一种固定破膜剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及流式细胞仪检测技术领域，尤其涉及一种固定破膜剂及其制备方法。

背景技术

随着流式细胞术的飞速发展，应用流式细胞术结合细胞内染色技术检测胞内细胞因子是近年来建立的一种新方法，可在单细胞水平同时检测两种或者更多种细胞因子，由于具有特异性强、相对快速和准确定量等特点，目前已得到广泛的应用。

当免疫细胞的免疫应答较为微弱时，分泌的细胞因子水平难以被仪器所检测到，因此在检测时采用刺激剂体外刺激激活淋巴细胞，然后加入蛋白转运抑制剂阻止细胞因子分泌到细胞外，使刺激活化的细胞因子滞留在胞内，然后细胞固定和破膜检测细胞内细胞因子，细胞固定液和破膜液的选择十分重要，固定细胞可保持细胞的形态使之耐受破膜处理，避免破膜后细胞破碎；破膜剂是将细胞膜打孔，使细胞因子抗体穿过细胞膜进入细胞内，与胞内细胞因子特异性结合。

流式细胞术在检测胞内细胞因子过程中，细胞的固定与破膜是否恰当对实验结果有较大的影响，目前国内很多医院和实验室使用的破膜剂主要来自国外公司，国内还没有与国外媲美的产品，但普遍存在价格昂贵，国内厂家固定破膜剂，固定破膜后引起细胞的光散射变化较大，对抗原表达水平的检测结果产生影响，在实验前要对实验条件进行优化，增加实验操作步骤。

综上所述，需要一种固定破膜剂及其制备方法来解决现有技术中所存在的不足之处。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种固定破膜剂及其制备方法，旨在解决上述问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种固定剂，其成分和配比为：

进一步的，固定剂的pH值为7.0-7.4。

一种固定剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：准确称量磷酸二氢钠，二水、磷酸氢二钠、和氯化钠至烧杯中，加入适量的超纯水，搅拌混匀，充分溶解；

步骤二：准确称量多聚甲醛至烧杯中，加入步骤一制成的溶液中，磁力搅拌器加热搅拌，温度控制在60℃以下，直至完全溶解，用10N NaOH溶液调pH值至7.0-7.4；

步骤三：调完pH后，用量筒向烧杯内加入超纯水，定容至配制体积，搅拌混匀，室温避光保存。

一种破膜剂，其成分和配比为：

进一步的，破膜剂的pH值为7.0-7.4。

一种破膜剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：准确称量磷酸二氢钠，二水、磷酸氢二钠、氯化钠、皂素和BSA至烧杯中，加入适量的超纯水，搅拌混匀，充分溶解；

步骤二：准确量取NP40、Tween20和Proclin 950，加入步骤一制成的溶液中，搅拌混匀，直至完全溶解，用10N NaOH溶液调pH值至7.0-7.4；

步骤三：调完pH后，用量筒向烧杯内加入超纯水，定容至配制体积，搅拌混匀；

步骤四：用0.22μm的滤膜将步骤三搅拌均匀后的溶液过滤后，室温避光保存。

本发明的有益效果：通过本发明的实施，在检测特异性和灵敏性方面具有较好的效果，并且，检测成本较低，稳定性高、操作较为简单、重复性高，能够保证结果的可靠性。

附图说明

图1为进口固定破膜剂与本发明的固定破膜剂检测Th1、Th2和Th17流式检测结果比较，其中：

图1-1为进口固定破膜剂检测IFN-γ(Th1细胞Marker)流式图；

图1-2为进口固定破膜剂检测IL4(Th2细胞Marker)流式图；

图1-3为进口固定破膜剂检测IL17A(Th17细胞Marker)流式图；

图1-4为本发明固定破膜剂检测IFN-γ(Th1细胞Marker)流式图；

图1-5为本发明固定破膜剂检测IL4(Th2细胞Marker)流式图；

图1-6为本发明固定破膜剂检测IL17A(Th17细胞Marker)流式图。

图2为进口固定破膜剂与本发明的固定破膜剂检测MPO流式检测结果比较，其中：

图2-1为进口固定破膜剂检测MPO流式图；

图2-2为本发明固定破膜剂检测MPO流式图。

具体实施方式

实施例1：

一种固定剂，其成分和配比为：

固定剂的pH值为7.2。

一种固定剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：准确称量磷酸二氢钠，二水、磷酸氢二钠、和氯化钠至烧杯中，加入适量的超纯水，搅拌混匀，充分溶解；

步骤二：准确称量多聚甲醛至烧杯中，加入步骤一制成的溶液中，磁力搅拌器加热搅拌，温度控制在60℃以下，直至完全溶解，用10N NaOH溶液调pH值至7.2；

步骤三：调完pH后，用量筒向烧杯内加入超纯水，定容至配制体积，搅拌混匀，室温避光保存。

一种破膜剂，其成分和配比为：

进一步的，破膜剂的pH值为7.2。

一种破膜剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：准确称量磷酸二氢钠，二水、磷酸氢二钠、氯化钠、皂素和BSA至烧杯中，加入适量的超纯水，搅拌混匀，充分溶解；

步骤二：准确量取NP40、Tween20和Proclin 950，加入步骤一制成的溶液中，搅拌混匀，直至完全溶解，用10N NaOH溶液调pH值至7.0-7.4；

步骤三：调完pH后，用量筒向烧杯内加入超纯水，定容至配制体积，搅拌混匀；

步骤四：用0.22μm的滤膜将步骤三搅拌均匀后的溶液过滤后，室温避光保存。

实施例2：

如图1所示，人Th1/2/17流式检测：

步骤一：取250μl抗凝血加入至流式管中，加入250μl不含血清的1640培养基，涡旋振荡混匀，加入2μl PMA/Ionomycin Mixture(250×)和2μl BFA/Monensin Mixture(250×)，涡旋振荡混匀，取250μl抗凝血加入至流式管中，加入250μl不含血清的1640培养基，作为阴性对照，涡旋振荡混匀放于二氧化碳细胞培养箱孵育4-6小时，每隔1小时涡旋振荡混匀一次；

步骤二：从样本管和对照管中取100μl细胞悬液至新的流式管中，加入5μl Anti-Human CD3,FITC和5μl Anti-HumanCD8α,PerCP-Cy5.5，涡旋振荡混匀，室温避光孵育15分钟；

步骤三：每管加入100μl固定剂，涡旋振荡混匀，室温避光孵育15分钟；

步骤四：孵育结束后，每管加入2ml 1×PBS，涡旋振荡混匀，1500rpm离心5分钟，弃上清；

步骤五：每管加入100μl破膜剂和5μl Anti-Human IFN-γ,PE(Th1)或5μl Anti-Human IL-4,APC(Th2)或5μl Anti-Human IL17A,PE(Th17)，涡旋振荡混匀，室温避光孵育15分钟；

步骤六：孵育结束后，每管加入2ml 1×PBS，涡旋振荡混匀，1500rpm离心5分钟，弃上清；

步骤七：每管加入500μl 1×PBS重悬，流式上机检测。

实施例3：

步骤一：取100μl抗凝血加入流式管中，加入100μl固定剂，涡旋振荡混匀，室温避光孵育15分钟；

步骤二：孵育结束后，每管加入2ml 1×PBS，涡旋振荡混匀，1500rpm离心5分钟，弃上清；

步骤三：每管加入100μl破膜剂和5μl Anti-Human Myeloperoxidase(MPO),FITC，涡旋振荡混匀，室温避光孵育15分钟；

步骤四：孵育结束后，每管加入2ml 1×PBS，涡旋振荡混匀，1500rpm离心5分钟，弃上清；

步骤五：每管加入500μl 1×PBS重悬，流式上机检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。