一种基于荧光能量共振转移机理的双光子探针及应用

技术领域

本发明涉及化学检测技术领域，特别涉及一种基于荧光能量共振转移机理的双光子探针及应用。

背景技术

光气(光气)是一种广泛应用于工业合成的中间体，常常出现在异氰酸酯的合成和聚碳酸酯的生产中。但令人恐怖的是，光气同时是一种毒性很高的无色气体，暴露在光气中会引起一系列的中毒症状，如非心源性肺水肿，肺气肿，严重时甚至会导致死亡。与其他神经毒剂(沙林(Sarin),索曼(Soman),和塔蹦(Tabum))有所不同，光气的生产不易受到法律的严格控制和监禁。现代医学已经证明，暴露在20ppm的光气环境下就会对人体肺部产生危害，甚至超过90ppm可能导致死亡。因此光气的泄露会对公众健康造成极大的威胁。在最近几年，已有数十个检测光气的荧光探针发表，然而这些探针大都基于光诱导电子转移机理(PET)和分子内电荷转移机理(ICT)，同时选择性实验和实际应用实验还有待改善。因此建立一种检测光气的，基于荧光能量共振转移机理(FRET)的双光子探针是及其迫切的。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明所要解决的技术问题是，提供一种基于荧光能量共振转移机理的双光子探针及应用，以5-氟-1,3,7,9-四甲基-5H-二吡咯并[1,3,2]重氮硼烷-4-氟化物作为荧光供体，7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑基团作为受体，构建FRET机理，同时以1,4,7,10-四氮环中的4位和7位的仲胺作为响应位点，实现光气的特异性响应，使探针对光气有优越的选择性。

本发明为实现上述目的采用的技术方案是：一种基于荧光能量共振转移机理的双光子探针，以5-氟-1,3,7,9-四甲基-5H-二吡咯并[1,3,2]重氮硼烷-4-氟化物作为荧光供体，7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑基团作为受体，以强亲核性的两个仲胺为响应位点，其化学名称为，5-氟-1,3,7,9-四甲基-10-(4-(7-(7-硝基苯并[c][1,2,5]恶二唑-4-基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷基十二烷基-1-基)苯基)-5H-二吡咯并[1,2-c：2'，1'-f][1,3,2]二氮杂硼-4-氟化物，其化学结构式为，

本发明还包括一种基于荧光能量共振转移机理的双光子探针的应用，以脱脂棉作为双光子探针的载体，分别在单光子和双光子模式下，实现对安全阈值浓度上或下的气态光气检测、荧光成像及共聚焦成像。

进一步的，所述检测的反应机理为：

以5-氟-1,3,7,9-四甲基-5H-二吡咯并[1,3,2]重氮硼烷-4-氟化物作为荧光供体，7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑基团作为受体，以强亲核性的两个仲胺为响应位点，利用光气结构中强亲电性的碳原子，与其发生两次酰化反应。

进一步的，建立探针对光气响应性的荧光光谱，

(1)配制探针浓度为10mM的三氯甲烷溶液，配制三光气浓度为10mM，且包含摩尔分数为5％的三乙胺的三氯甲烷溶液，即为光气浓度为30mM的溶液；

(2)先在5mL的Ep管中加入10uL的探针溶液，加入2mL三氯甲烷溶液，分别取0μL、1μL、2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7uL、8μL、9μL和10μL浓度为10mM的三光气的溶液共11份，分别加入到Ep管中；

(3)反应1min后，在455nm的激发波长下通过荧光分光光度计测试荧光强度，得到荧光强度和荧光滴定光谱；

(4)一倍当量的三光气在三乙胺的作用下分解为三倍当量的光气，以光气的浓度为横坐标，以荧光强度比值为纵坐标，得到关于探针分子对光气浓度、荧光强度比值的线性方程。

进一步的，建立探针对光气选择性的荧光光谱，

(1)配制浓度为10mM的DCP,DECP,DNCP,POC,(COCl)

(2)先在5mL的Ep管中加入10uL,10mM的探针溶液，加入2mL三氯甲烷溶液，混合均匀，分别取60uL的上述配置好的溶液，分别加入到Ep管中；

(3)反应5min后，通过荧光分光光度计测试荧光强度，得到荧光强度比值，检测光气荧光强度的激发波长为455nm；

(4)以物质种类为横坐标，以荧光强度比值为纵坐标，得到关于探针对光气选择性的柱状图。

进一步的，建立探针对光气的响应时间图谱，

(1)配制探针浓度为10mM的三氯甲烷溶液，配制三光气浓度为10mM，且包含摩尔分数为5％的三乙胺的三氯甲烷溶液；

(2)在5mL的Ep管中加入10uL的探针溶液，加入2mL三氯甲烷溶液，混合均匀，分别取0μL、6μL、12μL、18μL、24μL和30μL浓度为30mM的光气的溶液共6份，分别加入到Ep管中；

(3)反应5min后，通过荧光分光光度计测试荧光强度，得到荧光强度比值，检测光气荧光强度的激发波长为455nm。

进一步的，探针对气态光气进行检测，

(1)将干净的脱脂棉裁剪成1×1cm的小块，将其浸泡在10mM的探针溶液0.5分钟，取出后自然晾干；

(2)分别配制0ppm、10ppm、20ppm、50ppm、75ppm和100ppm的气态光气在100mL锥形瓶中，将含有探针的脱脂棉置于各个锥形瓶中，密封，五分钟后取出置于365nm紫外灯下观察，得到探针与气态光气在实际检测紫外灯下的样品图。

进一步的，探针对气态光气检测的共聚焦成像实验，

(1)将干净的脱脂棉裁剪成1×1cm的小块，将其浸泡在10mM的探针溶液0.5分钟，取出后自然晾干；

(2)将含有探针的脱脂棉置于已配制好的10ppm的气态光气锥形瓶中，密封，五分钟后取出；

(3)将检测前后的含有探针的脱脂棉分别进行共聚焦实验，分别在单光子模式下和双光子模式下进行成像实验，其中单光子模式的激发波长为488nm，双光子模式的激发波长为808nm，收集绿色光通道的共聚焦成像。

本发明基于荧光能量共振转移机理的双光子探针及应用的有益效果是：

(1)荧光能量共振转移机理能够转移能量从供体到受体，因此具有某些特别的性质，如高效的能量转移，较大的斯托克斯位移和优秀的发射信号。本发明的探针是以5-氟-1,3,7,9-四甲基-5H-二吡咯并[1,3,2]重氮硼烷-4-氟化物作为荧光供体，7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑基团作为受体，构建FRET机理，同时以1,4,7,10-四氮环中的4位和7位的仲胺作为响应位点，实现光气的特异性响应，使探针对光气有优越的选择性。

(2)本发明的开放型荧光标记试剂响应灵敏，对光气的响应时间在数秒内。

(3)本发明的开放型荧光标记试剂检测限远远低于光气对人体造成伤害的最低阈值(20ppm)。

(4)本发明的开放型荧光标记试剂，不仅能在单光子模式下响应，同时也能在双光子模式下对光气有响应，双光子模式相比于单光子模式，具有穿透能力更强，光损伤更小，定位更准确等优点。

(5)本发明所用于检测气态光气的探针载体是脱脂棉，具有获取简单，价格低廉，处理方便等优点。

本发明在光气出现的情况下，检测可以在6秒内完成，并且对液态和气态光气的检测限分别为0.36nM和10ppm,远低于危害人体健康的光气阈值浓度20ppm。更为重要的是，应用脱脂棉作为探针载体，并且应用于气态光气的检测，这对于检测光气的发展做出了重要的推动作用。

附图说明

图1是本发明实施例中探针与光气的反应机理示意图；

图2是本发明实施例中探针对光气的荧光滴定图谱；

图3是本发明实施例中探针对光气滴定的线性方程；

图4是本发明实施例中探针对各种干扰物质选择性的柱状图；

图5是本发明实施例中探针对光气的时间稳定性图；

图6是本发明实施例中探针对气态光气滴定的紫外灯下成像图谱；

图7是本发明实施例中探针对气态光气的共聚焦成像图谱。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步详细说明；

实施例1：

一种基于荧光能量共振转移机理的双光子探针，以5-氟-1,3,7,9-四甲基-5H-二吡咯并[1,3,2]重氮硼烷-4-氟化物作为荧光供体，7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑基团作为受体，以强亲核性的两个仲胺为响应位点，其化学名称为，5-氟-1,3,7,9-四甲基-10-(4-(7-(7-硝基苯并[c][1,2,5]恶二唑-4-基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷基十二烷基-1-基)苯基)-5H-二吡咯并[1,2-c：2'，1'-f][1,3,2]二氮杂硼-4-氟化物，其化学结构式为，

本发明还包括一种基于荧光能量共振转移机理的双光子探针的应用，以脱脂棉作为双光子探针的载体，分别在单光子和双光子模式下，实现对安全阈值浓度上或下的气态光气检测、荧光成像及共聚焦成像。

所述检测的反应机理为：

以5-氟-1,3,7,9-四甲基-5H-二吡咯并[1,3,2]重氮硼烷-4-氟化物作为荧光供体，7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑基团作为受体，以强亲核性的两个仲胺为响应位点，利用光气结构中强亲电性的碳原子，与其发生两次酰化反应。如图1所示，反应完成后的探针发出荧光信号。

实施例2：

探针对光气的响应性的荧光光谱性质研究

(1)配制探针浓度为10mM的三氯甲烷溶液，配制三光气浓度为10mM，且包含摩尔分数为5％的三乙胺的三氯甲烷溶液，即为光气浓度为30mM的溶液；

(2)先在5mL的Ep管中加入10uL的探针溶液，加入2mL三氯甲烷溶液，分别取0μL、1μL、2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7uL、8μL、9μL和10μL浓度为10mM的三光气的溶液共11份，分别加入到Ep管中。

(3)反应1min后，通过荧光分光光度计测试荧光强度，得到荧光强度，检测光气荧光强度的激发波长为455nm；得到探针的荧光滴定光谱，见图2。从图中可看出探针在532nm处有弱荧光。

(4)因为一倍当量的三光气在三乙胺的作用下分解为三倍当量的光气，因此以光气的浓度为横坐标，以荧光强度比值为纵坐标，得到关于探针分子对光气浓度、荧光强度比值的线性方程,见图3。图中探针的荧光强度与光气浓度(0-30μM)呈线性关系(R

实施例3：

探针对光气的选择性的光谱性质研究

(1)配制浓度为10mM的DCP,DECP,DNCP,POC,(COCl)

(2)先在5mL的Ep管中加入10uL,10mM的探针溶液，加入2mL三氯甲烷溶液，混合均匀。分别取60uL的上述配置好的溶液，分别加入到Ep管中。

(3)反应5min后，通过荧光分光光度计测试荧光强度，得到荧光强度比值，检测光气荧光强度的激发波长为455nm；

(4)以物质种类为横坐标，以荧光强度比值为纵坐标，得到关于探针对光气选择性的柱状图，见图4。

图中光气的加入引发了明显的荧光增强和明亮的绿色荧光，表明探针对光气有很好的选择性。探针对光气的选择性高的原因为：探针具有两个高活性胺基及光气中的碳原子具有极强的亲电性。

实施例4：

探针对光气的响应时间图谱

(1)配制探针浓度为10mM的三氯甲烷溶液，配制三光气浓度为10mM，且包含摩尔分数为5％的三乙胺的三氯甲烷溶液；

(2)先在5mL的Ep管中加入10uL的探针溶液，加入2mL三氯甲烷溶液，混合均匀。分别取0μL、6μL、12μL、18μL、24μL和30μL浓度为30mM的光气的溶液共6份，分别加入到Ep管中。

(3)反应5min后，通过荧光分光光度计测试荧光强度，得到荧光强度比值，检测光气荧光强度的激发波长为455nm，见图5。如图所示，在不同浓度光气的作用下，537nm处的荧光强度在6s内迅速增强到平台状态，并保持稳定，表明探针与光气的反应已经完成，且探针对光气表现出较好的快速、明显的荧光“启动”反应。基于上述光谱实验结果，探针作为一种合格的传感器，有望成为定量检测溶液中光气浓度的可靠工具。

实施例5：

探针对气态光气的检测

(1)将干净的脱脂棉裁剪成1×1cm的小块，将其浸泡在10mM的探针溶液0.5分钟，取出后自然晾干。

(2)分别配制0ppm、10ppm、20ppm、50ppm、75ppm和100ppm的气态光气在100mL锥形瓶中。将含有探针的脱脂棉置于各个锥形瓶中，密封，五分钟后取出置于365nm紫外灯下观察，得到探针与气态光气的实际检测紫外灯下样品图，见图6。由于探针具有良好的光学性能和优异的溶液传感性能，因此可利用探针方便地检测气相光气。选择脱脂棉作为装载探针的载体。将探针包埋脱脂棉置于不同浓度的光气(0、10、20、50、75、100ppm)中浸泡5min。然后，在365nm紫外灯照射下，图5中探针包埋脱脂棉的荧光图像变为亮绿色。暴露于20ppm的光气中可在2min内造成肺损伤，90ppm的光气在30min内迅速致死。在实际应用中，探针能够准确地检测出危险范围内的10ppm光气浓度，说明探针具有检测和定量低于安全阈值的光气的能力。

实施例6：

探针对气态光气检测的共聚焦成像实验

(1)将干净的脱脂棉裁剪成1×1cm的小块，将其浸泡在10mM的探针溶液0.5分钟，取出后自然晾干。

(2)将含有探针的脱脂棉置于已配制好的10ppm的气态光气锥形瓶中，密封，五分钟后取出。

(3)将检测前后的含有探针的脱脂棉分别进行共聚焦实验，分别在单光子(激发波长为488nm)模式下和双光子(激发波长为808nm)模式下进行成像实验，收集绿色光通道的成像，见图7。与单光子模式相比，双光子模式具有激发局部化、光损伤小、观察时间长等优点。为探讨探针的应用效果，采用共聚焦显微成像技术对光气作用前后含有三种化学传感器的脱脂棉进行了检测。如图6所示光气作用下的脱脂棉探针在绿色通道(490-660nm)上表现出由弱荧光到增强荧光的明显转变。探针包埋脱脂棉在光气照射前后，在单光子和双模式下均能成功地显示出明显的荧光变化，符合荧光强度的变化趋势，验证了探针具有合理检测光气的能力。

由于荧光供体5-氟-1,3,7,9-四甲基-5H-二吡咯并[1,3,2]重氮硼烷-4-氟化物具有双光子响应的特性，在探针与光气反应后，FRET机理消失，逐渐恢复供体的荧光，因此显示出了双光子响应的特性。

本发明实施例中高效液相-质谱分析是利用Agilent 1100质谱系统(Agilent,USA)，并配备脱气装置、四元泵、自动进样器，高效液相色谱分离是借助Hypersil GOLD C18柱(2.1mm×50mm,1.8μm i.d.,Agilent,USA)来完成。荧光检测是利用日立Hitachi F-4600荧光光谱仪来进行，对光气检测激发波长为455nm，激发和发射狭缝宽度均为5.0nm，电压450V，扫描速度2400纳米/分。荧光成像观测是通过Olympus Fluo View FV1000(日本)共聚焦来进行，用40倍物镜观察。化合物的分离纯化是采用薄层色谱硅胶柱实现，其中，填料为300-400目。

上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所做出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。