一种脂蛋白a检测试剂盒及检测方法
文献发布时间:2023-06-19 09:38:30
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂技术领域,具体涉及一种脂蛋白a检测试剂盒及检测方法。
背景技术
脂蛋白(a)即lipoprotein(a),是一种由肝脏合成的富含胆固醇的特殊大分子脂蛋白,它由一个脂质核心、apoB-100分子、以及其外围的亲水性的apo(a)三部分组成。主要在肝脏合成后分泌入血,在致动脉粥样硬化过程中起着极其重要的作用。脂蛋白(a)与冠心病、钙化性主动脉瓣狭窄、家族性高胆固醇血症、外周血管疾病等密切相关,并已成为公认的冠心病独立预测因子。
目前,已知的检测脂蛋白(a)浓度的方法有酶联免疫吸附法,放射免疫法,免疫比浊法等检测方法,这些方法均存在一定的缺点。如:放射免疫法有放射性污染;酶联免疫吸附法操作复杂、耗时长,对操作者有一定的技能要求;免疫比浊法与纤溶酶原有交叉污染,因此测定的准确度也就比较低,需要进行改进。胶乳颗粒增强免疫比浊法是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法,其原理是:在高分子胶乳微球的表面交联单克隆或多克隆抗体,当交联有抗体的微球与抗原结合后,在短时间内会迅速聚集在一起,改变了反应液的散光性能或透光性能,反应液透光性能(即吸光度)的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性,在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。
研究表明,采用胶乳颗粒增强免疫比浊法进行检测会受到多种因素的干扰而产生假阳性结果,如:1)反应环境中存在的疏水性物质会与抗原/抗体或胶乳通过疏水作用结合,导致胶乳颗粒增强免疫比浊法检测脂蛋白(a)时产生假阳性;2)血清和组织液中的补体分子会与抗体的Fc段和C1q补体结合位点结合,而产生假阳性;3)血清中类风湿性因子与包被或标记的抗体的Fc段结合产生假阳性结果。
虽然现有技术针对脂蛋白(a)含量的检测已经研发不少基于胶乳颗粒增强免疫比浊法原理的检测试剂盒,如专利公开号为CN 103149370 A、CN106990234 A、CN 107607729A、CN 111239422 A、CN 109541241 A等中国发明专利,但上述的专利并没有解决体外诊断试剂中疏水作用、补体、类风湿性因子等因素引致的非特异性干扰的问题。
另一方面,现有技术制备的抗体包被胶乳颗粒稳定性较差,将抗体偶联至羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒,即时检测效果很好,但是置于37℃2天后,抗体活性下降较大,且胶乳发生凝集现象,导致试剂盒使用的重复性不好、变异系数增大,直接导致试剂检测结果不准确,不能满足使用要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种脂蛋白a检测试剂盒及检测方法,采用该检测试剂盒可以消除疏水作用、补体、类风湿性因子等因素引致的非特异性干扰的问题,具有抗干扰能力强、特异性高、准确度高、稳定性好等优点,并且操作方便、便于推广应用。
本发明是通过以下技术方案予以实现的:
一种脂蛋白a检测试剂盒,包括试剂R1、试剂R2和校准品,其特征在于,所述的试剂R1包括第一缓冲液50~250mmol/L、抗干扰剂1~2wt%、促进剂1~2.5wt%、防腐剂0.01~0.1wt%;所述的试剂R2包括第二缓冲液50~250mmol/L、稳定剂0.5~5wt%、抗人脂蛋白a单克隆抗体包被胶乳颗粒0.1~2g/L、防腐剂0.02~0.2wt%。
优选地,所述的第一缓冲液、第二缓冲液各自独立地选自MOPS缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、Tris-HCl缓冲液中的至少一种。所述的缓冲溶液的pH值范围为:6.5~8.5。
优选地,所述的抗干扰剂为麦角硫因(L-Ergothioneine,EGT,化学名为2-巯基组氨酸三甲基内盐)和TCEP-HCl(三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐)以1:(1~2)的质量比组成。
更优选地,所述的抗干扰剂为麦角硫因和TCEP-HCl以1:1.5的质量比组成。
优选地,所述的稳定剂选自甘露寡聚糖、羧甲基葡聚糖、蔗糖、海藻糖、甘油、甘露醇、山梨醇中的至少一种。
更优选地,所述的稳定剂为甘露寡聚糖和甘油以质量比1:(2~4)的质量比组成。
优选地,所述的促进剂为聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、吐温-20或吐温-80。
优选地,所述的防腐剂为Proclin300或NaN
优选地,所述的抗人脂蛋白a单克隆抗体包被胶乳颗粒中抗人脂蛋白a单克隆抗体和胶乳颗粒共价结合,采用化学交联法将单克隆抗体包被于胶乳颗粒中。其中,抗人脂蛋白a单克隆抗体为羊抗人、鼠抗人或兔抗人脂蛋白a单克隆抗体;胶乳颗粒为表面带有羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒,颗粒的粒径为50~300nm。优选地,所述的胶乳颗粒中粒径为50nm、100nm、300nm的胶乳颗粒的占比(质量比)分别为:2:3:1。
所述的抗人脂蛋白a单克隆抗体包被胶乳颗粒采用常规的化学交联法进行制备,具体步骤为:
(1)制备抗人脂蛋白a抗体溶液:取抗人脂蛋白a单克隆抗体溶于Tris-HCl缓冲液中,pH为7.2,制得浓度为1.0mg/mL的抗人脂蛋白a抗体溶液;
(2)制备胶乳微球悬浮液:取表面带有羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒溶解于Tris-HCl缓冲液中,浓度为1%(w/v),加入终浓度为50mg/mL NHS和100mM EDAC,室温下孵育30min,离心(15000rpm,30min),弃上清,用相同体积的Tris-HCl缓冲液洗涤胶乳微球两次,去除多余的交联剂,加入Tris-HCl缓冲液,震荡重悬,制得浓度为1%(w/v)的胶乳微球悬浮液;
(3)制备抗人脂蛋白a单克隆抗体包被胶乳颗粒:将步骤(1)得到的抗人脂蛋白a抗体溶液和步骤(2)得到的胶乳微球悬浮液按体积比1:1混匀,37℃孵育3h,每mL反应液中加入2mL乙醇胺混匀,37℃封闭30min,离心(15000rpm,30min),弃上清,用相同体积的Tris-HCl缓冲液洗涤两次,去除未结合的抗体,加入Tris-HCl缓冲液,震荡重悬,得到抗人脂蛋白a单克隆抗体包被胶乳颗粒。
本发明还提供一种用于非疾病诊断治疗目的的利用上述的试剂盒检测脂蛋白a含量的方法,该方法包括以下步骤:
(1)取待测样品,加入所述试剂R1,反应4~6min后,加入所述试剂R2混匀,读取吸光度A1,继续反应4~6min后,读取吸光度A2,计算ΔA=A2-A1;
(2)使用所述脂蛋白a校准品绘制标准曲线,并根据ΔA和标准曲线得到待测样品中脂蛋白a的含量。
优选地,上述的检测方法中,所述的待测样品、试剂R1和试剂R2的体积比为2:(120~180):(30~60),反应温度为37℃,检测波长为600nm。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
1、本发明创造性的使用2-巯基组氨酸三甲基内盐(麦角硫因)和三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)按一定质量比复配组成的抗干扰剂,可有效消除补体、类风湿性因子等因素引致的非特异性干扰的问题,显著提高试剂检测的灵敏度、准确度和特异性。
2、本发明使用的抗干扰剂不仅可以显著增强试剂盒检测的抗干扰能力,还能协助稳定剂改善检测试剂的稳定性,所述的麦角硫因和TCEP-HCl具有一定的离子螯合作用和抗氧化作用,有效保护抗体活性,保持抗体蛋白空间结构稳定,避免抗体在保存过程中失活,提高检测结果的准确度。
3、本发明使用甘露寡聚糖和甘油以一定质量比组成的稳定剂,可有效保护抗体的活性及防止胶乳颗粒的凝集、下沉,延长检测试剂的使用有效期,改善试剂盒检测的重复性,提高检测的稳定性。
综上所述,采用本发明的检测试剂盒可以消除疏水作用、补体、类风湿性因子等因素引致的非特异性干扰的问题,具有抗干扰能力强、特异性高、准确度高、稳定性好等优点,并且操作方便、便于推广应用。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明,而不是对本发明的限制。下述实施例中试剂,若无特别说明,均为市售产品。
下述实施例各试剂盒中的抗体包被胶乳颗粒均为:羊抗人脂蛋白a单克隆抗体包被胶乳颗粒,其制备步骤为:
(1)制备羊抗人脂蛋白a抗体溶液:取羊抗人脂蛋白a单克隆抗体(北京阿匹斯生物科技有限公司)溶于Tris-HCl缓冲液中,pH为7.2,制得浓度为1.0mg/mL的羊抗人脂蛋白a抗体溶液;
(2)制备胶乳微球悬浮液:取表面带有羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒溶解于Tris-HCl缓冲液中,浓度为1%(w/v),加入终浓度为50mg/mL NHS和100mM EDAC,室温下孵育30min,离心(15000rpm,30min),弃上清,用相同体积的Tris-HCl缓冲液洗涤胶乳微球两次,去除多余的交联剂,加入Tris-HCl缓冲液,震荡重悬,制得浓度为1%(w/v)的胶乳微球悬浮液;
(3)制备羊抗人脂蛋白a单克隆抗体包被胶乳颗粒:将步骤(1)得到的羊抗人脂蛋白a抗体溶液和步骤(2)得到的胶乳微球悬浮液按体积比1:1混匀,37℃孵育3h,每mL反应液中加入2mL乙醇胺混匀,37℃封闭30min,离心(15000rpm,30min),弃上清,用相同体积的Tris-HCl缓冲液洗涤两次,去除未结合的抗体,加入Tris-HCl缓冲液,震荡重悬,得到羊抗人脂蛋白a单克隆抗体包被胶乳颗粒。
实施例1:脂蛋白a的测定试剂盒
一种脂蛋白a检测试剂盒,包括试剂R1、试剂R2和校准品。
试剂R1:MOPS缓冲液50mmol/L、麦角硫因0.4wt%、TCEP-HCl 0.6wt%、吐温-201wt%、Proclin300 0.01wt%;
试剂R2:甘氨酸缓冲液50mmol/L、甘露寡聚糖0.17wt%、甘油0.33wt%、羊抗人脂蛋白a单克隆抗体包被胶乳颗粒0.5g/L、Proclin300 0.02wt%。
校准品:脂蛋白a抗原用标准品稀释液(甘氨酸缓冲液40mmol/L、吐温-20 1wt%、Proclin300 0.03wt%、甘露寡聚糖0.17wt%、甘油0.33wt%)溶解,用市售对照试剂检测并调整至150mg/L,分装保存于-20℃。使用前取出,并用标准品稀释液稀释成不同浓度的脂蛋白a标准品(脂蛋白a抗原浓度:0mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L、100mg/L)。然后用0.65μm的滤膜过滤除菌,放置2~8℃保存。
所述的MOPS缓冲液和甘氨酸缓冲液的pH值为:7.5。
实施例2:脂蛋白a的测定试剂盒
一种脂蛋白a检测试剂盒,包括试剂R1、试剂R2和校准品。
试剂R1:磷酸盐缓冲液150mmol/L、麦角硫因0.5wt%、TCEP-HCl 1wt%、聚乙二醇8000 2wt%、NaN
试剂R2:磷酸盐缓冲液100mmol/L、甘露寡聚糖0.5wt%、甘油2wt%、羊抗人脂蛋白a单克隆抗体包被胶乳颗粒1g/L、NaN
校准品:脂蛋白a抗原用标准品稀释液(磷酸盐缓冲液100mmol/L、聚乙二醇80002wt%、NaN
所述的磷酸盐缓冲液的pH值为:8.0。
实施例3:脂蛋白a的测定试剂盒
一种脂蛋白a检测试剂盒,包括试剂R1、试剂R2和校准品。
试剂R1:4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液200mmol/L、麦角硫因1wt%、TCEP-HCl1wt%、聚乙二醇6000 2wt%、NaN
试剂R2:磷酸盐缓冲液200mmol/L、甘露寡聚糖1wt%、甘油3wt%、抗人脂蛋白a单克隆抗体包被胶乳颗粒1.5g/L、NaN
校准品:脂蛋白a抗原用标准品稀释液(磷酸盐缓冲液100mmol/L、聚乙二醇60002wt%、NaN
所述的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、磷酸盐缓冲液的pH值为:8.5。
实施例4:脂蛋白a的测定试剂盒
一种脂蛋白a检测试剂盒,包括试剂R1、试剂R2和校准品。
试剂R1:磷酸盐缓冲液250mmol/L、麦角硫因0.8wt%、TCEP-HCl 1.2wt%、聚乙二醇6000 2.5wt%、NaN
试剂R2:甘氨酸缓冲液250mmol/L、甘露寡聚糖1.25wt%、甘油3.75wt%、抗人脂蛋白a单克隆抗体包被胶乳颗粒2g/L、NaN
校准品:脂蛋白a抗原用标准品稀释液(甘氨酸缓冲液100mmol/L、聚乙二醇60002wt%、NaN
所述的磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液的pH值为:7.0。
对比例1:脂蛋白a的测定试剂盒
对比例1的试剂盒与实施例4的区别在于:不含有抗干扰剂,其余的试剂盒组成与实施例4相同。
对比例2:脂蛋白a的测定试剂盒
对比例2的试剂盒与实施例4的区别在于:抗干扰剂为麦角硫因,其余的试剂盒组成与实施例4相同。
对比例3:脂蛋白a的测定试剂盒
对比例3的试剂盒与实施例4的区别在于:抗干扰剂为TCEP-HCl,其余的试剂盒组成与实施例4相同。
对比例4:脂蛋白a的测定试剂盒
对比例4的试剂盒与实施例4的区别在于:以EDTA-2Na替换麦角硫因,其余的试剂盒组成与实施例4相同。
对比例5:脂蛋白a的测定试剂盒
对比例5的试剂盒为中国专利公布CN 106990234 A所述的试剂盒。
实施例5:脂蛋白a的检测
利用全自动生化分析仪按照以下步骤进行检测:
(1)绘制标准曲线:利用校准品进行多点校准,以校准品的吸光度变化值ΔA=A标准-A空白为纵坐标,其相应浓度C标准为横坐标绘制标准曲线;
(2)检测待测样本:取2μL人血清样本,加入120μL试剂R1,混匀,37℃反应5min后,加入30μL试剂R2,混匀,静置30s,在600nm的波长下读取吸光度A1,37℃继续反应5min后,在600nm的波长下读取吸光度A2,计算ΔA=A2-A1;
(3)根据ΔA和标准曲线计算得到待测样品中脂蛋白a的含量。
(1)准确度检测:取实施例1-4和对比例1-5所述的试剂盒按照上述检测步骤分别对脂蛋白a抗原浓度为80mg/L的质控品进行测定,重复测定5次,计算测定值的平均值和相对偏差,相对偏差=[(实测平均值-理论值)/理论值]×100,检测结果如表1所示。
表1、准确度检测结果
结果显示,采用本发明提供的试剂盒进行检测的相对偏差较少,表明本发明提供的试剂盒准确度较高,效果优于对比例1-5的试剂盒。
(2)精密度检测:对脂蛋白a浓度为40mg/L的同一样品进行多次反复测定含量,按照上述步骤进行测定,样本重复检测20次,计算测定值的平均值、标准差(SD)和变异系数(CV),CV=(标准差/平均值)×100%,检测结果如表2所示。
表2、精密度检测结果
结果显示,采用本发明提供的试剂盒进行检测的变异系数CV<5%,表明本发明提供的试剂盒精密度较高,效果优于对比例1-5的试剂盒。
(3)线性检测:
使用实施例4的试剂盒对6不同浓度的脂蛋白a标准品0mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L、100mg/L进行检测,每个梯度浓度检测5次,取平均值,对测定值的平均值和标准品的理论浓度作回归分析,X轴表示理论浓度,Y轴表示测定值均值,检测结果如表3所示。
表3、线性检测结果
得到的线性回归方程为:y=0.9929x-0.2536,相关系数:R
(4)稳定性检测:
在2-8℃贮存条件下,分别在1月、3月、12月使用实施例1-4和对比例1-5的试剂盒对同一血清样本(脂蛋白a浓度为40mg/L)进行测定,样本重复测定10次,计算样本浓度测定的平均值,标准差(SD)和变异系数(CV),检测结果如表4所示。
表4、稳定性检测结果
结果显示,采用实施例1-4的试剂盒在1月、3月、12月对同一血清样本进行测定,测得的变异系数CV<5%,表明实施例1-4的试剂盒重复性好,性能稳定,测量准确。对比例1的试剂盒在3月检测时CV>5%,对比例2和5的试剂盒在12月检测时CV>5%,表明对比例1、2、5的试剂盒重复性不好,性能不稳定,测量不准确。对比例3和4的试剂盒在12月检测时CV接近5%,稳定性相对实施例1-4的试剂盒较差。
(5)抗类风湿性因子干扰检测:
在同一份人血清样本中分别加入100、400、800、1000、1200IU/mL的类风湿性因子(RF),采用实施例4和对比例1-5的试剂盒分别检测各样本中脂蛋白a的浓度,同一待测样品重复检测3次,与空白对照(未加入类风湿性因子的血清)作对比,计算相对偏差(相对偏差绝对值≤10%表示对测值无影响),检测结果如表5所示。
表5、抗类风湿性因子干扰检测结果
结果显示,实施例4的试剂盒在类风湿性因子≤1200IU/mL,对测值没有影响;对比例1和5的试剂盒在类风湿性因子≤800IU/mL,对测值没有影响。对比例2的试剂盒在类风湿性因子≤1000IU/mL,对测值没有影响。对比例3、4的试剂盒虽然在类风湿性因子≤1200IU/mL,对测值没有影响,但是抗干扰能力明显差于实施例4的试剂盒。
(5)抗补体干扰检测:
在同一份人血清样本中分别加入0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mg/mL的补体C3,采用实施例4和对比例1-5的试剂盒分别检测各样本中脂蛋白a的浓度,同一待测样品重复检测3次,与空白对照(未加入补体C3的血清)作对比,计算相对偏差(相对偏差绝对值≤10%表示对测值无影响),检测结果如表6所示。
表6、抗补体干扰检测结果
结果显示,实施例4的试剂盒在补体C3≤2.0mg/mL,对测值没有影响;对比例1的试剂盒在补体C3≤1.6mg/mL,对测值没有影响。对比例5的试剂盒在补体C3≤1.2mg/mL,对测值没有影响。对比例2、3、4的试剂盒虽然在补体C3≤2.0mg/mL,对测值没有影响,但是抗干扰能力明显差于实施例4的试剂盒。
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出的是,上述优选实施方式不应视为对本发明的限制,本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明的精神和范围内,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
- 一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒及其检测方法
- 一种脂蛋白a检测试剂盒及检测方法