部-植物中MΦ中的mTOR和糖酵解途径的，一对GSEA基因阵列分析图的第二幅。图23在一方面示出了，mTORi-HDL纳米免疫疗法靶向同种异体移植物中的髓系细胞，并阻止了驯化免疫。

图24是接受安慰剂，或mTORi-HDL治疗的受体的，移植物浸润巨噬细胞的，细胞因子和乳酸盐产生的柱形图的三幅示意图(3次独立实验，n＝4只小鼠/组，t-检验，*P＜0.05；**P＜0.0l)。图24在一方面示出了，mTORi-HDL纳米免疫疗法靶向同种异体移植物中的髓系细胞，并阻止了驯化免疫。

图25是接受安慰剂，或mTORi-HDL治疗的受体的，移植物浸润巨噬细胞的，染色质免疫沉淀的柱形图的四幅示意图(3次独立实验，n＝4只小鼠/组，t-检验，*P＜0.05；**P＜0.0l)。图25在一方面示出了，mTORi-HDL纳米免疫疗法靶向同种异体移植物中的髓系细胞，并阻止了驯化免疫。

图26是使用CD8 T细胞抑制和CD4 Treg扩增试验，对接受安慰剂和mTORi-HDL治疗的受体的，移植物浸润MΦ的功能表征的九幅示意图(3次独立实验，n＝4只小鼠/组，t检验，**P≤0.0l)。图26在一方面示出了，mTORi-HDL驯化免疫纳米免疫疗法，以及T细胞的CD40活化(非驯化免疫)结合，作为协同疗法，促进器官移植物的接受。

图27是接受安慰剂和mTORi-HDL治疗的受体的，移植物浸润CD4+CD25+Treg细胞的百分比的一对饼状图(3次独立实验，n＝4只小鼠/组，t检验，**P≤0.0l)。图27在一方面示出了，mTORi-HDL驯化免疫纳米免疫疗法，与T细胞的CD40活化(非驯化免疫)结合，作为协同疗法，促进器官移植物的接受。

图28是在接受安慰剂和mTORi-HDL治疗的受体中的，CD 169

图29是在耗竭CD169+移植物浸润Mreg后，移植物存活的线状图(n＝5只小鼠/组；卡普兰-梅尔(Kaplan-Meier)，**P≤0.0l)。图29在一方面示出了，mTORi-HDL驯化免疫纳米免疫疗法，与T细胞的CD40活化(非驯化免疫)结合，作为协同疗法，促进器官移植物的接受。

图30是在耗竭CD11c+细胞后和在CCR2缺陷型受体小鼠中，移植物存活的线状图(n＝5只小鼠/组，Kaplan-Meier，**P＜0.0l)。图30在一方面示出了，mTORi-HDL驯化免疫纳米免疫疗法，与T细胞的CD40活化(非驯化免疫)结合，作为协同疗法，促进器官移植物的接受。

图31是在接受或不接受TRAF6i-HDL纳米免疫疗法的情况下，体内接受激动刺激性CD40mAb的，mTORi-HDL治疗的受体的移植物存活的线状图(n＝5只小鼠/组，Kaplan-Meier，**P＜0.0l)。图31在一方面示出了，mTORi-HDL驯化免疫纳米免疫疗法，与T细胞的CD40活化(非驯化免疫)结合，作为协同疗法，促进器官移植物的接受。

图32是接受安慰剂、媒介物HDL、mTORi-HDL、TRAF6i-HDL和mTORi-HDL/TRAF6i-HDL治疗的受体的移植物存活的线状图(n＝7～8只小鼠/组，Kaplan-Meier，**P＜0.0l)。图32一方面示出了，mTORi-HDL驯化免疫纳米免疫疗法，和T细胞的CD40活化(非驯化免疫)结合，作为协同疗法，促进器官移植物的接受。

图33是在移植后第100天，来自接受mTORi-HDL/TRAF6i-HDL治疗的受体的心脏同种异体移植物的两幅免疫组织化学图像(n＝5只小鼠/组；放大倍数×200)。图33在一方面示出了，mTORi-HDL驯化免疫纳米免疫疗法，和T细胞的CD40活化(非驯化免疫)结合，作为协同疗法，促进器官移植物的接受。

图34是在移植后第6天，来自未经治疗的排斥受体的移植物浸润和骨髓单核细胞的染色质免疫沉淀测定(ChIP)的四副柱状图系列。进行了ChIP，以评估组蛋白H3K4的三甲基化。通过qPCR，检验了四个驯化免疫相关基因的丰度(n＝3，Wilcoxon符号秩检验，**P＜0.0l。来自1次实验)。图34在一方面示出了mTORi-HDL的发展，以及其体内分布。

图35是mTOR抑制剂(mTORi)雷帕霉素化学结构的示意图。

图36是mTORi-HDL纳米生物制剂的盘状形态的透射电子显微图像。

图37是mTORi-HDL在C57/B16野生型小鼠中的生物分布的平面柱状示意图。用PBS对照(第一行器官)或DiR标记的mTORi-HDL注射器官的代表性近红外荧光图像(NIRF)，示出了在肝脏、脾脏、肺、肾脏、心脏和肌肉中的积累。图37在一方面示出了，mTORi-HDL的发展，以及其体内分布。

图38是柱形图，其中柱子表示每个器官中对照与mTORi-HDL-DiR积累的比例，通过在对照和mTORi-HDL-DiR组中，将每个器官的总信号相除来计算(n＝4只小鼠/组。结果来自3次实验)。图38在一方面示出了mTORi-HDL的发展，以及其体内分布。

图39是柱形图，其中PET量化的摄取值根据在移植的心脏、肾脏、肝脏和脾脏的平均％ID/g(n＝3只小鼠。结果来自3次实验)。图39在一方面示出了mTORi-HDL的发展，以及其体内分布。

图40是用于区分血液、脾脏和移植心脏中的髓系细胞的流式细胞术门控策略的二十一幅示意图。灰色直方图示出了，与对照(黑色直方图)相比，用DiO标记的mTORi-HDL注射的小鼠的免疫细胞分布。图40在一方面示出了mTORi-HDL的体内细胞靶向。

图41是在血液和脾脏中，嗜中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞、Ly-6C lo和Ly-6Chi单核细胞/巨噬细胞、树突状细胞和T细胞的平均荧光强度(MFI)的两幅柱形示意图(n＝4只小鼠/组，单因素ANOVA，*P＜0.05；**P＜0.0l。结果来自3次实验)。图41在一方面示出了mTORi-HDL的体内细胞靶向。

图42是具有九副示意图的，用以区分血液、脾脏和移植心脏中T细胞的流式细胞术门控策略的三幅示意图。灰色直方图(右)示出了，与对照动物中的分布(黑色直方图)相比，注射了DiO标记的mTORi-HDL的小鼠中的T细胞分布。图42在一方面示出了mTORi-HDL的体内细胞靶向。

图43是在血液和移植心脏中，单核细胞/巨噬细胞、CD3+T、CD4+T和CD8+T细胞的平均荧光强度(MFI)的三幅示意图(n＝4小鼠/组，单因素ANOVA，**P＜0.01。结果来自3次实验)。图43在一方面示出了mTORi-HDL的体内细胞靶向。

图44是在移植后第6天，从接受安慰剂、口服雷帕霉素(5mg/kg)和mTORi-HDL治疗(5mg/kg)的同种异体受体的同种异体移植物、血液和脾脏中回收的细胞悬浮液的流式细胞分析的十二幅示意图。示出了白细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞(MΦ)和树突状细胞(DC)的总数(n＝4只小鼠/组，单因素ANOVA，*P＜0.05；**P＜0.0l。结果来自3次实验)。图44在一方面示出了在体内，mTORi-HDL重新平衡了髓系细胞和Treg细胞区室。

图45是来自安慰剂、口服雷帕霉素(5mg/kg)和经mTORi-HDL治疗(5mg/kg)的，同种异体移植受体的，血液、脾脏和心脏同种异体移植物中的Ly-6C

图46是来自安慰剂、口服雷帕霉素(5mg/kg)和经mTORi-HDL治疗(5mg/kg)的同种异体移植受体的，移植物浸润CD4+CD25+vs.CD4+CD25-T细胞的百分比的三幅饼状示意图(n＝4只小鼠/组，单因素ANOVA，**P＜0.0l。结果来自3次实验)。图46在一方面示出了在体内，mTORi-HDL重新平衡了髓系细胞和Treg细胞区室。

图47是TRAF6抑制剂化学结构的示意图，其是与驯化免疫纳米免疫疗法进行协同结合治疗的非驯化免疫部分。

图48是示出了TRAF6i-HDL盘状形态的透射电子显微图像。如分别通过DLS和HPLC测定的，纳米颗粒的平均流体动力学半径为19.2±3.1nm，药物并入效率为84.6±8.6％。

图49是口服雷帕霉素、静脉内雷帕霉素和口服雷帕霉素+TRAF6i-HDL(每组n＝8只小鼠)的移植物存活率曲线图。背景示出了，图23的安慰剂、HDL媒介物、TRAF6i-HDL、mTORi-HDL和mTORi-HDL/TRAF6i-HDL结合治疗形式的移植物存活曲线。图49在一方面示出了，mTORi-HDL和TRAF6i-HDL纳米生物制剂的组合治疗效果。

图50是在移植后第100天收集的，接受mTORi/TRAF6i-HDL治疗的移植受体的苏木精/曙红(H&E)、高碘酸希夫(PAS)和马森三色(Masson Trichrome)的代表性肾脏和肝脏的免疫组织化学图像的六副示意图。肾脏在肾实质的三个区室中没有显示出明显的变化。肾小球看起来是正常的，没有肾小球硬化的迹象。肾小管无明显萎缩，或上皮细胞损伤(包括空泡化、刷缘缺失或有丝分裂)的任何迹象。肝具有正常的腺泡和小叶结构。没有迹象表明门脉和肝实质有炎症或纤维化。肝细胞正常，无胆汁淤积、内含物或细胞凋亡的迹象(n＝4只小鼠；放大倍数×200)。图50在一方面示出了，mTORi-HDL和TRAF6i-HDL纳米生物制剂的组合治疗效果。

图51是与mTORi-HDL治疗相关的毒性的一对柱状示意图。受体小鼠接受了mTORi-HDL治疗方案(移植后第0天、第2天和第5天，5mg/kg)或口服治疗剂量的雷帕霉素(每天5mg/kg，持续15天)，以达到相同的治疗效果(30天，100％的同种异体移植物存活)。mTORi-HDL对血尿素氮(BUN)或血清肌酐无明显影响，但肾脏毒性参数示出了口服雷帕霉素和mTORi-HDL之间存在统计学差异。没有观察到同基因和mTORi-HDL受体之间的差异(n＝4只小鼠/组，单因素ANOVA，*P＜0.05；**P＜0.0l。结果来自3次实验)。图51在一方面示出了，mTORi-HDL和TRAF6i-HDL纳米生物制剂的组合治疗效果。

动脉粥样硬化

图52是mTORi-HDL的不同组分的示意图，其中mTORi-HDL是通过组合人类载脂蛋白A-I(apoA-I)、磷脂DMPC和MHPC，以及mTOR抑制剂雷帕霉素构建的。图52在一方面示出了mTORi-HDL靶向动脉粥样硬化斑块，并积累在巨噬细胞和炎性Ly6

图53是注射了PBS(对照)或DiR标记的mTORi-HDL的Apoe-/-小鼠的整个主动脉的IVIS成像的三幅示意图。注射后24小时获取主动脉。

图54是整个主动脉中的CD45+细胞的流式细胞术门控策略的九幅示意图。每种细胞类型中，Lin+细胞、巨噬细胞和Ly6Chi单核细胞的识别(上)、代表性直方图(中)和DiO信号的量化(下)。注射DiO标记的mTORi-HDL后，24小时获取主动脉。图54在一方面示出了，mTORi-HDL靶向动脉粥样硬化斑块，并积累在巨噬细胞和炎性Ly6

图55是对照组与mTORi-HDL进行比较的六副组织学图像和两副饼状图的示意图。

图56右是对照与mTORi-HDL进行比较，斑块面积、胶原蛋白含量、Mac3阳性面积以及Mac3与胶原蛋白比率的四幅示意图。图55-56在一方面示出了mTORi-HDL动脉粥样硬化斑块炎症。Apoe-/-小鼠接受高胆固醇饮食12周，然后进行1周治疗，同时保持高胆固醇饮食。

图57是使用X射线计算机断层扫描成像的一对并排荧光分子断层扫描图，示出在mTORi-HDL治疗的小鼠vs对照小鼠vs.mTORi-HDL小鼠中，主动脉根中的蛋白酶活性降低，示出了显著降低。

图58是蛋白酶活性的图。

图59是S6Kli-HDL纳米生物制剂的不同组分的示意图，其中S6Kli-HDL纳米生物制剂是通过结合人类载脂蛋白A-I(apoA-I)、磷脂POPC和PHPC，以及S6K1抑制剂PF-4708671构建的。

图60是注射了DiR标记的S6Kli-HDL的Apoe-/-小鼠的器官的IVIS成像示意图。在注射后24小时获取器官。

图61是在静脉内注射DiO标记的S6Kli-HDL后，主动脉斑块中不同白细胞亚群的DiO信号量化的五幅示意图(每组n＝2～4)。

图62是在整个主动脉中的巨噬细胞和Ly6C(hi)单核细胞量化，并比较了对照、仅rHDL、mTORi-HDL和S6Kli-HDL治疗的一对图。Apoe-/-小鼠接受高胆固醇饮食12周，然后进行1周治疗，同时保持高胆固醇饮食。

图63示出了人类贴壁单核细胞的体外分析，其中通过oxLDL诱导驯化免疫，当细胞在五天后用LPS再刺激时，导致TNFα细胞因子产生增加。通过mTORi-HDL和S6Kli-HDL(n＝6)减轻了这种应答。图63是对比仅RPMI vs.mTORi-HDL，以及仅RPMI vs.S6Kli-HDL，RPMI和oxLDL损伤的TNFα水平(pg/mL)的一对图。

图64是通过尺寸随时间变化的前药各种配制物的示意图。

图65是前药尺寸随时间变化的示意图。

图66是各种前药随时间的平均分散度的示意图。

图67是各种前药的药物回收百分比的示意图。

图68是各种前药的水解百分比的示意图。

图69是各种前药的apoA-I回收百分比的示意图。

图70是各种前药的ζ电位的示意图。

图71是在并入脂肪vs.胆固醇基质中的药物(丙二酸酯)分数的示意图。

图72是在并入脂肪vs.胆固醇基质中的药物(JQ1)分数的示意图。

图73是仅药物(GSK-J4)vs.并入脂肪vs.胆固醇基质中的分数的示意图。

图74是仅药物(雷帕霉素)vs.并入脂肪族中的分数的示意图。

图75是随时间推移并入的药物(PF-4708671S6Kli)分数的示意图。

图76是放射性同位素标记过程的示意图。

图77是通过纳米生物制剂递送的放射性同位素进行PET成像的示意图，示出了纳米生物制剂在小鼠、兔、猴和猪模型的骨髓和脾脏中的积累。

具体实施方式

本发明涉及用于抑制驯化免疫的纳米生物组合物，制备这种纳米生物制剂的方法，将药物并入所述纳米生物制剂中的方法，药物与官能化连接基团(例如磷脂、脂肪族链和固醇)结合的前药配制物。

作为抵抗组织损伤的防御机制，通过先天性免疫细胞触发炎症。一种古老的免疫记忆机制，称为驯化免疫，也称为先天性免疫记忆，定义为：在经髓系先天免疫细胞的继发性刺激进行再刺激后的，长期升高的反应性(例如，细胞因子的高产生)，这是通过骨髓、血液和/或脾脏中的刺激这些细胞或其祖细胞和干细胞的原发性损伤所诱导，并通过表观遗传、代谢和转录重排所介导。

驯化免疫，被定义为继发性长期高反应性，表现为，通过代谢和表观遗传重排引起的细胞因子分泌增加，以在骨髓、血液和/或脾脏中的髓系细胞、髓系祖细胞和造血干细胞发生原发性损伤后进行再刺激。

在一个优选的实施方式中，本发明涉及一种髓系细胞特异性的纳米免疫疗法，其基于递送携带或具有并入的mTOR抑制剂雷帕霉素(mTORi-HDL)的纳米生物制剂，防止导致驯化免疫的表观遗传和代谢改变。本发明涉及治疗性纳米生物组合物和治疗方法，用于通过抑制驯化免疫，来治疗已经进行了器官移植的患者，或患有动脉粥样硬化、关节炎、炎症性肠病(包括克罗恩氏症)、自身免疫性疾病(包括糖尿病)和/或自发性炎症症状的患者，或处于心血管事件(包括中风和心肌梗塞)后的患者；其中，驯化免疫是，原发性损伤引起的骨髓、脾脏和血液中的髓系细胞及其干细胞和祖细胞的代谢和表观遗传重排所导致的，长期升高的反应性，其特征是经一种或多种继发性刺激进行再刺激后，细胞因子分泌增加。

纳米生物(制剂)

术语“纳米生物(制剂)”是指用于抑制驯化免疫的组合物，包括：纳米级组装物，和

(ii)并入所述纳米级组装物中的抑制剂药物，

其中所述纳米级组装物是多组分载体组合物，包括：

(a)磷脂或磷脂混合物，

(b)载脂蛋白A-I(apoA-I)或apoA-I的肽模拟物，

可选地包括(c)由一种或多种甘油三酸酯、脂肪酸酯、疏水性聚合物和甾醇酯构成的疏水性基质，以及

可选地还包括(d)胆固醇，

其中所述纳米生物制剂，在水性环境中，是尺寸为直径在约8nm至400nm之间的自组装的纳米盘或纳米球；

其中所述抑制剂药物是亲水性药物的前药或疏水性药物，衍生有附接的脂肪族链或胆固醇或磷脂，

其中所述药物是炎症小体的抑制剂，或造血干细胞(HSC)、普通髓系祖细胞(CMP)或髓系细胞内的代谢途径或表观遗传途径的抑制剂。

为了进行概念验证，并入HDL中的mTOR抑制剂(mTORi-HDL)，或并入HDL中的S6K1抑制剂(S6Kli-HDL)，发挥纳米生物制剂的作用，用于产生本文的数据。

纳米级组装物

术语“纳米级组装物”(NA)是指，用于运载活性有效载荷(例如药物)的多组分载体组合物。

在一个优选的实施方式中，纳米级组装物包括用于运载活性有效载荷的多组分载体组合物，其中活性有效载荷具有子组分：(a)磷脂，和(b)载脂蛋白A-I(apoA-I)，或apoA-I的肽模拟物。

在另一个优选的实施方式中，“纳米级组装物”(NA)是指一种多组分载体组合物，用于运载抑制驯化免疫的活性有效载荷，例如药物，具有以下子成分：(a)磷脂；(b)载脂蛋白A-I(apoA-I)或apoA-1的肽模拟物；以及，(c)疏水性基质，包括一种或多种甘油三酸酯、脂肪酸酯、疏水性聚合物和甾醇酯。

在另一个优选的实施方式中，“纳米级组装物”(NA)是指一种多组分载体组合物，用于携带抑制驯化免疫的活性有效载荷，例如药物，具有以下子成分：(a)磷脂；(b)载脂蛋白A-I(apoA-I)或apoA-I的肽模拟物；(c)疏水性基质，包括一种或多种甘油三酸酯、脂肪酸酯、疏水性聚合物和甾醇酯；以及，(d)胆固醇。

磷脂

术语“磷脂”是指由两个疏水性脂肪酸“尾”和亲水性“头”组成的两亲性化合物，其中亲水性“头”由磷酸基团构成。两种成分通过甘油分子连接在一起。磷酸基团可以经简单的有机分子如胆碱、乙醇胺或丝氨酸修饰。

胆碱是指，具有化学式R-(CH

合适的磷脂的实例包括，但不限于，磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、鞘磷脂或其他神经酰胺，以及含磷脂的油，例如卵磷脂油。可以使用磷脂的组合，或磷脂与其他物质的混合物。

可用于本发明组合物中的磷脂的非限制性实例，包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酸/酯(PA)，以及溶血磷脂酰胆碱。

具体的实例包括:DDPC CAS-3436-44-0l,2-十二烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、DEPA-NA CAS-80724-31-8l,2-二十二烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(钠盐)、DEPC CAS-56649-39-9l,2-二十二烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、DEPE CAS-988-07-2l,2-二十二烷基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、DEPG-NA 1,2-二十二烷基-sn-甘油-3[磷酸-rac-(1-甘油...)(钠盐)、DLOPC CAS-998-06-1 1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、DLPA-NA 1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸(钠盐)、DLPC CAS-18194-25-7l,2-二氮酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、DLPE1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、DLPG-NA 1,2-二月桂酰-sn-甘油-3[磷酸-rac-(1-甘油...)(钠盐)、DLPG-NH4 1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3[磷酸-rac-(1-甘油...)(铵盐)、DLPS-NA l,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸(钠盐)，DMPA-NA CAS-80724-3l,2-二豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸(钠盐)、DMPC CAS-18194-24-6l,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、DMPE CAS-988-07-2l,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、DMPG-NACAS-67232-80-8l,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3[磷酸-rac-(l-甘油...)(钠盐)、DMPG-NH41,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3[磷酸-rac-(1-甘油...)(铵盐)、DMPG-NH4/NA l,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3[磷酸-rac-(1-甘油...)(钠/铵盐)、DMPS-NA l,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸(钠盐)、DOPA-NA l,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸(钠盐)、DOPC CAS-4235-95-4l,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、DOPE CAS-4004-5-1l,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、DOPG-NA CAS-62700-69-0 1,2-二油酰基-sn-甘油-3[磷酸-rac-(1-甘油...)(钠盐)、DOPS-NA CAS-70614-14-1l,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸(钠盐)、DPPA-NA CAS-71065-87-7 1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸酯(钠盐)、DPPC CAS-63-89-81,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、DPPE CAS-923-61-5 1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、DPPG-NA CAS-67232-81-9 1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3[磷酸-rac-(1-甘油...)(钠盐)、DPPG-NH4CAS-73548-70-6 1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3[磷酸-rac-(1-甘油...)(铵盐)、DPPS-NA 1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸(钠盐)、DSPA-NA CAS-108321-18-21,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸(钠盐)、DSPC CAS-816-94-4l,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、DSPE CAS-1069-79-0l,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、DSPG-NA CAS-67232-82-0l,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3[磷酸-rac-(1-甘油...)(钠盐)、DSPG-NH4 CAS-108347-80-4l,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3[磷酸-rac-(1-甘油...)(铵盐)、DSPS-NA l,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸(钠盐)、EPC卵-PC、HEPC氢化卵PC、HSPC氢化大豆PC、LYSOPC MYRISTIC CAS-18194-24-6l-肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、LYSOPC PALMITICCAS-17364-16-8l-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、LYSOPC STEARIC CAS-19420-57-6 1-硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、牛奶鞘磷脂、MPPC 1-肉豆蔻酰-2-棕榈油酰基-sn-甘油3-磷酸胆碱、MSPC 1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰-sn-甘油3-磷酸胆碱、PMPC 1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、POPC CAS-26853-31-6l-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、POPE 1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、POPG-NA CAS-81490-05-31-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3[磷酸-rac-(l-甘油)...](钠盐)、PSPC 1-棕榈酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、SMPC 1-硬脂酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、SOPC 1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、SPPC 1-硬脂酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱。

在一些优选的实施方式中，磷脂的具体非限制性的实例包括：二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、大豆卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、二烯丙基磷脂酰甘油基二磷脂酰胆碱(DOPC)、二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰基磷脂酰甘油(DSPG)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二豆蔻酰基磷脂酸(DMPA)、二豆蔻酰基磷脂酸(DMPA)、二棕榈酰基磷酸磷脂酸(DPPA)、二棕榈酰基磷酸磷脂酸(DPPA)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)、二棕榈酰鞘磷脂(DPSP)、二硬脂酰鞘磷脂(DSSP)，及其混合物。

在某些实施方式中，当本发明的组合物包括(基本上由以下成分组成，或由以下成分组成)两种或更多种磷脂时，两种磷脂的重量比范围可以为约1:10至约10:1，约2:1至约4:1，约1:1至约5:1，约2:1至约5:1，约6:1至约10:1，约7:1至约10:1，约8:1至约10:1，约7:1至约9:1，或约8:1至约9:1。例如，两种磷脂的重量比可以为约1:10、约1:9、约1:8、约1:7、约1:6、约1:5、约1:4、约1:3、约1:2、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1，或约10:1。

在一个实施方式中，本发明的纳米级组装物的(a)磷脂包括(基本上由以下成分组成，或由以下成分组成组成)双链二酰基磷脂和单链酰基磷脂/溶血脂(lysolipid)的混合物。

在一个实施方式中，(a)磷脂是磷脂和溶血脂的混合物，是(DMPC)和(MHPC)。

DMPC与MHPC的重量比的范围可以为约1:10至约10:1，约2:1至约4:1，约1:1至约5:1，约2:1至约5:1，约6:1至约10:1，约7:1到约10:1，约8:1至约10:1，约7:1至约9:1，或约8:1至约9:1。DMPC与MHPC的重量比可以为约1:10、约1:9、约1:8、约1:7、约1:6、约1:5、约1:4、约1:3、约1:2、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1或约10:1。

在一个实施方式中，(a)磷脂是磷脂和溶血脂的混合物，是(POPC)和(PHPC)。

POPC与PHPC的重量比的范围可以为约1:10至约10:1，约2:1至约4:1，约1:1至约5:1，约2:1至约5:1，约6:1至约10:1，约7:1至约10:1，约8:1至约10:1，约7:1至约9:1，或约8:1至约9:1。DMPC与MHPC的重量比可以为约1:10、约1:9、约1:8、约1:7、约1:6、约1:5、约1:4、约1:3、约1:2、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1或约10:1。

应当注意的是，链长范围在C4至C30，饱和或不饱和，顺式或反式，未取代或被1～6个侧链取代，以及添加或未添加溶血脂的所有磷脂，都预期用于本文所述的纳米级组装物或纳米颗粒/纳米生物制剂中。

另外，还考虑了其他合成变体和具有其他磷脂头基的变体。

溶血脂

本文所用的术语“溶血脂”包括(酰基，单链)，例如在非限制性的实施方式中，1-肉豆蔻酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(MHPC)、1-棕榈酰基-2-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PHPC)和1-硬脂酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(SHPC)。

载脂蛋白A-I(apoA-I)(apoA1)

术语“载脂蛋白A-I”或“apoA-I”，以及“载脂蛋白A1”或“apoA1”，是指由人类的APOA1基因编码的蛋白质，并且如本文所用，还包括apoA-I的肽模拟物。载脂蛋白A1(apoA-I)是纳米级组装物中的子组分(b)。

疏水性基质

术语“疏水性基质”是指纳米生物制剂的核心或填料或结构修饰物。结构修饰包括(1)使用疏水性基质，来增加或设计仅由(a)磷脂和(b)apoA-I制成的纳米级组装物的粒径，(2)增大或减小(设计)纳米级组装物颗粒的尺寸和/或形状，(3)增加或减少(设计)纳米级组装物颗粒的疏水核，(4)增加或减少(设计)纳米生物制剂的并入疏水药物的能力，和/或混溶性，以及(5)增加或减少纳米级组装物颗粒的生物分布的特性。

纳米级组装物的粒径、刚度、粘度和/或生物分布，可通过添加的疏水分子的数量和类型来调节。在非限制性的实施例中，仅由(a)磷脂和(b)apoA-I制成的纳米级组装物的直径可为10nm～50nm。添加(c)疏水性基质分子，例如甘油三酸酯，将纳米级组装物从最小的10nm膨胀至至少30nm。在本发明的范围内，添加更多的甘油三酸酯，可以将纳米级组装物的直径增加到至少50nm、至少75nm、至少100nm、至少150nm、至少200nm、至少300nm，并且直至400nm。

生产方法可以通过非过滤，或通过制备一系列不同尺寸的纳米级组装物颗粒，并在后期生产步骤中将它们重新结合，来制备尺寸均匀的纳米级组装物颗粒，或尺寸不均匀的纳米级组装物颗粒混合物。纳米级组装物颗粒的尺寸越大，可以并入的药物越多。但是，较大的尺寸例如＞120nm，可限制、防止或减慢纳米级组装物颗粒扩散到所治疗患者的组织中。较小的纳米级组装物颗粒，虽然每个颗粒容纳的药物并不多，但是能够进入受驯化免疫影响的骨髓、血液或脾脏或其他局部组织，例如移植物和周围组织，动脉粥样硬化斑块等(生物分布)。在单次给药或方案中，使用尺寸不均匀的纳米颗粒混合物，可立即降低先天免疫高反应性，同时产生持久的、长期的先天免疫高反应性的降低，其会持续数天、数周、数月和数年，其中纳米生物制剂已经逆转、修饰或重新调节了造血干细胞(HSC)、普通髓系祖细胞(CMP)和髓系细胞(例如单核细胞，巨噬细胞和其他短寿命循环细胞)的代谢、表观遗传和炎症小体途径。

添加其他(c)疏水性基质分子，例如胆固醇、脂肪酸酯、疏水性聚合物、甾醇酯，和不同类型的甘油三酸酯，或它们的特定混合物，可以进一步设计纳米级组装物颗粒，以强调用于特定目的的特定所需特性。尺寸、刚度和粘度会影响装载和生物分布。

通过非限制性实施例，最大装载能力可以通过将纳米级组装物颗粒的内部体积除以药物装载球体体积来确定。

颗粒：假设100nm球形颗粒具有2.2nm～3.0nm的磷脂壁，产生94nm的内部直径，体积(L)@4/3π(r)3。

药物：假设西罗莫司(雷帕霉素)为12×12×35埃，或为圆柱体1.2×1.2×3.5nm，其中多个药物分子圆柱体，例如七个或九个等，或多个药物+疏水性基质载体(例如甘油三酯)，可以假设直径为3.5nm的球体，其半径为1.75nm，Vol(小)@4/3π(r)3。

最大装载量(计算)：在100nm颗粒内，～19,372个3.5nm球体。

生物学相关脂质包括，脂肪酰基、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、甾醇脂、烯醇脂、糖脂和聚酮。可以在https://www.lipidmaps.org上获得超过42,000种脂质的完整列表。

甘油三酸酯

“甘油三酸酯”和类似术语，指衍生自甘油和三个脂肪酸的酯。在本说明书中用于描述甘油三酸酯的符号，与以下用于描述脂肪酸的符号是相同的。甘油三酸酯可包括甘油与以下脂肪酸的任何组合：C18:l、C14:1、C16:1、多元不饱和的以及饱和的。脂肪酸可以以任何顺序连接到甘油分子上，例如，任何脂肪酸都可以与甘油分子的任何羟基反应形成酯键。C18:1脂肪酸的甘油三酸酯，简单地表示，甘油三酸酯的脂肪酸组分衍生自，或基于，C18:1脂肪酸。也就是说，C18:1甘油三酸酯是甘油与三个具有18个碳原子的脂肪酸的酯，每个脂肪酸具有一个双键。类似地，C14:1甘油三酸酯是甘油和三个具有14个碳原子的脂肪酸的酯，每个脂肪酸具有一个双键。同样地，C16:1甘油三酸酯是甘油和三个具有16个碳原子的脂肪酸的酯，每个脂肪酸具有一个双键。C18:1脂肪酸的甘油三酸酯，与C14:1和/或C16:1脂肪酸的组合，表示：(a)将C18:1甘油三酸酯，与C14:1甘油三酸酯或C16:1甘油三酸酯或两者混合；或(b)甘油三酸酯的至少一个脂肪酸成分衍生自或基于C18:1脂肪酸，而其他两个衍生自或基于C14:1脂肪酸和/或C16:1脂肪酸。

脂肪酸

“脂肪酸”和类似术语，是指具有饱和的或不饱和的长脂肪族尾的羧酸。脂肪酸可以被酯化为磷脂和甘油三酸酯。如本文所用，脂肪酸链的长度，包括C4至C30、饱和或不饱和的、顺式或反式的、未取代或被1～6个侧链取代。不饱和脂肪酸在碳原子之间具有一个或多个双键。饱和脂肪酸不包括任何双键。在本说明书中用于描述脂肪酸的符号，包括用于碳原子的大写字母“C”，之后是描述脂肪酸中碳原子数的数字，然后是冒号和另一个代表脂肪酸中双键数目的数字。例如，C16:1表示具有一个双键的含16个碳原子的脂肪酸，例如棕榈油酸。该符号中冒号后的数字，既不表示双键在脂肪酸中的位置，也不表示与双键碳原子键合的氢原子彼此之间是否是顺式的。此符号的其他实例包括C18:0(硬脂酸)、C18:1(油酸)、C18:2(亚油酸)、C18:3(α-亚麻酸)和C20:4(花生四烯酸)。

甾醇和甾醇酯

术语“甾醇”例如，但不限于胆固醇，也可以用于本文所述的方法和化合物中。甾醇是动物或植物类固醇，仅包括羟基，在C-3处无其他官能团。通常，甾醇在5/6的位置，偶尔在7/8、8/9或其他位置，含有27至30个碳原子和一个双键。除这些不饱和物质外，其他甾醇是可通过氢化获得的饱和化合物。合适的动物类固醇的一个实例是胆固醇。从应用的角度来看，优选的合适的植物甾醇的典型实例是麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、芸苔甾醇，并且优选地，是谷甾醇或谷甾烷醇，更特别地，是β-谷甾醇或β-谷甾烷醇。除提及的植物甾醇外，优选地使用它们的酯。酯的酸成分可以回到与式(I)相对应的羧酸：

R1CO-OH (I)

其中R1CO是脂肪族的、直链或支链酰基，含2至30个碳原子，0和/或1、2或3个双键。典型的实例是乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、辛酸、2-乙基己酸、癸酸、月桂酸、异十三烷酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、异硬脂酸、油酸、亚麻酸、岩藻酸、亚油酸、共轭亚油酸(CLA)、亚麻酸、弹性体添加物、花生酸、鳕油酸、山嵛酸和芥酸。

疏水性聚合物

用于构成基质的一种或多种疏水性聚合物，可以选自由批准用于人类的聚合物(即生物相容的和FDA批准的)组成的组。

此类聚合物包括，但不限于以下聚合物、此类聚合物的衍生物、共聚物、嵌段共聚物、支链聚合物和聚合物共混物：聚烯化羧酸酯、聚酸酐、聚(天冬氨酸)、聚酰胺、聚琥珀酸丁二醇酯(PBS)、聚丁二酸丁二酯-共聚-己二酸丁二酯(PBSA)、聚(ε-己内酯)(PCL)、聚碳酸酯(包括聚碳酸亚烷基酯(PC))、聚酯(包括脂肪族聚酯和聚酯酰胺)、聚琥珀酸乙烯酯(PES)、聚乙交酯(PGA)、聚亚胺和聚烷基亚胺(PI，PAI)、聚丙交酯(PLA、PLLA、PDLLA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚(l-赖氨酸)、聚甲基丙烯酸酯、多肽、聚原酸酯、聚-p-二噁烷酮(PPDO)、(疏水性)改性多糖、聚硅氧烷和聚烷基硅氧烷、聚脲、聚氨酯和聚乙烯醇。

可生物水解

如本文所用，除非另有说明，否则术语“可生物水解的酰胺”、“可生物水解的酯”、“可生物水解的氨基甲酸酯”、“可生物水解的碳酸酯”、“可生物水解的酰脲”、“可生物水解的磷酸酯”是分别指化合物的酰胺、酯、氨基甲酸酯、碳酸酯(carbonate)、酰脲或磷酸盐，其中：1)不干扰化合物的生物活性，但可以赋予该化合物在体内的有利特性，例如摄取、作用持续时间，或作用开始；或者，2)具有生物惰性，但在体内转化为生物活性化合物。可生物水解的酯的实例包括，但不限于，低级烷基酯、低级酰氧基烷基酯(例如乙酰氧基甲基酯、乙酰氧基乙基酯、氨基羰基氧基甲基酯、新戊酰氧基甲基酯和新戊酰氧基乙基酯)、内酯基酯(例如邻苯二甲酰酯和硫代邻苯二甲酰酯)、低级烷氧基酰氧基烷基酯(例如甲氧基羰基-氧基甲基酯、乙氧基羰基氧基乙基酯和异丙氧基羰基氧基乙基酯)、烷氧基烷基酯、胆碱酯和酰氨基烷基酯(例如乙酰氨基甲基酯)。可生物水解的酰胺的实例包括，但不限于，低级烷基酰胺、α-氨基酸酰胺、烷氧基酰基酰胺和烷基氨基烷基羰基酰胺。可生物水解的氨基甲酸酯的实例包括，但不限于，低级烷基胺、经取代的乙二胺、氨基酸、羟烷基胺、杂环和杂芳族胺，以及聚醚胺。

方法如下所述，并且存在与这些方法有关的变体。

方法1-薄膜

将磷脂、(前)药和可选的甘油三酸酯或聚合物溶解(通常溶于氯仿、乙醇或乙腈中)。然后将该溶液在真空下蒸发，以形成多组分膜。随后，添加缓冲溶液，以使薄膜水合并产生囊泡悬浮液。

将磷脂、(前)药和可选的甘油三酸酯或聚合物溶解(通常溶于氯仿、乙醇或乙腈中)。在搅拌下，将该溶液注入(或滴加)到温和加热的缓冲溶液中，直到有机溶剂完全蒸发，从而形成囊泡悬浮液。

向用A或B产生的囊泡悬浮液中，添加载脂蛋白A-I(apoA-I)(注意apoA-I也可以已经存在于B中)-使用滴加以避免变性，并使用尖端超声仪将所得混合物超声处理30分钟，同时使用外部冰水浴彻底冷却。将获得的包括纳米生物制剂和其他副产物的溶液，转移到赛多利斯(Sartorius Vivaspin)管中，其具有取决于纳米生物制剂的评估尺寸的截留分子量(通常，使用截留值为10.000～100.000kDa的Vivaspin管)。将管离心，直至～90％的溶剂体积通过了过滤器。随后，添加一定体积的缓冲液(大约等于剩余溶液的体积)，并再次旋转管，直到大约一半的体积通过过滤器。重复两次，然后将剩余溶液通过聚醚砜0.22μm的注射式过滤器，得到最终的纳米生物制剂溶液。

方法2-微流体

在另一种方法中，将磷脂、(前)药，和可选的甘油三酸酯、胆固醇、甾醇酯或聚合物溶解(通常溶于乙醇或乙腈中)，并装载到注射器中。另外，将载脂蛋白A-I(apoA-I)的磷酸盐缓冲盐水溶液，装载到第二注射器中。使用微流体泵，使用微涡旋平台混合两个注射器的内容物。将获得的含纳米生物制剂和其他副产物的溶液，转移到Sartorius Vivaspin管中，其中Sartorius Vivaspin管具有取决于纳米生物制剂的评估尺寸的截留分子量(通常，使用截留值为10.000-100.000kDa的Vivaspin管)。将管离心，直至～90％的溶剂体积通过了过滤器。随后，添加一定体积的磷酸盐缓冲盐水(大约等于剩余溶液的体积)，并再次旋转试管直到大约一半的体积通过了过滤器。重复两次，然后将剩余溶液通过聚醚砜0.22μm的注射式过滤器，得到最终的纳米生物制剂溶液。

方法3-微流化器

在根据本发明的另一优选的方法中，微流化器技术用于制备纳米级组装物和最终的纳米生物组合物。

微流化器是用于基于淹没射流原理，制备小粒径材料的设备。在操作微流化器以获得纳米颗粒时，高压泵迫使预混合物流通过所谓的相互作用腔室，所述相互作用腔室由陶瓷块中的通道系统组成，其中陶瓷块将预混合物分成两股流体。在微流化过程中，在相互作用腔室内产生受到精确控制的剪切力、湍流力和空化力。两股流体高速重组，以产生剪切力。如此获得的产物可以再循环到微流化器中，以获得越来越小的颗粒。

微流化相对于传统研磨工艺的优势，包括可大大减少最终产品的污染，并易于扩大生产规模。

微流化器实施例1-1L

纳米级组装物和雷帕霉素纳米生物制剂的形成

本实施例证明了包括雷帕霉素和纳米级组装物的药物组合物的制备，其中雷帕霉素在纳米级组装物/乳液中的浓度为4～8mg/mL，并且配制物以1L规模进行制备。

雷帕霉素(7200mg)溶于36mL的氯仿/叔丁醇中。然后将溶液添加到900mL纳米级组装物溶液(3％w/v)中，其中纳米级组装物溶液包括POPC/PHPC磷脂、apoA-I、三辛精和胆固醇的混合物。混合物在10,000～15,000rpm(Vitris均质机，型号Tempest I.Q.)下均质5分钟以形成粗乳液，然后转移到高压均质机中。乳化在20,000psi下进行，同时使乳液再循环。将得到的系统转移到旋蒸仪(Rotavap)中，并在减压下(25mm Hg)，40℃，快速除去溶剂。所得分散体是半透明的。分散体通过多个过滤器连续过滤。经过滤的配制物的尺寸为8～400nm。

微流化器实施例2-5L

纳米级组装物和雷帕霉素纳米生物制剂的形成

本实施例证明了包括雷帕霉素和纳米级组装物的药物组合物的制备，并且配制物以5L规模进行制备。

雷帕霉素溶解在氯仿/叔丁醇中。然后将溶液添加到纳米级组装物溶液(1～5％w/v)中，其中纳米级组装物溶液包括POPC/PHPC磷脂的混合物、apoA-I的肽模拟物、C16-C20甘油三酸酯的混合物、胆固醇与一种或多种甾醇酯的混合物，和疏水聚合物。将混合物在10,000～15,000rpm(Vitris均质机，型号Tempest I.Q.)下均质5分钟，以形成粗乳液，然后转移至高压均质机中。乳化在20,000psi下进行，同时使乳液再循环。将得到的系统转移到Rotavap中，并且在减压下(25mm Hg)，40℃，迅速除去溶剂。所得分散体是半透明的。分散体通过多个过滤器连续过滤。经过滤的配制物的尺寸为35～100nm。

微流化器实施例3-冻干

如以上实施例中的任一个那样形成纳米生物制剂。将分散体进一步冻干(FTS系统，Dura-DryμP，Stone Ridge，纽约)60小时。通过添加无菌水或0.9％(w/v)无菌盐水，可以很容易地将所得到的冻干饼重构为原始分散体。重构后的粒径与冻干前的粒径相同。

如本文所用，除非另有说明，否则术语“前药”是指化合物的衍生物，其可以在生物学条件下(体外或体内)水解、氧化，或以其他方式反应，以提供该化合物。前药的实例包括，但不限于，本发明的纳米生物组合物的衍生物，其包括可生物水解的部分，例如可生物水解的酰胺、可生物水解的酯、可生物水解的醚、可生物水解的氨基甲酸酯、可生物水解的碳酸酯、可生物水解的酰脲和可生物水解的磷酸盐类似物。前药的其他实例包括不可生物水解的部分，其提供稳定性和功能性。前药的其他实例包括本发明的纳米生物组合物的衍生物，包含-NO、-NO

使用以下描述的策略，可以提高药物与纳米生物制剂的相容性。药物与疏水部分，例如胆固醇共价偶联。如果需要，前药方式可以通过易分解的缀合来实现，产生例如可酶促裂解的前药。

随后，将衍生的药物并入用于体内药物递送的、基于脂质的纳米生物制剂中。药物衍生化的主要目的是形成与母体药物相比，疏水性更高的药物缀合物。结果，与母体药物相比，药物缀合物在纳米生物制剂内的保留得到增强，从而减少了渗漏，并改善了向靶组织的递送。在前药策略的情况下，不同类型的疏水性部分可能引起不同的体内裂解速率，从而影响活性药物的生成速率，因而影响纳米生物制剂-药物构建体的总体治疗效果。

其中，脂类、甾醇、聚合物和脂肪族侧链可用作疏水部分。根据这些方法，已经合成了具有碳链以增加疏水性的mTORi HDL纳米生物制剂的最佳衍生化。另外，在另外的实施方式中，在HDL中包括甘油三酸酯产生了更大、更易混溶的疏水核，用于装载活性剂，例如mTOR抑制剂。

在本发明的方法和组合物中，纳米生物制剂组合物可以与其他药理活性化合物(“第二活性剂”)组合。据信，某些组合在治疗特定类型的移植、动脉粥样硬化、关节炎、炎性肠病，以及与不期望的自身免疫活性有关，或以其为特征的一些疾病和病症中，具有协同作用。

纳米生物制剂组合物也可用于，减轻与某些第二活性剂相关的不利影响，并且某些第二活性剂可用于减轻与纳米生物制剂组合物相关的不利影响。

小分子二级试剂

可以与本发明的纳米生物制剂药物联合治疗的小分子药物包括，泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、地塞米松、倍他米松、乙酰水杨酸、苯基丁氮酮、吲哚美辛、二氟乙醛、柳氮磺吡啶、对乙酰氨基酚、甲芬那酸、甲苯芬酸钠、氟苯丙酸、布洛芬、萘普生、非诺洛芬、酮洛芬、氟比洛芬、奥沙普嗪、吡罗昔康、替诺昔康、水杨酸酯、尼美舒利、塞来昔布、罗非昔布、伐地昔布、罗美昔布、帕瑞昔布、依托昔布、甲氨蝶呤、来氟米特、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、环磷酰胺、抗疟药羟氯喹，和氯喹、d-青霉胺，和环孢霉素。

剂量

剂量范围通常为，每天5μg至100mg/kg受体(哺乳动物)体重，更通常为每天5μg至10mg/kg体重。该量可以每天单次剂量，或更通常以每天多次(例如二、三、四、五或六次)亚剂量进行给药，以使每日总剂量相同。可以将其盐或溶剂化物的有效量，确定为纳米生物制剂化合物的有效量的一定比例，其中纳米生物制剂包括抑制剂，抑制剂或其药物上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药，使用纳米级组装物(IMPEPi-NA)配制为纳米生物制剂。在另一个优选的实施方式中，所述抑制剂可以包括mTOR抑制剂(mTORi-NA)、S6K1抑制剂(S6Kli-NA)、丙二酸二乙酯(DMM)、3BP、2-DG(DMM-NA)(通常为抑制糖酵解-Gly-NA)，或喜树碱(Hif-1a)，或他克莫司+纳米级组装物。

组合疗法

用于抑制驯化免疫的本发明化合物，及它们的盐和溶剂化物，及其生理功能性衍生物，可以单独使用或与其他治疗剂组合使用，用于疾病和病症的治疗。纳米生物制剂与第二治疗剂的组合治疗，可以包括与已知的免疫遏抑化合物共同给药。示例性的免疫遏抑剂包括，但不限于，他汀类药物；mTOR抑制剂，例如雷帕霉素或雷帕霉素类似物；TGF-β信号传导剂；TGF-β受体激动剂；组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂；皮质类固醇；线粒体功能抑制剂，如鱼藤酮；P38抑制剂；NF-κβ抑制剂；腺苷受体激动剂；前列腺素E2激动剂；磷酸二酯酶抑制剂，例如磷酸二酯酶4抑制剂；蛋白酶体抑制剂；激酶抑制剂；G蛋白偶联受体激动剂；G蛋白偶联受体拮抗剂；糖皮质激素；维甲酸；细胞因子抑制剂；细胞因子受体抑制剂；细胞因子受体激活剂；过氧化物酶体增殖物激活的受体拮抗剂；过氧化物酶体增殖物激活的受体激动剂；组蛋白脱乙酰基酶抑制剂；钙调磷酸酶抑制剂；磷酸酶抑制剂和氧化的ATP。

免疫遏抑剂还包括IDO、维生素D3、环孢菌素A、芳基烃受体抑制剂、白藜芦醇、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、阿司匹林、尼氟酸、雌三醇、雷公藤甲素、白细胞介素(例如IL-1，IL-10)、环孢菌素A、siRNA靶向细胞因子，或细胞因子受体等。他汀类药物的实例包括阿托伐他汀(LIPITOR.TM，TORVAST.RTM)、西立伐他汀、氟伐他汀(LESCOL.TM，LESCOL.RTM。XL)、洛伐他汀(MEVACOR.RTM.,ALTOCOR.RTM.,ALTOPREV.RTM.)、美伐他汀(COMPACTIN.RTM.)、匹伐他汀(LIVALO.RTM.,PIAVA.RTM.)、瑞舒伐他汀(PRAVACHOL.RTM.,SELEKTINE.RTM.,LIPOSTAT.RTM.)、瑞舒伐他汀(CRESTOR.RTM.)和辛伐他汀(ZOCOR.RTM.,LIPEX.RTM.)

“可移植的移植物”是指生物材料，例如细胞、组织和器官(全部或部分)，其可施用予受试者。可移植的移植物可以是，例如生物材料，如器官、组织、皮肤、骨骼、神经、腱、神经元、血管、脂肪、角膜、多能细胞、分化细胞(在体内或体外获得或衍生)等的自体移植物、同种异体移植物或异种移植物。在一些实施方式中，可移植的移植物由例如软骨、骨、细胞外基质或胶原蛋白基质构成。可移植的移植物也可以是单个细胞、细胞悬浮液，以及组织和器官中可以移植的细胞。可移植的细胞通常具有治疗功能，例如，在受体受试者中缺乏或减弱的功能。可移植的细胞的一些非限制性实例是胰岛细胞、β细胞、肝细胞、造血干细胞、神经元干细胞、神经元、神经胶质细胞或髓鞘细胞。可移植的细胞可以是未经修饰的细胞，例如获自供体的细胞，可用于移植而无需任何遗传或表观遗传修饰。在其他实施方式中，可移植的细胞可以是经修饰的细胞，例如，从具有遗传缺陷的受试者中获得的细胞，其中遗传缺陷已得到纠正，或者是来源于重新编程细胞的细胞，例如，从受试者的细胞中获得的分化细胞。

“移植”是指，可移植的移植物转移(移动)到受体受试者中的过程(例如，从供体受试者，从体外来源(例如，分化的自体或异源天然或诱导多能细胞))，和/或从同一受试者的一个身体位置转移(移动)到另一个身体位置的过程。

在一个实施方式中，移植的组织是肺组织、心脏组织、肾脏组织、肝脏组织、视网膜组织、角膜组织、皮肤组织、胰腺组织、肠组织、生殖器组织、卵巢组织、骨组织、腱组织或血管组织。

在一个实施方式中，移植的组织作为完整的器官被移植。

如本文所用，“受体受试者”是指一受试者，该受试者要从另一受试者接受，或已经接受移植的细胞、组织或器官。

如本文所用，“供体受试者”是指一受试者，从该受试者取出要移植的细胞、组织或器官，然后将该细胞、组织或器官移植到受体受试者。

在一个实施方式中，供体受试者是灵长类动物。在另一实施方式中，供体受试者是人类。在一个实施方式中，受体受试者是灵长类动物。在一个实施方式中，受体受试者是人类。在一个实施方式中，供体和受体受试者都是人类。因此，本发明包括异种移植的实施方式。如本文所用，“被免疫系统排斥”描述了以下事件，其中受体受试者的免疫系统将来自供体的移植细胞、组织或器官识别为非自身的超急性、急性和/或慢性应答，以及随后的免疫应答。

术语“同种异体”是指，源自与要引入材料的个体属于相同物种的不同动物的任何材料。当一个或多个基因座上的基因不同时，两位或更多位个体彼此被称为是同种异体。

术语“自体”是指，源自同一个体的任何材料，之后将其重新引入该个体。

如本文所用，“免疫遏抑药物”是，用于遏抑受体受试者的免疫应答的药学上可接受的药物。非限制性实例包括雷帕霉素。

如本文所用，“预防有效”量是指一物质的量，可有效预防或延缓将要施用该物质的受试者中的给定病理状况的发作。预防有效量是指，在必要的剂量和时间段内，有效达到期望的预防结果的量。通常，由于受试者在疾病发病之前或疾病的较早阶段使用了预防剂量，因此预防有效量小于治疗有效量。

如本文所用，“治疗有效”量是指有效的治疗、改善或减轻，受试者所患的给定病理状况的症状或原因的物质的量，其中该物质要针对该病理状况进行给药。

在一个实施方式中，治疗或预防有效量为，每次给药，约1mg药剂/kg受试者至约1g药剂/kg受试者。在另一个实施方式中，治疗或预防有效量为，约10mg药剂/kg受试者至500mg药剂/受试者。在另一个实施方式中，治疗或预防有效量为，约50mg药剂/kg受试者至200mg药剂/kg受试者。在另一个实施方式中，治疗或预防有效量为，约100mg药剂/kg受试者。在又一实施方式中，治疗或预防有效量选自50mg药剂/kg受试者、100mg药剂/kg受试者、150mg药剂/kg受试者、200mg药剂/kg受试者、250mg剂/kg受试者、300mg药剂/kg受试者、400mg药剂/kg受试者和500mg药剂/kg受试者。

本发明的方法包括治疗、预防和/或控制各种类型的移植、动脉粥样硬化、关节炎、炎性肠病，以及与不希望的自身免疫活性有关或以其为特征的疾病和紊乱的方法。如本文所用，除非另有说明，否则术语“治疗”是指在特定疾病或紊乱的症状出现之后，施用本发明的化合物或其他额外的活性剂。

对状态、紊乱或病状的“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”包括：

预防或延迟，状态、紊乱或症状的临床症状在个体中的出现，其中该个体可能患有或易患该状态、紊乱或症状，但尚未经历或显示该状态、紊乱或症状的临床症状；或者

抑制状态、紊乱或症状，即阻止、减少或延迟疾病，或其复发(在保持治疗的情况下)，或其至少一种临床症状、病征或测试；或

减轻疾病，即引起状态、紊乱或症状的消退，或其临床或亚临床症状或病征中的至少一种。

如本文所用，除非另有说明，否则术语“预防”是指在症状出现之前给药，特别是给药予有以下风险的患者：移植、动脉粥样硬化、关节炎、炎性肠病，以及其他与不期望的自身免疫活性有关或以其为特征的疾病和紊乱。术语“预防”包括对特定疾病或紊乱的症状的抑制。具有移植、动脉粥样硬化、关节炎、炎性肠病家族历史，以及与不期望的自身免疫活性相关或以其为特征的疾病和紊乱的患者，是预防方案的首选候选人。

如本文所用，除非另有说明，否则术语“控制”涵盖，在患有特定疾病或紊乱的患者中，预防该特定疾病或紊乱的复发，和/或延长患有该疾病或紊乱的患者保持在缓解期的时间。

在另一个实施方式中，本发明涵盖治疗、预防和/或控制，移植、动脉粥样硬化、关节炎、炎性肠病的方法，该方法包括，与传统疗法结合(例如之前，期间或之后)，施用本发明的纳米级颗粒，或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、包合物或前药，其中传统疗法结合包括，但不限于，手术、免疫疗法、生物疗法、放射疗法，或目前用于治疗、预防或控制移植的其他非药物疗法。

在本发明的非限制性优选实施方式中，提供了放射性药物组合物，和对受驯化免疫影响的患者的，骨髓、血液和/或脾脏内的纳米生物制剂的积聚，进行放射性药物成像的方法，该方法包括：

向所述患者，以有效促进高反应性先天免疫应答的量，施用纳米生物制剂组合物，

其中所述纳米生物制剂组合物包括(i)纳米级组装物，具有(ii)并入至所述纳米级组装物中的抑制剂药物，和(iii)并入至所述纳米级组装物中的正电子发射断层扫描(PET)成像剂，

其中所述纳米级组装物是多组分载体组合物，包括：(a)磷脂；(b)apoA-I或apoA-I的肽模拟物；和，可选的(c)疏水性基质，包括一种或多种甘油三酸酯、脂肪酸酯、疏水性聚合物或甾醇酯或其组合；和，可选的(d)胆固醇，其中代谢途径或表观遗传途径的抑制剂包括：NOD2受体抑制剂、mTOR抑制剂、核糖体蛋白S6激酶β-1(S6K1)抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂(他汀类)、组蛋白H3K27脱甲基酶抑制剂、BET溴结构域阻断抑制剂、组蛋白甲基转移酶和乙酰基转移酶抑制剂，DNA甲基转移酶和乙酰基转移酶的抑制剂、炎症小体抑制剂、丝氨酸/苏氨酸激酶Akt抑制剂、缺氧诱导因子1-α抑制剂(也称为HIF-1-α)，及其一种或多种的混合物，其中PET成像试剂选自

其中所述纳米生物制剂，在水性环境中，自组装成尺寸为直径在约8nm至400nm之间的纳米盘或纳米球；

其中所述纳米级组装物将稳定的药物-试剂螯合物，递送至患者的骨髓、血液和/或脾脏中的髓系细胞、髓系祖细胞或造血干细胞，

以及

(ii)对患者进行PET成像，以使稳定的药物-试剂螯合物在患者身体的骨髓、血液和/或脾脏内的生物分布可视化。

此外，可以使用离体方法，使用γ计数或放射自显影，来量化

我们的方法提供了，一种使用

在本发明的又一个优选的实施方式中，在配制物中需要进一步稳定性的情况中，本发明的亲脂性DFO衍生物，称为C

在本发明的另一个非限制性优选实施方式中，本发明包括经放射性标记的蛋白包被的纳米颗粒，其通过以下步骤来制备：首先配制颗粒，然后用可商业上获得的p-NCS-Bz-DFO对蛋白质组分进行官能化，最后使用我们的一般步骤引入

实施例

移植免疫力结果-实施例1～13

为了破译促进同种异体移植物免疫的巨噬细胞激活途径，评估了与驯化免疫相关的非永久性表观遗传重编程，所引起的具有炎性细胞因子产生增加的巨噬细胞的功能状态。显示了，在无菌性炎症下可能存在的，树突状细胞相关性C型植物凝集素-l(dectin-1)和TLR4激动剂波形蛋白以及高迁移率族蛋白1(HMGB1)的作用。

如所述，将BALB/c(H2d)心脏移植到完全同种异体的C57BL/6(H2b)受体中，图1～3中的数据表明，器官移植后，供体同种异体移植物中，两种蛋白质均上调。这表明，波形蛋白和HMGB1能够局部促进，移植物浸润巨噬细胞的驯化。

为了证实，图4示出了，表达dectin-1和TLR4的移植物浸润巨噬细胞的流式细胞术结果。使用缺陷性受体小鼠，缺乏dectin-1和TLR4表达，阻止了移植物浸润炎症性Ly6Chi巨噬细胞的积累(图5)。相反地，dectin-1或TLR4的缺乏，促进了Ly6Clo巨噬细胞在同种异体移植物中的积累，其促进同种异体移植物的耐受性。

已经证明，供体同种异体移植物上调波形蛋白和HMGB1，示出波形蛋白和HMGB1促进巨噬细胞驯化。使用已建立的体外驯化免疫模型，在波形蛋白和HMGB1刺激下，促炎性细胞因子TNFα和IL-6的产生也观察到类似的升高(图6)，这表明这些蛋白质诱导巨噬细胞驯化的能力，其中在体外驯化免疫模型中，经纯化的单核细胞暴露于β-葡聚糖，然后用LPS再刺激。为了验证波形蛋白和HMGB1诱导移植物浸润巨噬细胞的局部驯化，从心脏同种异体移植物中对这些细胞进行了流式分选，并评估了它们产生促炎性细胞因子和糖酵解产物的能力。结果表明，在离体LPS刺激后，dectin-1或TLR4缺乏显著降低了移植物浸润巨噬细胞的促炎性TNFα和IL-6的表达，以及乳酸盐的产生(图7)。与蛋白质表达一致，不存在dectin-1或TLR4，阻止了移植物浸润巨噬细胞中，促炎性细胞因子TNFα和IL-6，以及糖酵解酶己糖激酶(HK)和磷酸果糖激酶(PFKP)的启动子中的H3K4me3表观遗传学变化(图8)。总体而言，数据显示，骨髓中的单核细胞前体(图34)在移植后早期就迁移到同种异体移植物中，并在局部波形蛋白/HMGB1暴露后，变得驯化。

在本发明的另一个优选方面，开发了基于高密度脂蛋白(HDL)纳米生物制剂的纳米免疫疗法，以靶向髓系细胞。由于雷帕霉素的哺乳动物靶点(mTOR)通过驯化免疫来调节细胞因子的产生(信号3)，因此将mTOR抑制剂雷帕霉素(图35)封装在从人类血浆中分离的天然磷脂和载脂蛋白A-I(apoA-I)的冠状物中，以提供mTORi-HDL纳米生物制剂。

如分别通过高效液相色谱和动态光散射法所测定的，所得纳米生物制剂的药物包封效率为62±11％，平均流体动力学直径为12.7±4.4nm。透射电子显微镜显示，mTORi-HDL具有盘状结构(图9和图36；STAR方法)。

使用已建立的体外驯化免疫模型，其中将纯化的人单核细胞暴露于β-葡聚糖，在用LPS再刺激时，观察到细胞因子和乳酸产生升高。相反地，在驯化期间用mTORi-HDL处理，经β-葡聚糖驯化的人类单核细胞，在LPS再刺激时表现出显著降低的细胞因子和乳酸盐生成(图10)。该结果示出，驯化免疫是依赖于mTOR的。由于较高的细胞因子和糖酵解反应可能是巨噬细胞表观遗传重编程的结果，因此对组蛋白H3K4的三甲基化进行了评估，其指示开放染色质(图11；STAR方法)。mTORi-HDL处理阻止了，在与人类单核细胞中的驯化免疫相关的四个炎症基因的启动子水平上的表观遗传学变化。

在C57BL/6野生型小鼠中，使用体内正电子发射断层扫描与计算机体层扫描(PET-CT)成像、离体近红外荧光(NIRF)成像和流式细胞术的组合(图13)，示出了经荧光染料染色(DiO或DiR)或锆-89放射性标记的mTORi-HDL的生物分布和免疫细胞特异性(

重要的是，观察到mTORi-HDL大量积累在骨髓中(图14～15)，这与几种髓系细胞及其祖细胞(图16)有关，以促进诱导延长的治疗效果。

将mTORi-HDL处理应用于实验性心脏移植小鼠模型(图17)，并如上所述确定同种异体移植物的靶向性和免疫细胞特异性。接受异位心脏移植后六天，通过静脉内

由于纳米免疫疗法示出了，良好的器官分布方式和心脏同种异体移植物的摄入，因此评估了已被荧光染料DiO标记的mTORi-HDL的免疫细胞特异性。静脉内施用后24小时，收集了心脏同种异体移植物，以及血液和脾脏，并通过流式细胞术，测量了mTORi-HDL在DC、巨噬细胞、中性粒细胞和T细胞中的分布。图中显示了，mTORi-HDL对髓系细胞的细胞偏好性，在同种异体移植物、血液和脾脏中，巨噬细胞的摄入显著高于DC或嗜中性粒细胞(图20，图40～41)。T细胞表现出较差的mTORi-HDL摄入(图42和图43)，这突显了mTORi-HDL对髓系细胞的优先靶向。

评估了一种治疗方案，该治疗方案涉及，在移植当天，以及术后第2天和第5天，以单位剂量5mg/kg雷帕霉素，进行三次mTORi-HDL静脉注射。分析了，对接受mTORi-HDL治疗或安慰剂的小鼠的同种异体移植物、血液和脾脏中的髓系细胞部分进行了分析。与靶向数据一致，与安慰剂或经口服雷帕霉素治疗的小鼠(在术后第0、2和5天，5mg/kg)相比，在用mTORi-HDL治疗的受体的同种异体移植物、血液和脾脏中的巨噬细胞、嗜中性粒细胞和DC的总数显著降低(图44)。

图中还提供了，mTORi-HDL纳米免疫疗法，对具有不同免疫调节特性的两种不同的巨噬细胞亚群(Ly-6Chi和Ly-6Clo)分布的影响。移植后六天，未经治疗的受体小鼠，在同种异体移植物、血液和脾脏中，具有数量增加的炎症性Ly-6Chi巨噬细胞(图21和图45)。相比之下，经mTORi-HDL治疗的受体具有数量增加的Ly-6Clo巨噬细胞。数据表明，尽管在移植排斥过程中Ly-6Chi巨噬细胞占巨噬细胞的大多数，但我们的mTORi-HDL纳米免疫疗法促进了Ly-6Clo巨噬细胞的积累。在经口服雷帕霉素治疗的动物中未观察到这种变化(图45)。

从经安慰剂或mTORi-HDL治疗的动物的同种异体移植物中，流式分选的巨噬细胞中分离的mRNA进行基因集合富集分析(GSEA)，用于说明mTORi-HDL纳米免疫疗法所靶向的分子途径。基因阵列结果表明，与驯化免疫相关的mTOR和糖酵解途径受到mTORi-HDL的负调控(图22～图23)。对来自心脏同种异体移植物的巨噬细胞进行流式分选和评估，以证明它们产生炎性细胞因子(信号3)和糖酵解产物的能力。已示出，离体LPS刺激后，mTORi-HDL治疗通过移植物浸润巨噬细胞，显著降低了TNFα和IL-6蛋白的表达和乳酸盐的产生(图24)。与体外观察结果一致(图10和图11)，mTORi-HDL治疗还防止了，在移植物浸润巨噬细胞中发生H3K4me3表观遗传学改变(图25；STAR方法)。

图26～图33示出了，mTORi-HDL纳米免疫疗法促进了器官移植接受。图26～图33示出了，移植物浸润巨噬细胞的免疫学功能。通过它们在体外抑制经羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的CD8+T细胞的增殖的能力，来测量Ly-6Clo巨噬细胞的抑制功能。观察到，从经mTORi-HDL治疗的受体小鼠的同种异体移植物中获得的Ly-6Clo巨噬细胞，在体外抑制T细胞增殖(图26)。经mTORi-HDL治疗的同一同种异体移植物的Ly-6Clo巨噬细胞，使表达免疫抑制性Foxp3的调节性T细胞(Treg)扩增。与这些数据相符，观察到，在经mTORi–HDL治疗的受体的同种异体移植物中，有显著更多的CD4+CD25+T细胞(图27)。这些结果表明，mTORi-HDL治疗，通过促进Ly-6Clo调节性巨噬细胞(Mreg)的发育，来支持移植耐受性。

如图所示，使用在体内耗尽的Ly-6Clo Mreg，来说明Ly-6Clo Mreg在移植受体中的功能作用。简而言之，将BALB/c(H2d)供体心脏同种异体移植物，移植到经mTORi-HDL治疗的C57BL/6完全同种异体的CD169白喉毒素(DT)受体(DTR)(H2b)的受体小鼠中。在移植当天，通过用DT给药，耗尽了调节性Ly-6Clo Mreg(图28)，这样尽管进行了mTORi-HDL治疗，但仍导致了早期移植排斥(12.3±1.8天)(图29)。

过继转移野生型单核细胞恢复了同种异体移植物的存活，从而证明纳米免疫疗法通过Mreg发挥其效果(图29)。使用CD11c-DTR小鼠作为移植受体，进一步证实了这一点，其中在这些小鼠中进行DT给药，耗尽了CD11c+DC。这表明，移植物存活延长与CD11c+DC无关。相反地，在CCR2缺陷型受体小鼠(其具有较少的Ly-6Chi循环单核细胞)中的移植物存活并未得到延长(图30)。总体而言，这些实验证明，巨噬细胞对于mTORi-HDL纳米免疫疗法促进器官移植接受来说是必需的。

活化的巨噬细胞产生大量的IL-6和TNFα，其促进T细胞的移植物反应性同种免疫。受体IL-6和TNFα的缺失，与施用CD40-CD40L共刺激性阻断协同作用，以诱导永久性同种异体移植物接受。同时发生的共刺激性阻断(信号2)增强了mTORi-HDL的功效，表明了这一点。为了进行说明，使用了第二纳米免疫疗法，其由CD40-TRAF6抑制性HDL(TRAF6i-HDL)组成(图47和图48)。使用激动性CD40 mAb(克隆FGK4.5)，示出了CD40信号传导抑制的特异性，其在经mTORi-HDL治疗的受体中诱导了排斥。示出，TRAF6i-HDL纳米生物制剂的治疗，防止了刺激性CD40 mAb的有害效果，并恢复mTORi-HDL介导的同种异体移植物的存活(图31)。

图中示出了，纳米免疫疗法的延长完全同种异体的供体心脏移植物存活的能力。使用上述三次剂量方案，即在术后第0、2和5天给药，单位剂量为5mg/kg，与安慰剂、HDL媒介物和口服/静脉内雷帕霉素治疗相比，mTORi-HDL治疗显著提高了心脏同种异体移植物的存活(图32和图49)。随后，通过组合施用mTORi-HDL(信号3)和TRAF6i-HDL(信号2)纳米生物制剂，测试了治疗方案。该mTORi-HDL/TRAF6i-HDL治疗，协同地促进了器官移植物接受，并在移植后100天，得到了＞70％的同种异体移植物的存活。在没有毒性或慢性同种异体移植物血管病变的组织病理学证据的情况下(图33和图50)，组合治疗明显优于mTORi-HDL和TRAF6i-HDL单一疗法(图32)。

总体而言，数据示出了，基于HDL的纳米免疫疗法，防止了巨噬细胞源性的炎性细胞因子的产生，这与驯化免疫相关。此外，基于HDL的纳米免疫疗法，表现出比口服雷帕霉素更低的毒性，从而延长了治疗效果，且不会产生脱靶的副作用(图51)。

小鼠

从杰克逊(Jackson)实验室购买了雌性C57BL/6J(B6 WT，H-2b)和BALB/c(H-2d)小鼠。八周龄C57BL/6J(Foxp3tmlFlv/J)，CCR2缺陷型和CD11c-DTR小鼠购自Jackson实验室。C57BL/6J CD169DTR小鼠购自田中正人(Masato Tanaka，川口市，日本)(Miyake et al,2007)。在8至10周龄时招募动物(体重20～25g)。根据西奈山动物护理和利用委员会(MountSinai Animal Care and utilization Committee)批准的方案，使用匹配的8至12周龄的雌性小鼠进行所有实验。

人体样本

在签署书面知情同意书后(桑昆血库，奈梅亨，荷兰)，从合并的未指定性别的健康供体中获得血沉棕黄层。没有收集健康供体的性别和年龄，因此无法获得。

方法细节

带血管的心脏移植

如前所述(Corry et al.,1973)，将BALB/c心脏，作为完全带血管的异位移植物，移植到C57BL/6小鼠中。通过在供体和受体的主动脉之间建立端侧吻合，以及在供体的肺动脉干和受体的下腔静脉之间建立端侧吻合，将心脏移植到受体的腹膜腔中。随后通过每日触诊，评估心脏同种异体移植物的存活。排斥反应被定义为，完全停止心脏收缩，并通过剖腹手术直接观察进行证实。使用卡普兰-梅尔(Kaplan-Meier)存活分析，比较了各组之间的移植物的存活。载脂蛋白A-I(apoA-I)的分离

按照先前描述的程序(Zamanian-Daryoush et al.,2013)，从人类HDL浓缩物(生物资源技术(Bioresource Technology))中分离人类apoA-I。简而言之，将溴化钾溶液(密度：1.20g/mL)置于浓缩物顶部，并通过超速离心获得纯化的HDL。将经纯化的部分添加至氯仿/甲醇溶液中，进行脱脂。过滤得到的乳状溶液，并且使apoA-I沉淀物干燥过夜。蛋白质在6M的盐酸胍中复性，所得溶液用PBS透析。最后，将apoA-I的PBS溶液通过0.22μm的过滤器过滤，并通过凝胶电泳和尺寸排阻色谱法，确定蛋白质的特征和纯度。

纳米生物制剂的合成

使用改进的脂膜水化法，合成mTORi-HDL纳米颗粒。简而言之，将1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DMPC)、1-肉豆蔻酰基-2-羟基-sn-甘油-磷酸胆碱(MHPC)(均采购自Avanti Polar Lipids)和雷帕霉素(Selleckchem)，以3:1:0.5的重量比，溶解在氯仿/甲醇(10:1v/v)混合物中。蒸发溶剂后，以磷脂与apoA-I为5:1的重量比，添加在PBS中的人类apoA-I，以使脂膜水合，并在冰浴中孵育20分钟。使用探针超声仪，在冰浴中，将所得的混合物均化15分钟，以产生mTORi-HDL纳米颗粒。洗涤mTORi-HDL，并使用10kDa分子量截断(MWCO)过滤管，通过离心过滤进行浓缩。使用离心和过滤(0.22μm)除去聚集体。为了进行治疗研究，在移植当天，以及移植后的第二天和第五天，以5mg/kg的雷帕霉素剂量，动物接受口服剂量或尾部静脉内注射(对于mTORi-HDL或静脉的Ra)。

HDL纳米生物制剂的尺寸和表面电荷，通过动态光散射(DLS)和Z电位测量来确定。纯化后的最终组成，通过标准蛋白质和磷脂定量方法(比辛可宁酸测定法和孔雀石绿磷酸盐测定法)来确定，而药物浓度通过相对于参考化合物的校准曲线的HPLC来确定。批次之间的±15％的波动被认为是可以接受的。

放射标记mTORi-HDL纳米颗粒

根据先前描述的程序(Perez-Medina et al.,2015)，用89Zr对mTORi-HDL进行放射性标记。简而言之，以在初始配方中的DMPC为代价，通过添加1摩尔％的磷脂螯合剂DSPE-DFO，获得了易于标记的mTORi-HDL。通过使含DFO的纳米颗粒，与89Zr-草酸盐在PBS(pH＝7.1)中，在37℃反应1小时，实现了89Zr的放射性标记。使用10kDa的MWCO管，通过离心过滤，分离出89Zr-mTORi-HDL。放射化学品产率为75±2％(n＝2)。

显微PET/CT成像和生物分布研究

小鼠(n＝6；3例具有心脏移植物[体重：18.8±1.0g])在移植物移植后六天，经由它们的侧尾静脉，注射单剂量的89Zr-mTORi-HDL(0.17±0.01mCi，～0.25mg apoA-I)的0.2mL PBS溶液。24小时后，用异氟烷(Baxter Healthcare，迪尔菲尔德，美国)/氧气混合物(2％用来诱导，1％用来保持)麻醉动物，然后使用Inveon PET/CT系统进行扫描(SiemensHealthcare Global，埃尔兰根，德国)。进行了15分钟的全身PET静态扫描，记录最少3000万个同时发生的事件。能量和同时发生的时间窗口分别为350～700keV和6ns。将图像数据标准化，以校正PET响应的不均匀性、停滞时间(dead-time)的计数损失、正电子分支比和注射时间的自然衰退，但未实施衰减、散射或部分容积平均的校正。使用系统校准因子，将重构图像中的计数率转换为活性浓度(每克组织的注射剂量百分比[％ID])，其中系统校准因子源自对含89Zr的小鼠大小的水等效模体进行成像。使用ASIPro VMTM软件(ConcordeMicrosystems，诺克斯维尔，美国)和Inveon Research Workplace(Siemens HealthcareGlobal，埃尔兰根，德国)软件，对图像进行了分析。使用设置在80kV电压和500μA电流的X射线管，进行全身标准低倍率CT扫描。使用120个旋转步骤，总计220度，获取CT扫描，以产生预计的120s扫描时间，具有每帧145ms的曝光时间。在PET/CT扫描后，立即处死动物，并收集目标组织，肾脏、心脏、肝脏、脾脏、血液、骨骼、皮肤和肌肉，称重，并在Wizard2 2480自动伽玛计数器(Perkin Elmer,沃尔瑟姆,美国)上计数，以确定放射性含量。数值经过衰退校正，并转换为每克注射剂量百分比(％ID/g)。为了确定在移植心脏内的放射性分布，将天然和移植的标本放在紧靠磷光成像板(BASMS-2325，Fujifilm，瓦尔哈拉，美国)的胶片盒中，在-20℃保持4小时。用Typhoon 7000IP读板器(GE Healthcare，匹兹堡，美国)，以25μm的像素分辨率，读取该磷光成像板。使用ImageJ软件分析图像。

免疫荧光显微镜

收获移植的心脏，再进行分割，直接冷冻在Tissue-Tek OCT(Sakura)中，并保存在-80℃，准备用于免疫学研究。使用抵靠在聚赖氨酸包被的载玻片上的Leica 1900CM冷冻切片机，切割8μm的切片，在丙酮中固定(在-20℃下放置20分钟)，然后与含有1％BSA和5％山羊或兔血清的封闭缓冲液一起孵育。然后，将载玻片与来自Abcam的1/100大鼠抗小鼠dectin 1抗体(克隆2A11)，或兔抗小鼠波形蛋白抗体(克隆EPR3776)在4℃下孵育过夜。过夜孵育后，将载玻片在PBS中洗涤，然后与购自Jackson Immunoresearch的缀合的山羊抗兔Cy-3单克隆抗体(1/800)或山羊抗大鼠Cy-2单克隆抗体(1/500)一起孵育。所有载玻片都用含Dapi的Vectashield(Vector Laboratories)封片，以保持荧光。使用Leica DMRA2荧光显微镜(Wetzlar)和数字滨松(Hamamatsu)电荷耦合器件摄相机获得图像。分别收集了绿色、红色和蓝色图像，并使用ImageJ软件(NIH)进行了分析。

移植物浸润白细胞的分离

用含1％肝素的HBSS，原位冲洗小鼠心脏。将移植的心脏切成小块，在37℃，用在HBSS(Cellgro)中的400U/ml胶原酶A(Sigma-Aldrich)、10mM HEPES(Cellgro)和0.01％DNase I(MP Biomedicals)，消化40分钟。将消化的悬浮液通过尼龙筛网并离心，然后将细胞沉淀重悬于完全HBSS中，染色，并通过流式细胞仪(BD LSR-II；BD Biosciences)进行分析。

流式细胞术和细胞分选

对于髓系细胞染色，对小鼠CD45(克隆30-F11)、CD11b(克隆M1/70)、CD11c(克隆N418)、F4/80(克隆CI:A3.1)、Ly-6C(克隆HK1.4)特异性的荧光染料缀合的mAb，以及相应的同型对照，采购自eBioscience。Ly-6G(克隆1A8)mAb采购自Biolegend。对于T细胞染色，抗CD3(克隆2C11)、CD4(克隆GK1.5)、CD8(克隆53-6.7)和CD25(克隆PC61.5)的抗体采购自eBioscience。使用计数亮珠(countbright bead)(Invitrogen)进行绝对细胞计数。对于骨髓、脾脏、肾脏和肝脏的祖细胞、髓系细胞和淋巴样细胞染色，对小鼠B220/CD45R(克隆RA3-6B2)、CD34(克隆RAM34)、CD16/32(克隆93)、CD90(克隆53-2.1)、CD19(克隆1D3)、CD115(克隆AFS98)和CD135(克隆A2F10)特异性的荧光染料缀合的mAb采购自eBioscience；对CD49b(克隆DX5)、MHCII(克隆M5/114.15.2)和Sca-1(克隆D7)特异性的荧光染料缀合的mAb采购自Biolegend；对CD64(克隆X54-5/7.1)、CD117(克隆2B8)和CD172α(克隆P84)特异性的荧光染料缀合的mAb采购自BD Biosciences。在LSR II(BD Biosciences)上进行流式细胞术分析，并使用FlowJo软件(Tree Star,Inc.)进行分析。结果表示为，细胞染色或细胞计数(细胞/毫升)高于背景的百分比。为了纯化移植物浸润髓系细胞，在西奈山伊坎医学院的流式细胞术公共资源设施中，用InFlux细胞分选仪(BD)对供体心脏单细胞悬浮液进行分选，以获得＞96％的纯度。

人类单核细胞驯化免疫实验

如前面所述，分离并驯化人类单核细胞。通过在无热源的PBS中稀释血液，并在Ficoll-Paque(GE Healthcare，英国)上进行差速密度离心，来进行PBMC分离。随后，通过Percoll(Sigma)上的高渗透密度梯度离心，来进行单核细胞分离。将单核细胞(1×10

小鼠单核细胞驯化免疫实验

使用单核细胞分离试剂盒(Miltenyi)，分离骨髓单核细胞。用10ng/ml的重组鼠GM-CSF(peprotech)，使单核细胞前体(在48孔板中，1×10

小鼠染色质免疫沉淀(ChIP)

在本试验中，使用了体外骨髓来源的驯化巨噬细胞，或移植物浸润巨噬细胞。使用了以下抗体：抗H3K4me3(39159；Active Motif)和抗IgG(ab171870；Abcam)。对于ChIP随后进行qPCR的实验，进行交联10min。为了进行超声处理，我们使用了冷冻Bioruptor(Diagenode)，我们对其进行了优化，以生成大约200～1,000个碱基对(bp)的DNA片段。使用适当的同种型匹配的对照抗体(兔IgG；Abcam)，将裂解物预净化2小时。将特异性抗体在4℃，与磁珠(

抑制测试

将C57BL/6(H-2b)小鼠的脾脏轻轻地分离成单细胞悬浮液，并使用低渗ACK裂解缓冲液去除红细胞。用浓度为5μM的CFSE(使用Invitrogen的分子探针)标记脾细胞，然后在冰上，用抗CD8 mAb染色30分钟。使用FACS Aria II(BD Biosciences)，以＞98％的纯度，分选应答者的CFSE+CD8+T细胞。CFSE+CD8+的T细胞与抗CD3/CD28微珠一起用作刺激物。将被刺激的CFSE+CD8+T细胞，与移植物浸润Ly-6Clo巨噬细胞、mTORi-FIDL或安慰剂一起，在5％CO

TREG扩增测试

将C57BL/6-Foxp3tmlFlv/J(H-2b)小鼠的脾脏轻轻地分离成单细胞悬液，并使用低渗ACK裂解缓冲液去除红细胞。在冰上，将脾细胞用抗CD4 mAb染色30分钟。使用FACSAria II(BD Biosciences)，以＞98％的纯度，分选应答者的CD4+。CD4+T细胞，与抗CD3/CD28微珠一起用作刺激物。将被刺激的CD4+T细胞，与移植物浸润Ly-6Clo巨噬细胞、mTORi-HDL或安慰剂一起，在5％CO

酶联免疫吸附测试(ELISA)

如上所述，驯化骨髓来源的巨噬细胞。如上所述，分离移植物浸润巨噬细胞。根据制造商的方案，通过ELISA(R&D Systems)，评估了体外驯化巨噬细胞和移植物浸润巨噬细胞产生的TNF-α和IL-6细胞因子。

微阵列分析

在移植后第六天，从经mTORi-HDL治疗的和安慰剂-排斥的受体中，筛选出移植物浸润受体Ly-6Clo巨噬细胞。用FACS Aria II分选仪(BD Biosciences)，将细胞分选两次，以达到＞98％的纯度。用总共六个Affymetrix小鼠外显子基因芯片2.0阵列(ThermoFisher Scientific)，对分选的细胞进行微阵列分析，并将目标样品重复运行三次。使用Affymetrix表达控制台(Affymetrix Expression Console)软件，对原始CEL文件数据进行标准化。使用基因过滤套件，基于IQR(0.25)过滤器，来过滤基因表达。将经log2标准化和过滤后的数据(调整后的P＜0.05)用于进一步分析。在来自经mTORi-HDL-和安慰剂-治疗的受体的内部-移植物Ly6Clo巨噬细胞之间，进行了基因标签比较。GSEA是使用基因模式(Genepattern)版本3.9.6的，GSEA版本17执行的。用于分析的参数如下。基因集c2.cp.biocarta.v5.l.symbols.gmt；c2.cp.kegg.v5.l.symbols.gmt；c2.cp.reactome.v5.l.symbols.gmt；c6.all.v5.1.symbols.gmt(致癌标签(OncogenicSignatures))；c7.all.v5.l.symbols.gmt(免疫标签(Immunologic signatures))和h.all.v5.1.symbols.gmt(标志物(Hallmarks))，用于运行GSEA。为了从每一基因集结果中选择重要的途径，将fdr的q值0.25设置为临界值。仅考虑有助于核心富集的基因。

体内巨噬细胞耗竭

为了耗尽表达CD169的Ly-6Clo巨噬细胞，在移植后24、48和72小时，向杂合的CD169-DTR受体，腹膜内注射10ng/g体重的DT(Sigma-Aldrich)。

量化与统计学分析

统计学分析

数据以平均值±SEM表示。使用用于配对测量的曼-惠特尼(Mann-Whitney)检验或威尔科克森(Wilcoxon)符号秩检验，评估两组之间的统计学比较。使用克鲁斯卡尔-沃利斯(Kruskal-Wallis)检验，然后进行邓恩(Dunn)多重比较检验，对三组或更多组之间的比较进行分析。绘制Kaplan-Meier曲线，以用于同种异体移植物存活分析，并使用对数秩检验，评估组间差异。P≤0.05的值被认为具有统计学意义。GraphPad Prism 7用于统计学分析。

数据和软件的可用性

本公开中讨论的微阵列数据已保存在NCBI，可通过GEO系列登记号GSE119370进行访问：

https://urldefense.proofpoint.com/v2/url？u＝https-

3A_www.ncbi.nlm.nih.gov_geo_query_acc.cgi-3Facc-

3DGSE119370&d＝DwIEAg&c＝shNJtf5dKgNcPZ6Yh64b-A&r＝UQzd7yXCG-

7V6o6EdZSeY_KvCshJgQzt0LAtZPqCh9Q&m＝cuA3YUXFJvxExRDD8AweBNKmcjdYX

oyMojyj9IZeQf8&s＝f1i6P2_K57m-i40hkuoOxGuMsZH_IKcvtAi3C-9QfmQ&e＝

动脉粥样硬化结果-实施例15～17

参照图52～61，除了单核细胞和巨噬细胞的作用外，其他细胞类型，包括T细胞、内皮细胞和平滑肌细胞，在动脉粥样硬化发病机理中起到关键作用。由于mTOR信号传导与所有细胞均相关，因此全身性mTOR抑制，会影响参与动脉粥样硬化生成的所有细胞类型。我们特定研究了在单核细胞和巨噬细胞中抑制mTOR途径的效果。为了实现这一目标，我们开发了基于HDL的纳米生物制剂，其促进药物以高靶向效率，递送至单核细胞和巨噬细胞。

mTORi-HDL由人类载脂蛋白A-I(apoA-I)和磷脂1-肉豆蔻酰基-2-羟基-sn-甘油磷脂胆碱(MHPC)和1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷脂酰胆碱(DMPC)构成，其中并入了mTOR抑制剂雷帕霉素(图52)。如通过动态光散射所测定的，测量的mTORi-HDL为23nm±9nm(PDI＝0.3)。合成了并有荧光染料(DiO或DiR)的mTORi-HDL变体，以使其能够通过荧光技术进行检测。静脉内给药后24小时，进行的离体近红外荧光(NIRF)成像显示，DiR标记的mTORi-HDL主要积聚在Apoe-/-小鼠的肝脏、脾脏和肾脏中。在主动脉窦区域，观察到高DiR摄取(图53)，这是该小鼠模型中斑块发育的优先位点。

通过流式细胞术评估细胞特性。为此，配制了经DiO标记的mTORi-HDL并进行静脉注射。我们观察到，经DiO标记的mTORi-HDL被存在于主动脉中的91％的巨噬细胞和93％的Ly6Chi单核细胞摄取。此外，发现50％的树突状细胞和73％的中性粒细胞含有mTORi-HDL纳米生物制剂(图54)。在非髓性(Lin+)细胞中观察到，几乎可忽略不计的mTORi-HDL的摄入。这些结果反映了我们在血液、脾脏和骨髓中的发现，表明髓系细胞，特别是Ly6Chi单核细胞和巨噬细胞，示出了mTORi-HDL的高摄取。

为了评估mTORi-HDL对斑块炎症的影响，我们使用了20周龄的Apoe-/-小鼠，向这些小鼠喂食高胆固醇饮食12周，以发展动脉粥样硬化病变。当它们保持高胆固醇饮食时，所有小鼠在一周内，接受四次静脉内注射PBS(对照组，n＝7)或mTORi-HDL(含有5mg/kg雷帕霉素，n＝10)的治疗。最后一次输注后24小时，对小鼠实施安乐死。与对照相比，主动脉窦区域中的斑块定量组织学分析显示，斑块尺寸或胶原蛋白含量没有差异(图55)。我们确实观察到，斑块巨噬细胞含量降低了33％(P＝0.02)。斑块中Mac3与胶原蛋白的比例降低了35％(P＝0.004)，这表明在mTORi-HDL组中，斑块表型更加稳定(图55)。

接下来，我们用计算机断层扫描(FMT-CT)成像进行了荧光分子断层成像，以使主动脉根部区域的蛋白酶活性可视化。我们使用了与上述相同的小鼠模型和治疗方案。在成像前24小时，对照小鼠(n＝8)和经mTORi-HDL治疗的Apoe-/-小鼠(n＝10)接受了单次注射可活化的盘(pan)-组织蛋白酶传感器。蛋白酶传感器被活化的巨噬细胞摄取，并在内吞溶酶体中裂解，产生作为酶活性函数的荧光。mTORi-HDL使蛋白酶活性降低了30％(P＝0.03，图58)。

这些数据共同提供了明确的证据，即单核细胞和巨噬细胞中的mTOR信号传导途径的抑制，导致动脉粥样硬化中炎症活性的迅速降低。这激励了我们解开发生这种情况的机制。

在寻求了解在动脉粥样硬化中，mTOR信号传导途径控制单核细胞和巨噬细胞动力学的机制时，我们集中于mTOR-S6K1(S6K1：核糖体蛋白S6激酶β-1)信号传导轴。已知，S6K1信号传导可调节基本的细胞过程，包括转录、翻译、细胞生长和细胞代谢，但对其在动脉粥样硬化中调节先天免疫应答的作用知之甚少。为此目的，我们构建了含有PF-4708671(一种S6K1的特异性抑制剂)的HDL纳米生物制剂(S6Kli-HDL)(图59)。这种纳米生物制剂是由人类载脂蛋白A-I(apoA-I)和磷脂1-肉豆蔻酰基-2-羟基-sn-甘油磷脂胆碱(MHPC)和1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DMPC)构成的，其中并入了PF-4708671(图59)。如通过动态光散射测定的，测量S6Kli-HDL为34nm±10nm(PDI＝0.3)。

在注入Apoe-/-小鼠后24小时，进行的离体近红外荧光(NIRF)成像显示，经DiR标记的S6Kli-HDL，主要积累在肝脏、脾脏和肾脏中(图60)。此外，在主动脉窦区域观察到高DiR摄取(图60)，与我们对mTORi-HDL所发现的非常相似。使用经DiO标记的S6Kli-HDL，通过对全主动脉的流式细胞术，分析细胞特异性(图61)。DiO阳性细胞的百分比，对于巨噬细胞为87％，对于Ly6Chi单核细胞为84％，对于树突状细胞为64％，对于中性粒细胞为71％(图61)。在非髓系(Lin+)细胞中的摄取可以忽略不计。这些结果表明，纳米生物制剂性质，与治疗有效载荷无关，这使我们能够专门研究，动脉粥样硬化中对mTOR和S6K1的抑制。与mTORi-HDL相比，S6Kli-HDL治疗一周显示出斑块炎症减少的相似趋势(图62)。

接下来，在人类贴壁单核细胞中进行了体外实验，其中如之前所述，oxkLDL诱导了驯化免疫(Bekkering et.al,2018)。我们研究了，mTORi-HDL和S6Kli-HDL纳米生物制剂治疗，是否抑制了oxLDL诱导的驯化免疫。确实，我们发现在用脂多糖LPS进行TLR-4和TLR-2介导的再刺激后，细胞因子的产生减少了(图63)。

单核细胞和巨噬细胞构成了我们宿主防御机制的关键组成部分。一旦识别到外来病原体，这些吞噬细胞就被激活，并增加炎症反应，从而解决感染。无菌物质也可以被视为危险信号并引发炎症反应。这在某些情况下可能是适当的，但也可能是适应不良的，例如在动脉粥样硬化中。

氧化的低密度脂蛋白胆固醇(oxLDL)和胆固醇晶体，是动脉粥样硬化中的病原性先天免疫反应的主要刺激物。OxLDL诱导粒细胞-单核细胞祖细胞的转录重编程，这刺激促炎性单核细胞的产生并从骨髓中释放出来。这导致炎性单核细胞向斑块的募集增加，它们在其中分化为巨噬细胞。此外，对于一个重要的部分，斑块炎症通过巨噬细胞的局部增殖而得以持续。

OxLDL和胆固醇晶体也参与巨噬细胞的炎症激活。OxLDL胆固醇，可通过激活由Toll样受体4(TLR4)和TLR6的异二聚体，与激活核因子-κB(NF-κB)的B类清道夫受体(scavenger receptor)成员1(SRB1)一起形成的信号复合物，来触发巨噬细胞。通过巨噬细胞中吞噬溶酶体的破坏，胆固醇晶体诱导NLRP3炎症小体活化。

胆固醇加强动脉粥样硬化中正在进行的先天免疫细胞活化的另一种机制是“驯化免疫”。驯化免疫，也称为先天免疫记忆，经由表观遗传修饰，诱使非特异性免疫记忆的建立。这一过程可由oxLDL激发，并产生以持久促炎症反应为特征的巨噬细胞表型。oxLDL诱导的驯化免疫是通过NLRP3炎性小体激活介导的。因此，驯化免疫参与维持动脉粥样硬化中的炎症活性。髓系细胞在驯化免疫中发生的表观遗传重编程，与细胞代谢中的明显改变有关。代谢转变为有氧糖酵解诱导驯化免疫。不仅涉及葡萄糖代谢，而且还涉及其他代谢途径，其中包括谷氨酰胺分解和胆固醇合成途径。有趣的是，通过这些代谢途径中的任何一条来诱导驯化免疫，依赖于雷帕霉素(mTOR)的机制性靶标的激活，因此是引人注目的靶标，从而防止驯化免疫。mTOR信号传导途径，通过充当细胞营养状况的整合传感器，并在代谢上协调巨噬细胞的炎症活性，而在先天免疫细胞功能中发挥关键作用。

在载脂蛋白E缺陷型(Apoe-/-)小鼠中，研究了，阻断动脉粥样硬化的单核细胞和巨噬细胞中的mTOR信号传导途径的效果，集中于mTOR-S6K1轴。为了在髓系细胞中实现特异性抑制，我们使用两种不同的高密度脂蛋白(HDL)纳米生物制剂进行静脉内给药，其中的两种不同的高密度脂蛋白(HDL)纳米生物制剂分别并入了mTOR或S6K1抑制剂。我们观察到，通过减少的巨噬细胞增殖和炎症活性的结合，迅速降低了斑块炎症。

在应答所有真核细胞的营养状况中，mTOR信号传导网络对于平衡合成代谢和分解代谢来说是至关重要的。它在调节细胞活性、生长和分裂中起主导作用。在本发明中，我们提供了一种机制框架的证据，其中，mTOR和S6K1信号传导，指示动脉粥样硬化中单核吞噬细胞的增殖以及炎症活性，两者都是需要能量的过程。

如所要求保护和公开的，我们示出，通过使用HDL纳米生物制剂，实现对mTOR和S6K1的细胞特异性抑制，迅速阻止了斑块炎症。我们观察到，这是巨噬细胞的减少的局部增殖和被阻止的炎症状态的结果。从斑块分离的单核细胞和巨噬细胞的转录组学分析，揭示了受mTOR和S6K1抑制影响的关键细胞过程。这些包括，与细胞生长和增殖、代谢和吞噬功能有关的过程。

组织巨噬细胞可以通过局部增殖自我维持。这种自我更新的能力，在很大程度上导致了在晚期斑块中巨噬细胞数量的增加。本发明中的数据表明，通过阻断mTOR和S6K1信号传导，在药理学上抑制巨噬细胞增殖，导致了斑块炎症的迅速减轻。

转录组学分析显示，与转录和翻译，以及调节细胞生长和分裂的途径相关的基因表达发生了改变。我们的发现类似于在交替激活的巨噬细胞中所做的观察。在蠕虫诱导感染的小鼠模型中，观察到巨噬细胞进行大量的局部增殖，在该小鼠模型中，巨噬细胞的激活主要由白介素4(IL-4)诱导。随后示出，IL-4受体靶向磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-Akt信号传导途径，其负责IL-4诱导的增殖。由于PI3K-Akt途径直接调节mTOR激活，因此mTOR可能参与介导了这些作用。

除了对增殖的影响外，我们还观察到，mTORi-HDL和S6Kli-HDL避免了髓系细胞使先天性免疫记忆应答升高。先前已经确定了驯化免疫对mTOR激活的依赖性，但是我们的数据表明，这对于S6K1信号传导也是如此。然而，有趣的是注意到，S6K1不仅是mTOR的下游靶标，因为这种核糖体蛋白能够抑制胰岛素受体底物1(IRS1)的磷酸化。因此，S6K1阻止胰岛素样生长因子1受体(IGFR)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-Akt的信号传导，其是mTOR调节的上游。

驯化免疫中发生的表观遗传重编程与细胞代谢中的明显改变密切相关。在体外，被驯化的单核细胞转变为有氧糖酵解，可能为它们重新活化后的代谢需求做好准备。代谢变化影响表观遗传过程，而且很明显，代谢产物如乙酰辅酶A、琥珀酸盐和α-酮戊二酸可直接影响组蛋白的乙酰化和甲基化。在这种情况下，有趣的是，我们观察到了氧化磷酸化的明显下调。因为还已知mTOR-S6K1抑制会阻止糖酵解，所以这可能迫使巨噬细胞进入低ATP产生的状态。这种低能量状态会对巨噬细胞精心安排炎症应答产生负面影响。在此没有研究这种代谢重编程如何影响驯化免疫，并且这不在本研究的范围之内。

动脉粥样硬化是一种由脂质驱动的炎症性疾病，起引发复杂的免疫应答，巨噬细胞被认为是主要的参与者。我们在本研究中给出的数据，通过示出mTOR信号传导构成巨噬细胞的慢性适应不良炎症反应的基础，为该疾病的发病机理提供了新的见解。已示出，驯化免疫形式的炎症激活和巨噬细胞增殖，均受到mTOR信号传导网络的支持。这些新的机理见解产生了新的治疗机会以减轻动脉粥样硬化中功能异常的先天免疫反应

小鼠

雌性Apoe-/-小鼠(B6.129P2-ApoetmlUnc)用于这项研究。动物护理和程序均基于西奈山伊坎医学院批准的机构规程。八周龄的Apoe-/-小鼠购自杰克逊实验室。所有小鼠均喂食高胆固醇饮食(0.2％重量的胆固醇；15.2％千卡的蛋白质，42.7％千卡的碳水化合物，42.0％千卡的脂肪；Harlan TD.88137)，持续12周。同窝出生的幼仔被随机分配到治疗组。

对RAW264.7细胞系或骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)进行了体外实验。RAW264.7细胞培养在T75cm2培养瓶(Falcon)中的，高葡萄糖杜氏改良Eagle培养基(DMEM)(Gibco LifeTechnologies)中。BMDM培养在细胞培养皿中的，添加有15％L929细胞条件培养基的洛斯维·帕克纪念研究所培养基(RPMI)中。将所有细胞在37℃，5％的CO

人类受试者

对于人类单核细胞的体外研究，在签署知情同意后，获得了健康捐献者的血沉棕黄层(桑昆血库，奈梅亨，荷兰)。为了进行组织学分析，从四名患者中获得了人类动脉粥样硬化斑块样品。四名患者都有颈动脉内膜切除术的适应症。尽管由于群体规模小而无法分析性别关联性，但两项研究的受试者的性别都是已知的。受试者分配到组不适用。

纳米生物制剂的合成

如本文所示，合成了rHDL纳米生物制剂。对于mTORi-HDF，将mTORC1复合抑制剂雷帕霉素(3mg，3.3μmol)，与1-肉豆蔻酰基-2-羟基-sn-甘油磷酸胆碱(MHPC)(6mg，12.8μmol)和l,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)(18mg，26.6μmol)(Avanti PolarFipids)结合。对于S6Kli-HDL，将S6K1抑制剂PF-4708671(1.5mg，4.6μmol)，与1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油3-磷酸胆碱(POPC)(18mg，23.7μmol)和1-棕榈酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PHPC)(6mg，12.1μmol)结合。将化合物和脂质溶解在甲醇和氯仿中，混合，然后在真空中干燥，得到薄的脂膜。将人类载脂蛋白A1(apoA-I)的PBS溶液(4.8mg，在5ml中)添加脂膜中。将混合物在冰冷的超声浴中孵育15～30分钟。随后，使用尖端超声仪，在0℃，对溶液超声处理20分钟，以形成基于rHDL的纳米生物制剂。通过使用100MWCO赛多利斯(Vivaspin)管，在3000rpm下离心过滤，浓缩获得的溶液，以得到～1ml的体积。添加PBS(5ml)，并将溶液浓缩至～1ml。再次添加PBS(5ml)，并将溶液浓缩至～1ml。剩余溶液通过0.22μm的PES针筒式过滤器过滤，以获得最终的纳米生物制剂溶液。为了进行靶向和生物分布实验，通过并入荧光染料DiR或DiO(Invitrogen)，制备了mTORi-HDF和S6Kli-HDF的类似物。

纳米生物制剂治疗

二十周龄的Apoe-/-通过侧尾静脉注射，接受PBS，空的rHDL纳米生物制剂，mTORi-HDL(5mg/kg的mTORi)或者S6K1i-HDL(5mg/kg的S6Kli)。在7天内，通过4次注射来治疗小鼠，同时保持高胆固醇饮食。为了进行靶向和生物分布实验，小鼠接受了单次静脉注射。在最后一次注射后24小时，将所有动物安乐死。

荧光分子断层扫描/X射线计算断层扫描

纳米生物制剂治疗后，给小鼠注射5纳摩尔pan-组织蛋白酶传感器(ProSense680，PerkinElmer，目录号NEV10003)。如前所述(ref)，二十四小时后，将动物放入定制盒子中，并在成像过程中持续给药异氟烷来镇静。首先使用高分辨率CT扫描仪(Inveon PET-CT，Siemens)对动物进行扫描，并通过尾静脉注射导管，以55μL/min的速度持续输注CT造影剂(isovue-370，Bracco Diagnostics)。随后，在同一盒子中，使用FMT扫描仪(PerkinElmer)扫描动物。CT的X射线源，曝光时间370～400ms，在80kVp和500mA下工作。使用对比增强的高分辨率CT图像，来定位主动脉根，这用于指导定量FMT蛋白酶活性图的目标体积的放置。图像融合依赖于基准标记物。图像融合和分析使用OsiriX v.6.5.2(Osirix基金会，日内瓦)进行。

近红外荧光成像

小鼠接受单次静脉注射DiR(0.5mg/kg)标记的mTORi-HDL(5mg/kg)或S6Kli-HDL(5mg/kg)。收集肝脏、脾脏、肺、肾脏、心脏和肌肉组织，用于NIRF成像。使用IVIS 200系统(Xenogen)，用745nm激发滤光片和820nm发射滤光片，以2秒的曝光时间，采集荧光图像。使用供应商提供的软件，在每个组织上绘制ROI，其后，使用这些ROI内的平均辐射效率进行定量分析。

单细胞悬浮液的制备

通过心脏穿刺收集血液，随后给小鼠灌注20mL冷的PBS。获取脾脏和股骨。主动脉，从主动脉根到髂分叉，轻轻地清除脂肪并进行收集。使用酶消化液消化主动脉，在37℃保持60分钟，其中酶消化液包括在PBS中的释放酶TH(4U/ml)(Roche)、脱氧核糖核酸酶(DNase)I(40U/ml)(Sigma-Aldrich)和透明质酸酶(60U/ml)(Sigma-Aldrich)。通过70μm的细胞滤网过滤细胞，并用含血清的培养基洗涤。将血液与裂解缓冲液孵育4分钟，并用含血清的培养基洗涤。将脾脏捣碎，通过70μm的细胞滤网过滤，与裂解缓冲液孵育4分钟，然后用含血清的培养基洗涤。用PBS将骨髓冲洗出股骨，通过70μm细胞滤网过滤，与裂解缓冲液孵育30秒，然后用含血清的培养基洗涤。

流式细胞术

用以下单克隆抗体对单细胞悬液进行染色：抗CD11b(克隆M1/70)、抗F4/80(克隆BM8)；抗CD11c(克隆N418)、抗CD45(克隆30-F11)、抗Ly6C(克隆AL-21)，以及含抗CD90.2(克隆53-2.1)、抗Ter119(克隆TER119)、抗NK1.1(克隆PK136)、抗CD49b(克隆DX5)、抗CD45R(克隆RA3-6B2)和抗Ly6G(克隆1A8)的谱系鸡尾酒(Lin)。通过在体内用5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)标记，来确定新生细胞对不同群体的贡献。根据制造商的方案(BD APC-BrdU试剂盒)，使用了抗BrdU抗体。巨噬细胞被识别为CD45+、CD11bhi、Lin-/低、CD11clo和F4/80hi。Ly6Chi单核细胞被识别为CD45+、CD11bhi、Lin-/低、CDllclo和Ly6Chi。在LSRII流式细胞仪(BD Biosciences)上采集数据，并使用FlowJo v10.0.7(Tree Star)分析数据。

组织学和免疫组织化学

收集用于组织学分析的组织，在福尔马林中固定，并包埋在石蜡中。将小鼠主动脉根切成4μm的切片，每个主动脉根总共产生90～100个横切面。八个横切面用苏木精和曙红(H&E)染色，并用于测量动脉粥样硬化斑块的尺寸。天狼猩红染色用于分析胶原蛋白含量。为了进行免疫组织化学染色，对小鼠主动脉根和人颈动脉内膜切除术(CEA)切片进行脱蜡处理，使用PBS中的4％FCS封闭30分钟，然后在95℃，抗原回收溶液(DAKO)中孵育10分钟。用大鼠抗小鼠Mac3单克隆抗体(1:30，BD Biosciences)，对小鼠的主动脉根部切片进行免疫标记。使用兔抗人类鞘脂激活蛋白原(prosaposin)一抗(1：500，Abcam)，和生物素化的山羊抗兔二抗(1：300，DAKO)相结合，对小鼠主动脉根和CEA样品进行鞘脂激活蛋白原染色。使用驴抗小鼠CD68一抗(1：300，Abcam)与生物素化的驴抗小鼠二抗(1：300；JacksonImmunoResearch)相结合，对CEA样品进行巨噬细胞染色。抗体染色通过Immpact AMEC红(Vectorlabs)或二氨基联苯胺(DAB)可视化。使用Leica DM6000显微镜(LeicaMicrosystems)或VENT ANA iScan HT玻片扫描仪(Ventana)，分析切片。

激光捕获显微切割

对24个主动脉根部切片(6μm)进行激光捕获显微切割。将冷冻切片在分级乙醇溶液(70％两次、95％两次、100％一次)中脱水，用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的水洗涤，用麦氏(Mayer)H&E染色，并在二甲苯中澄清。每8个切片中，将1个切片用于CD68染色(AbdSerotec，1：250稀释)，其用于指导激光捕获显微切割。使用ArcturusXT LCM系统识别，并收集，斑块内富含CD68的区域。

RNA测序

通过激光捕获显微切割术收集的CD68+细胞，用于RNA分离(PicoPure RNA分离试剂盒，Arcturus)，随后根据制造商的方案(Ovation Pico WTA系统，NuGEN)进行RNA扩增和cDNA制备。使用Agilent 2100生物分析仪，测量收集的样品的质量和浓度。对于RNA测序，制备并验证了双端(pair-end)文库。确定了纯度、片段尺寸、产率和浓度。在成簇过程中，文库分子杂交到Illumina流动细胞上。随后，使用桥扩增法扩增杂交的分子，从而产生异质簇群。使用Ilumina HiSeq 2500测序仪获得数据集。

细胞增殖ELISA

为了量化细胞增殖，使用了基于在DNA合成过程中并入BrdU的比色免疫分析法(Roche，瑞士)。将RAW264.7细胞，以每孔2.5×10

代谢胞外通量分析

将BMDM以2.5×10

氧化LDL的制备

使用KBr密度梯度超速离心，从健康志愿者的血清中分离LDL。用KBr，将血浆密度调节至d＝1.100g/mL。将样品在SW41 Ti转子中，以32.000rpm离心22h。如前所述，通过将LDL与20μmol CuSO

人类PBMC和单核细胞分离

通过将血液稀释在无热原的PBS中，并在Ficoll-Paque上进行密度差速离心，来进行PBMC分离。将细胞在PBS中洗涤3次。如先前所述，进行单核细胞的Percoll分离(Repniket al.,2003)。简而言之，将150～200·106个PBMC分层置于高渗透Percoll溶液(48.5％Percoll，41.5％无菌H

单核细胞驯化和抑制实验

如前所述(Bekkering et al.,2016)对人类单核细胞进行了驯化。简而言之，将100,000个细胞添加至平底96孔板。用温热的PBS洗涤后，将单核细胞与仅作为阴性对照的培养基，2μg/mLβ-葡聚糖，10μg/ml oxLDL，或10～5000ng/ml的鞘脂激活蛋白原，一起孵育24h(在10％的合并的人类血清中)。细胞用200μl温热的PBS洗涤一次，并在含10％合并的人类血清的培养基中孵育5天，并更换一次培养基。细胞用200μL RPMI、10ng/ml LPS，或10μg/ml Pam3Cys重新刺激。24h后，收集上清液并保存在-20℃，直至测量细胞因子。在一些实验中，将细胞与纳米生物制剂(rHDL作为对照，或10μM mTORi-HDL或0.1μM S6Kli-HDL)一起预孵育(在oxLDL驯化之前)1h。1小时后，将驯化刺激物添加到细胞和抑制剂中，在剩余的驯化期间内保留抑制剂。24小时后，洗掉刺激物和抑制剂，并如上所述使细胞静置5天。

细胞因子和乳酸盐的测量

按照生产商的说明书，使用用于人类TNFα和IL-6的商用ELISA试剂盒，测定上清液中的细胞因子产量。

RNA分离和qPCR

对于qRT-PCR，以如上所述来驯化单核细胞，但要适应RNA提取所需的细胞数量。将500.000个细胞/孔一式两份地接种在24孔板中。在第0天(1小时贴壁和洗涤后)、第1天(驯化和洗涤后)、第2天、第3天和第6天，除去上清液，并将细胞储存在TRIzol试剂中。根据制造商的说明书，进行总RNA的纯化。使用NanoDrop软件测量RNA浓度，并根据制造商的说明书，使用iScript cDNA合成试剂盒，对分离的RNA进行逆转录。使用SYBR Green法进行qPCR。测量的基因是：18S和鞘脂激活蛋白原。按照具有效率校正的定量方法，对样品进行分析，18S用作管家基因。在第0天，未被触发的样品的相对mRNA表达水平用作参考。

定量和统计学分析

RNA测序分析

使用TopHat比对软件(bowtie2)，将双端测序读取结果与人类基因组hgl9进行比对(Langmead and Salzberg，2012)。接下来，基于GENCODE基因模型第22版(Mudge andHarrow,2015)，使用HTSeq(Anders et al.,2015)在基因水平上定量基因表达。使用M值标准化方法的修整平均值，以调整不同样品之间测序文库大小的差异，将基因表达的原始读取计数标准化为每百万的计数。使用Bioconductor软件包利马(limma)(Ritchie et al.,2015)，识别药物治疗和对照之间的DE基因。为了纠正多重测试问题，在对标签进行置乱(permutation)后，使用了limma来计算随机样本中的统计量和P值。此过程重复1,000次，以获得无效的t统计量和P值分布，用于估计所有基因的错误发现率(FDR)值。使用校正P值小于0.2处的截止值，识别从主动脉斑块分离的细胞的DE基因。校正P值小于0.05处的截止值，用于识别RAW264.7细胞的DE基因。按照先前描述的算法(Zhang and Horvath,2005)，构建了加权基因共表达分析，以识别参与各种激活途径的基因(模块)组。简而言之，计算每对基因之间的皮尔逊(Pearson)相关性，从而产生相似性(相关性)矩阵(sij)。随后，使用幂函数

统计学分析

体内实验的结果表示为平均值±SD。使用非参数Mann-Whitney U检验和Kruskal-Wallis检验，计算差异的显著性。

进行了至少6次体外人类单核细胞实验，并使用直方图和盒形图的可视化分析进行了正常性检查，使用科研绘图工具(Graphpad Prism)进行了正常性检测。使用Wilcoxon符号秩检验，对非参数的参数进行成对分析。数据以平均值±SEM表示。

p值低于0.05，被认为具有统计学意义。所有数据均使用Graphpad Prism 5.0进行分析。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.00l，****p＜0.000l。

所有化学品均购自Sigma Aldrich、Medchem Express或Selleckchem，PES注射过滤器采购自Celltreat。来自World Precision Instruments的NE-1002X型微流体泵，与Microfluidic-chipshop(#14-1038-0187-05)的奇诺(Zeonor)人字形图案混合器结合使用。使用100kDa的MWCO20mL Vivaspin离心过滤器，纯化颗粒。透析袋来自ThermoScientific。ApoA-I蛋白在内部使用文献方法xx进行纯化。使用布拉德(Bradfort)分析，在BioTek Cytation 3成像酶标仪上，对ApoA-I进行光谱定量。在Brookhaven仪器公司的ZetaPals分析仪上，进行DLS和ζ电位测量，取数值分布的平均值来确定颗粒尺寸。使用连接到Bruker Advance 600控制台的Bruker600超屏蔽磁体，分析

使用配备有C

(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四烷基-1H-环戊基[a]菲蒽-3-基丙二酸乙酯

将胆固醇(194mg，0.50mmol)溶解在DCM(30mL)中，添加吡啶(60μL，0.75mmol)，并将混合物冷却至0℃。滴加3-氯-3-氧代丙酸乙酯(80μL，0.75mmol)，并将混合物在0℃下搅拌2小时，使其升温至室温，并再搅拌16小时。添加水(60mL)，分离各层，水相用DCM(50mL)洗涤两次。合并的有机部分用MgSO

在40℃，将1-十八醇(250mg，1.08mmol)溶于无水氯仿(30mL)中，添加三甲胺(165μL，119mmol)，然后添加3-氯-3-氧代丙酸乙酯(140μL，1.30mmol)。将混合物搅拌2小时，使其冷却至室温，并用水(3×30mL)洗涤。将有机相用MgSO

(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚基-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-3-基3-((2-(吡啶-2-基)-6-(l,2,4,5-四氢-3H-苯并[d]嗪-3-基)嘧啶-4-基)氨基)丙酸酯

将GSK-J1(25mg，64.2μmol)溶于无水氯仿(3mL)中，添加EDC.HCl(16.0mg，83.3μmol)和4-(二甲基氨基)吡啶(2.3mg，18.8μmol)，将混合物搅拌30分钟。添加胆固醇(27mg，69.8μmol)，并将混合物在室温搅拌过夜。用水(3×5mL)洗涤混合物，并使用MgSO

十八烷基3-((2-(吡啶-2-基)-6-(1,2,4,5-四氢-3H-苯并[d]嗪-3-基)嘧啶-4-基)氨基)丙酸酯

将GSK-J1(20mg，51.4μmol)溶解在无水氯仿(3mL)中，添加EDC.HCl(12.8mg，66.6μmol)和4-(二甲基氨基)吡啶(1.8mg，14.8μmol)，将混合物搅拌30分钟。添加1-十八醇(15.4mg，66.6μmol)，并将混合物在室温搅拌过夜。用水(3×5mL)洗涤混合物，并用MgSO

(S)-2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f][l,2,4]三唑[4,3-a][l,4]二嗪-6-基)乙酸

将(+)-JQ1(90mg，0.20mmol)溶于5％TFA的氯仿(5mL)中，并在40℃下搅拌16小时，然后蒸发溶剂。添加氯仿(5mL)，并在真空下蒸发，将其重复两次以得到产物，得到的产物无需进一步表征即可使用。产率＝78mg，0.20mmol。η＝＞99％。

(S)-2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f][l,2,4]三唑[4,3-a][1,4]二嗪-6-基)乙酸十八烷基酯

将(S)-2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f][l,2,4]三唑[4,3-a][l,4]二嗪-6-基)乙酸(78mg，0.20mmol)溶于无水氯仿(5mL)，添加EDC.HCl(45mg，0.23mmol)和4-(二甲基氨基)吡啶(37mg，0.30mmol)，并将混合物搅拌30分钟，添加1-十八烷醇(63mg，0.23mmol)，并将混合物在室温下搅拌16小时。用水(3×5mL)洗涤混合物，并使用MgSO

(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚基-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲蒽基-3-基2-((S)-4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f][l,2,4]三唑并[4,3-a][l,4]二嗪-6-基)乙酸酯

将(S)-2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f][l,2,4]三唑[4,3-a][l,4]二嗪-6-基)乙酸(75mg，0.19mmol)溶于无水氯仿(5mL)中，添加EDC.HCl(50mg，0.26mmol)和4-(二甲基氨基)吡啶(40mg，0.33mmol)，并将混合物搅拌30分钟。添加胆固醇(92mg，0.23mmol)，并将混合物在室温搅拌16小时。用水(3×5mL)洗涤混合物，并使用MgSO

雷帕霉素-C

将雷帕霉素(100mg，110μmol)和硬脂酸乙烯酯(170mg，548μmol)溶于无水甲苯(40mL)中，并添加Novozyme 435(50mg)。混合物在适度真空下，45℃，在旋转蒸发仪上搅拌3天。当必要时，添加额外的甲苯。过掉出Novozyme珠，蒸发掉溶剂，并使用柱色谱法纯化(0～6％MeOH的氯仿溶液)粗产物，得到纯产物。产率＝108mg，89.4μmol。η＝84％。通过

从氯仿的10mg/ml储备溶液中，将1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC，250μL)、1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PHPC，65μL)、胆固醇(15μL)、三辛精(1000μL)和(前)药(65μL)，组合到20ml的小瓶中，并真空干燥。将所得膜重新溶解在乙腈：甲醇混合物(95％:5％，总体积3mL)。单独地，制备ApoA-I蛋白的PBS溶液(0.1mg/ml)。使用微流体装置，将两种溶液同时注入人字形图案(herringbone)混合器中，其中脂质溶液的流速为0.75ml/min，ApoA-I溶液的流速为6ml/min。使用100MWCO Vivaspin管，以4000rpm离心过滤，浓缩所得的溶液，以获得5mL的体积。添加PBS(5mL)，并将溶液浓缩至5mL，再次添加PBS(5mL)，并将溶液浓缩至约3mL。剩余溶液通过0.22μm的PES针筒式过滤器过滤，以获得最终的纳米生物制剂溶液。为了获得用于FACS测量的纳米生物制剂，向乙腈溶液中添加3,3'-二癸基氧杂羰基花菁高氯酸盐(DIO-C

对于PF-4708671药物(S6Kli)，使用上述步骤观察到药物回收率小于1％，这可能是由于其在水和乙腈中具有高溶解度。为了仍然能够将该药物并入到我们的纳米生物制剂库中，使用超声方法对其进行了整合。在此，通过干燥乙腈溶液，形成相同的脂质和药物膜。向该膜中，添加含有ApoA-I(2.4mg)的PBS(10mL)，并在浴超声仪中将溶液超声处理5分钟。随后，使用尖端超声仪，将获得的悬浮液，在0℃，超声30分钟。使用与通过微流体制备的纳米生物制剂相同的Vivaspin和注射式过滤器程序，来纯化获得的澄清溶液。

为了合成15nm尺寸的纳米颗粒，使用与35nm尺寸的颗粒相似的微流体程序。在此，乙腈混合物含有(再次来自10mg/ml的储备溶液)：POPC(250μL)、PHPC(15μL)、胆固醇(13μL)。乙腈溶液以0.75mL/min的速度注入。ApoA-I溶液(在PBS中，0.1mg/mL)以3mL/min的速度注入。为了获得用于FACS测量的纳米生物制剂，将DIO-C

为了合成65nm尺寸的纳米颗粒，使用与35nm尺寸的颗粒相似的微流体程序。在此，乙腈混合物含有(再次来自10mg/ml的储备溶液)：POPC(250μL)、胆固醇(12μL)、三辛精(1400μL)。乙腈溶液以0.75mL/min的速度注入。ApoA-I溶液(在PBS中，0.1mg/ml)以4mL/min的速度注入。为了获得用于FACS测量的纳米生物制剂，将DIO-C

为了合成120nm尺寸的纳米颗粒，使用与35nm尺寸的颗粒相似的微流体程序。在此，乙腈混合物含有(再次来自10mg/ml的储备溶液)：POPC(100μL)、胆固醇(10μL)、三辛精(4000μL)。乙腈溶液以0.75mL/min的速度注入。ApoA-I溶液(在PBS中，0.1mg/ml)以1.5mL/min的速度注入。为了获得用于FACS测量的纳米生物制剂，将DIO-C

将等份(10μL)的最终颗粒溶液溶解于PBS(1mL)中，通过0.22μm的PES注射式过滤器过滤，并通过DLS分析，以确定数均尺寸分布的均值。颗粒合成后，以及之后的2、4、6、8、10天，直接分析样品。

图64示出了，开发的4种不同类型的纳米颗粒的尺寸和稳定性。为了解决对较大的两种颗粒进行放射性标记的问题，我们还在研究，使用DFO功能化的APAO1，代替以前使用的DSPE-DFO，对颗粒进行放射性标记。基于使用DIO负载的颗粒获得的结果，及其良好的重复性，我们当时选择了35nm的颗粒来创建纳米生物制剂文库。

图65示出了，每种纳米生物制剂在第10天测量期内的平均尺寸，对每种颗粒分析了两个不同的批次。还绘制了所有纳米生物制剂随时间的平均尺寸，表明它们的尺寸随时间保持恒定。

图66示出了，每种纳米生物制剂在第10天测量期间的平均分散度，对每种颗粒分析了两个不同的批次。还绘制了所有纳米生物制剂随时间的平均分散度，表明它们的分散度随时间保持恒定。

使用以下程序确定(前)药的回收和水解：将等份(200μL)的颗粒溶液在真空下干燥，添加乙腈(600μL)，并将悬浮液超声处理20分钟。将悬浮液离心，以使所有固体沉淀，使用HPLC分析剩余的溶液；除了使用SFC-MS分析的丙二酸酯衍生物，和通过GC-MS分析的丙二酸二甲酯之外。

图67示出了，纳米生物制剂中(前)药的回收率。对每种纳米生物制剂的两批样品的分析，均进行了两次重复。将为体外样品再次进行这样的测量。

图68示出了，在4℃，PBS中，纳米生物制剂中的(前)药随时间的水解。仅观察到雷帕霉素和C

使用Bradfort分析，以光谱法确定ApoA-I的回收率。将纳米生物制剂溶液(10μL)和校准溶液(在PBS中的裸ApoA-I)置于96孔板中，添加Bradfort试剂(150μL)，并将混合物在室温下孵育5分钟，然后测量在544nm处的吸光度。绘制了，每种纳米生物制剂的两个不同批次的平均ApoA-I回收率。一式两份准备了所有校准和分析物样品。

图69示出了，每种纳米生物制剂的两个不同批次的平均ApoA-I回收率。一式两份准备了所有校准和分析物样品。我们将对用于体外实验的样品重复此操作，较大的误差线可能是所用方法的重现性较差的结果，而不是代表实际ApoA-I回收率的差异。

通过将等份(50μL)的最终颗粒溶液溶解在MilliQ水(1mL)中，并通过0.22μm的PES注射式过滤器进行过滤，制备用于ζ电位分析的样品。所有样品一式三份进行分析。

图70示出了，MilliQ水中每种纳米生物制剂的ζ电位。样品一式三份进行分析。我们将对用于体外实验的样品重复此步骤。

为了比较纳米生物制剂在类似体内条件下的稳定性，将纳米颗粒在37℃的胎牛血清中进行透析。将颗粒溶液(0.5mL)放在10kDa的透析袋中，将其悬浮在37℃的胎牛血清(45mL)中。在预定的时间点(合成后0、15、30、60、120、360分钟)，从透析袋中取出等份试样(50μL)。将等份试样在真空下干燥，添加乙腈(100μL)，并将溶液超声处理20分钟，然后将剩余的悬浮液离心并通过HPLC进行分析。使用相同批次的纳米生物试剂，一式两份进行透析实验。去除离群值后，使用双指数衰减，拟合获得的动力学数据(以红色表示，144个数据点中的5个)，随后使用拟合的Y轴截距进行标准化。在某些情况下，观察到大量的水解产物。假定这种水解的(前)药已经从纳米生物制剂中泄漏出来，但还没有从透析袋中扩散出来。因此，我们并未将其涵盖在纳米生物制剂随时间推移而保留的药物量的计算值中。

图71示出了，丙二酸衍生物从纳米生物制剂、未官能化的丙二酸二甲酯中的释放，给出了0％的药物回收率，因此没有被透析。使用10kDa透析袋，在37℃的胎牛血清(45mL)中，透析在PBS(0.5mL)中的纳米生物制剂。一式两份进行实验。使用双指数衰减，拟合获得的时间依赖性药物浓度，然后进行标准化。

图72示出了，(+)JQ-1及其衍生物从纳米生物制剂中的释放。使用10kDa透析袋，在37℃的胎牛血清(45mL)中，透析在PBS(0.5mL)中的纳米生物制剂。一式两份进行实验。在去除离群值(红色)后，使用双指数衰减拟合获得的时间依赖性药物浓度，然后进行标准化。

图73示出了，GSK-J4及其衍生物从纳米生物制剂中的释放。使用10kDa透析袋，在37℃的胎牛血清(45mL)中，透析在PBS(0.5mL)中的纳米生物制剂。一式两份进行实验。在去除离群值(红色)后，使用双指数衰减拟合获得的时间依赖性药物浓度，然后进行标准化。

图74示出了，雷帕霉素及其衍生物从纳米生物制剂中的释放。使用10kDa透析袋，在37℃的胎牛血清(45mL)中，透析在PBS(0.5mL)中的纳米生物制剂。一式两份进行实验。使用双指数衰减，无法适当地拟合获得的时间依赖性药物浓度，而是根据在0分钟时的数据点，对数据进行标准化。

图75示出了，PF-4708671从纳米生物制剂中的释放。使用10kDa透析袋，在37℃的胎牛血清(45mL)中，透析在PBS(0.5mL)中的纳米生物制剂。一式两份进行实验。使用双指数衰减拟合获得的时间依赖性药物浓度，然后进行标准化。

现在参考图76，它示出了放射性同位素标记过程的示意图。

在一个非限制性实施例中，可以通过各种类型的螯合剂来实现对驯化免疫抑制剂药物/分子的放射性药物标记，主要是去铁胺B(DFO)，它可以通过3个异羟肟酸酯基团，与

方案

本方案教导了，用

选择放射性同位素

我们纳米疗法的

该方案包括以下步骤：

螯合剂去铁胺B(DFO)与磷脂DSPE缀合，从而形成亲脂性螯合剂(DSPE-DFO)，其易于整合在不同的脂质纳米颗粒平台(～0.5wt％)中；

制备纳米级组装物配制物(使用超声处理，通过热滴或使用微流体的纳米乳剂)，其具有并入的

通过将纳米颗粒与

此外，纯化和表征方法，可用于获得放射化学纯的

使用一般成像策略，通过PET/CT或PET/MRI，研究

图77示出了，使用由纳米生物制剂递送的放射性同位素进行的PET成像，并示出了纳米生物制剂在小鼠、兔子、猴子和猪模型的骨髓和脾脏中的积累。

参照在附图中示出，并且在以下描述中详细描述的非限制性的实施方式，更全面地解释本文中的实施方式，及其各种特征和有利细节。省略了对众所周知的组分和处理技术的描述，以免不必要地使本文的实施方式晦涩难懂。本文中使用的实施例，仅旨在促进对可以实践本文中的实施方式的理解，并进一步使本领域技术人员能够实践本文中的实施方式。因此，实施例不应被解释为限制本文的实施方式的范围。

然而，提供这些实施方式使得本公开是详尽和完整的，并将向本领域技术人员充分传达本发明的范围。全文中，相似的数字表示相似的元素。如本文所用，术语“和/或”包括一个或多个相关列出项目的任何和所有组合。

本文所使用的术语仅出于描述特定实施方式的目的，并不旨于限制本发明的全部范围。如本文所用，除非上下文另有明确说明，否则单数形式的“一(a)”，“一(an)”和“该/所述(the)”，也旨在包括复数形式。将进一步理解的是，当在本说明书中使用术语“包括/包含/含有(comprises)”和/或“包括/包含/含有(comprising)”时，其指定了所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件的存在，但并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元素、组件和/或其组。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语，具有与本领域普通技术人员通常理解相同的含义。本公开中的任何内容均不应解释为，承认本公开中描述的实施方式无权借助现有发明而早于该公开。如本文中所使用的，术语“包括”意思是“包括，但不限于”。

在不脱离其精神和范围的情况下，可以进行许多修改和变化，这对本领域技术人员是显而易见的。除了本文列举的之外，根据前文的描述，本公开范围内的功能等效的方法和设备对于本领域技术人员而言将是显而易见的。这样的修改和变化旨于落入所附的权利要求书的范围内。本公开仅受限于所附权利要求书的术语，以及这些权利要求所赋予的等同物的全部范围。应当理解的是，本公开不限于特定的方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，其当然可以改变。还应理解的是，本文所使用的术语仅出于描述特定实施方式的目的，而并不旨在进行限制。关于本文中基本上任何复数和/或单数术语的使用，本领域技术人员可以根据上下文和/或应用，适当地将复数转换为单数和/或将单数转换为复数。为了清楚起见，本文可以明确地阐述各种单数/复数置换。

所属领域的技术人员将理解，通常，本文中且尤其是在所附权利要求书中使用的术语(例如，所附权利要求书的主体)旨于为“开放式”术语(例如，术语“包括/包含”应解释为“包括/包含，但不限于”，术语“具有”应解释为“至少具有”，术语“含有”应理解为“含有，但不限于”等)。本领域技术人员将进一步理解，实际上，无论是在说明书、权利要求书，还是附图中，呈现两个或更多个替代术语的任何分离词和/或短语，都应理解为考虑了包括这些术语其中之一，两者之一，或两个术语均有的可能性。例如，短语“A或B”应理解为包括“A”或“B”，或“A和B”的可能性。

另外，在以马库什组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员应认识到，由此也根据马库什组的任何单个成员或成员的子集描述了本公开。

如本领域技术人员应理解的，出于任何和所有目的，例如就提供书面说明而言，本文公开的所有范围，还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都可以很容易地识别为充分描述，并且可以将相同范围分解为至少相等的子部分。如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。

上文公开的各种和其他特征和功能，或其替代，可以组合到许多其他不同的系统或应用中。本领域技术人员随后可以在其中进行各种目前无法预料或无法预料的替代、修改、变化或改进，其各自也旨于涵盖在所公开的实施方式中。

在此已经描述了本发明的实施方式，应当注意，根据上述教导，本领域技术人员可以做出修改和变化。因此，应当理解，可以在所公开的本发明的特定实施方式中进行改变，这些改变均在由所附权利要求书限定的本发明的范围和精神内。这样已经按照专利法要求的细节和特殊性描述了本发明，在所附的权利要求书中提出了由专利证书要求保护和期望受到保护的内容。