用于稀有种类亲和定向富集的组合物和方法

本申请要求于2018年2月26日提交的美国临时申请号62/635257的权益。这些和所有其他参考的外部材料通过引用以其整体并入本文。当通过引用并入的参考文献中的术语的定义或使用与本文提供的该术语的定义不一致或相反时，以本文提供的术语的定义为准。

技术领域

本发明的领域是从混合物，具体是从核酸中分离或富集稀有分子种类。

背景技术

背景技术描述包括可用于理解本发明的信息。不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明有关，或明确或隐含引用的任何出版物为现有技术。

稀有多核苷酸靶标，例如癌细胞中发现的突变DNA或样本以及血液中发现的任何靶标基因，出现在如此环境中，其中大多数多核苷酸靶标代表野生型基因的序列。这些稀有多核苷酸靶标中的许多靶标具有与野生型序列几乎相同的序列，并且使用常规的基于杂交的方法(例如PCR)无法轻易地与野生型序列区分开。例如，如果这种稀有的多核苷酸靶标具有单个核苷酸变化(例如SNP)或小(即20个核苷酸或更少)的插入或缺失，则很难从含有大大过量的野生型多核苷酸的混合物(例如，在血浆或组织样本中)中分离或鉴定。

从组织样本或血浆(其可含有99.0-99.9％或更多的相应野生型序列)中分离携带癌症相关突变或稀有核酸(例如0.1％至1％)的多核苷酸是非常复杂的任务。例如，授予Albert等人的美国专利申请公开号2008/0194414描述了使用固定化的寡核苷酸探针选择性地捕获从基因组DNA生成的多核苷酸片段，以降低所得多核苷酸混合物的复杂性。本文所有出版物通过引用并入，其程度如同每个单独出版物或专利申请被明确地和单独地指示为通过引用并入一样。当在并入的参考文献中术语的定义或使用与本文提供的术语的定义不一致或相反时，本文提供的该术语的定义适用，而参考文献中该术语的定义不适用。然而，令人怀疑的是，这种方法能否充分地区分包含单个核苷酸差异的稀有DNA靶序列和大大过量存在的相应野生型序列，因为例如部分序列重叠和高G/C含量的因素可干扰选择性。

在授予Rabinowitz的美国专利申请号2015/0072872中描述的另一种方法中，可通过使用多个多态基因座的捕获选择性富集胎儿DNA，来将胎儿染色体DNA与亲代染色体DNA(其是相似的，并且大量过量的存在)分离。然而，这种方法不容易应用于鉴定携带单核苷酸多态性的特异性稀有基因序列。

在如授予Shengrong的美国专利申请号2016/0304954中描述的另一方法中，通过环化多核苷酸群体、扩增环化的多核苷酸并测序扩增的多核苷酸来鉴定针对野生型多核苷酸背景以低频率发生的突变序列。序列的比较可用于鉴定序列变体。然而，这种方法非常耗时且是设备密集的，并且必须限于容易环化的序列。另外，还不清楚稀有突变序列可以以多低的频率出现并通过这种方法仍然能容易地鉴定。

在如美国专利申请公开号2017/0029875(授予Zhang和Wang)中描述的另一种方法中，使用一对核酸探针选择性地鉴定与过量存在的野生型等位基因非常相似的稀有等位基因。这些中的一个(“Probe”)与稀有等位基因互补，而剩余的探针(“Sink”)与野生型序列互补且过量存在。核酸探针之间的竞争通过使大大过量的野生型等位基因核酸不可用于杂交，从功能上提高了“Probe”对稀有等位基因的特异性。但是，这种方法通常不适用，并且可能证明对于较长的序列和具有高G/C比的序列具有挑战性。

授予Vogelstein等人的美国专利申请公开号2017/005134描述了一种方法，其中将大量独特的序列标识符移植到较小的分析物核酸序列群体上，然后进行大规模平行测序。随后统计分析生成由不同的独特标识符组成的家族，这些不同的独特标识符与相同或相似的分析物核酸序列偶联。如果该家族的所有成员都包含突变，则认为该突变是原始分析物核酸序列的一部分；如果不是所有成员均显示突变，则将其视为扩增伪像。突变和扩增伪像之间的这种改善的差别可以提高稀有突变鉴定的保真度。

因此，仍然需要用于从含有大大过量的相似种类的环境中选择稀有靶标种类的有效方法。

发明内容

本发明的主题提供了用于从包含占主导的相关分子种类的混合物中选择性提取稀有分子种类并随后释放它们的组合物和方法。组合物包括具有靶标特异性靶向部分、保护部分、易断裂或可裂解位点或部分以及捕获部分的分离探针(segregating probe)。靶向部分和靶标稀有种类之间的复合物形成导致可裂解位点的保护。此类复合物通过针对分离探针的可裂解位点或部分的裂解步骤而保持完整。尽管在分离探针和相关但非靶标种类之间可以发生复合物形成，但这种复合物中，可裂解位点没有受到保护。针对捕获部分的后续捕获步骤选择性地从一般环境中捕获或分离靶标稀有种类，可以通过洗涤将其移出。随后从分离探针释放靶标稀有种类提供了富含靶标稀有种类的溶液。

本发明构思的一个实施方式是通过使分离探针与包括稀有种类和相关普通种类的混合物的样品接触以形成第一反应混合物来分离稀有种类的方法，其中普通种类以超过稀有种类至少5倍摩尔过量存在。在一些实施方式中，稀有种类和普通种类是多核苷酸，并且稀有种类可以与普通种类相差1至20个核苷酸。在第一反应混合物中，形成包括分离探针和稀有种类的第一复合物，并形成包括分离探针和普通种类的多个第二复合物。然后使第一反应混合物与裂解试剂接触以形成第二反应混合物。裂解试剂的加入导致多个第二复合物的分离探针的易断裂键裂解，而使第一复合物的分离探针的易断裂键保持完整。然后使第二反应混合物与捕获种类接触以形成包括捕获种类和第一复合物的第三复合物，从而使第二复合物与第三复合物(包括稀有种类)分离和/或分开。稀有种类随后可以在分离后从第三复合物中释放。在一些实施方式中，稀有种类可以在与普通种类分离之后被扩增(例如，通过PCR)。

在这种方法中，分离探针包括能够与稀有种类和普通种类中的二者之一或二者形成复合物的靶向部分、能够与捕获种类形成复合物的捕获标签以及位于靶向部分和捕获标签之间的易断裂键。合适的靶向部分包括多核苷酸、抗体、抗体片段和抗体衍生物。合适的易断裂键包括羰基酯和氨磺酰酯。合适的捕获标签包括生物素、亚氨基生物素、洋地黄毒苷、多核苷酸、多肽、多组氨酸、抗体、抗体片段和/或抗体衍生物。因此，这样的方法可以利用抗生物素蛋白、链霉亲和素、抗体、抗体片段、抗体衍生物、镍复合物和/或多核苷酸作为捕获种类。为了便于处理，这些捕获种类进一步包括颗粒、磁响应颗粒、膜、微孔板的孔、移液管尖端或小瓶的内表面和/或过滤器。

本发明构思的另一个实施方式是分离探针，其包括被选择以与稀有种类和普通种类形成复合物的靶向部分、捕获标签、位于所述靶向部分和捕获标签之间的易断裂键和保护基团。选择保护基团以相对于其中分离探针与普通种类复合的复合物中的易断裂键的裂解速率，提供其中分离探针与稀有种类复合的复合物中降低的易断裂键的裂解速率。在一些实施方式中，稀有种类和普通种类是多核苷酸，其可以相差1至20个核苷酸。合适的靶向部分包括多核苷酸、抗体、抗体片段和/或抗体衍生物。合适的易断裂键包括羰基酯和/或氨磺酰酯。合适的捕获标签包括生物素、亚氨基生物素、洋地黄毒苷、多核苷酸、多肽、多组氨酸、抗体、抗体片段和/或抗体衍生物。可以选择这样的捕获标签以与捕获种类，例如抗生物素蛋白、链霉亲和素、抗体、抗体片段、抗体衍生物、镍复合物和/或多核苷酸形成复合物。这样的捕获种类还可以包括颗粒、磁响应颗粒、膜、微孔板的孔、移液管尖端或小瓶的内表面和/或过滤器。

本发明构思的另一个实施方式是可用于制备本发明构思的分离探针的中间体。这样的中间体包括选择为偶联靶向部分的反应性基团，其中选择靶向部分以与稀有种类和普通种类形成复合物。这种中间体还包括捕获标签、位于反应性基团和捕获标签之间的易断裂或可裂解键或部分、以及保护基团。选择保护基团以相对于包括分离探针和普通种类的复合物中易断裂键的裂解速率，提供包括分离探针和稀有种类的复合物中降低的易断裂键的裂解速率。在一些实施方式中，此类稀有种类和普通种类是多核苷酸，其可以相差1至20个核苷酸。合适的靶向部分包括多核苷酸、抗体、抗体片段和/或抗体衍生物。合适的易断裂键包括羰基酯和/或氨磺酰酯。合适的捕获标签包括生物素、亚氨基生物素、洋地黄毒苷、多核苷酸、多肽、多组氨酸、抗体、抗体片段和抗体衍生物。可以选择这样的捕获标签以与捕获种类例如抗生物素蛋白、链霉亲和素、抗体、抗体片段、抗体衍生物、镍复合物和多核苷酸形成复合物。这样的捕获种类还可以包括颗粒、磁响应颗粒、膜、微孔板的孔、移液管尖端或小瓶的内表面和/或过滤器。合适的反应性包括羧酸、羧酸酯、醛、环氧化物、卤化氰、二氯三嗪和酰肼。

根据以下对优选实施方式的详细描述连同附图，本发明主题的多种目的、特征、方面和优点将变得更加显而易见，在附图中，相同的数字表示相同的组件。

附图说明

图1：图1描绘了本发明构思的分离探针的多种实施方式。

图2A：图2A示意性地描绘了在利用本发明构思的分离探针时缺乏非靶标种类的分离。

图2B：图2B示意性地描绘了在利用本发明构思的分离探针时靶标种类的分离。

图3A：图3A示意性地描绘了本发明构思的分离探针与非靶标种类和稀有靶标种类的混合物的相互作用。

图3B：图3B示意性地描绘了本发明构思的结合/杂交的分离探针的差异裂解，以释放非靶标种类。

图3C：图3C示意性地描绘了在本发明构思的分离探针裂解之后去除非靶标种类。

图3D：图3D示意性地描绘了靶标种类的释放以生成稀有靶标富含的制剂。

图4：图4描绘了对碱基敏感接头的实例。反应开始于温和碱性硼酸钠阴离子对靶标分离探针化合物的攻击。在碱性条件下，形成醇中间体，然后快速转化为激发的X-酮化合物。该反应裂解未结合的靶标分离探针，以仅留下靶标分离探针和受杂交靶标分离探针保护的稀有核酸的结合的双链体。

图5：图5描绘了用作靶标捕获物的两种示例性染料酯的结构，其中染料在苯基离去基团的辅助下对羧酸酯和氨磺酰酯进行(access)裂解。L1、L2和L3可以是电子供体(例如甲基、氟化物、溴化物和/或氯化物)，并且L4可以包含一个、两个或更多个碳。L1、L2、L3和L4可包含接头，该接头与捕获部分(例如生物素或生物素样化合物)相连，该捕获部分用于与磁珠上的蛋白质或其他捕获种类结合。

图6：图6描绘了与N-邻苯二甲酰亚胺基-氧羰基相关的化合物(参见EP1646,609B1)的结构，其用作靶标捕获物以增强稀有核酸的纯度。

图7：可选的中间体化合物。

图8：示例性分离探针中间体的通用结构。X和Z是分离探针中间体的化学基团，其通过以下的键来连接：羧酸酯或羰基氨磺酰酯。L2与丙基磺酰基团相连，丙基磺酰基团含有接头和结合部分，例如生物素。Z部分提供适于偶联至靶向部分的反应性基团。

图9：可用于分离探针中间体的X、Y、Z化学基团的示例性结构。

图10：图10描绘了通过水解作用对本发明构思的分离探针的裂解。可以使用碱性缓冲液裂解该酯。显示了两种水解途径的机理。使用过氧化氢的快速、非选择性反应裂解所有酯，而使用pH约为8的硼酸钠缓冲液的温和反应选择性裂解酯。

图11：图11示意性地描绘了使用本发明构思的方法分离稀有核酸。左手侧：分离探针与靶标稀有核酸——含有四个嵌段L1或L2、X、Y和Z——的匹配杂交——在裂解反应后保持完整。右手侧：与野生型序列错配的分离探针在裂解时丢失三个组分(L1或L2、X、Y)。结合部分(例如生物素)丢失，只有离去基团和接头保留在这种双链体中。

图12：两种TCM的结构，生物素吖啶

图13示出了基于生物素基染料NHS酯的两种分离探针中间体的结构，其包含三个化学构造块。其每个基于使用此类中间体产生的分离探针，在样品制备方法中均具有特定功能。当与靶标稀有多核苷酸杂交时，此类分子的酯键在pH8的温和硼酸钠缓冲液的裂解下可以是稳定的。

图14：如图所示合成2-生物素基染料NHS酯。

图15：化合物17的合成的第一部分，其中生物素被季铵化至染料的10-氮位置。

图16：化合物17的合成的第二部分，其中合成了季N-10-生物素基染料NHS酯。

图17显示了本发明构思的分离探针中间体(化合物25)的合成路线，其中末端N-羟基琥珀酰亚胺基团适于偶联胺基。

图18A和18B：图18A显示了在使用本发明构思的分离探针处理之前，对含有5％KRAS G12A突变(SEQ ID NO 2)的KRAS野生型(WT)序列(SEQ ID NO 1)的制剂的Sanger测序结果。碱基鉴定是自动化的，并由商业软件提供。图18B显示了使用本发明构思的分离探针处理后，含有5％KRAS G12A突变(SEQ ID NO 2)的KRAS野生型(WT)序列(SEQ ID NO 1)的制剂的Sanger测序结果。KRAS G12A突变序列(SEQ ID NO 2)的富集是明显的。碱基鉴定是自动化的，并由商业软件提供。

图19A和19B：图19A显示了在使用本发明构思的分离探针处理之前，对含有20％KRAS G12A突变(SEQ ID NO 2)的KRAS野生型(WT)序列(SEQ ID NO 1)的制剂的Sanger测序结果。碱基鉴定是自动化的，并由商业软件提供。图19B显示了使用本发明构思的分离探针处理后，对含有20％KRAS G12A突变(SEQ ID NO 2)的KRAS野生型(WT)序列(SEQ ID NO 1)的制剂的Sanger测序结果。KRAS G12A突变序列(SEQ ID NO 2)的富集是明显的。碱基鉴定是自动化的，并由商业软件提供。

图20A和20B：图20A显示了在使用本发明构思的分离探针处理之前，对KRAS野生型(WT)序列(SEQ ID NO 1)的制剂的Sanger测序结果。碱基鉴定是自动化的，并由商业软件提供。图20B显示了在使用涉及KRAS G12A突变(SEQ ID NO 2)的本发明构思的分离探针处理后，对KRAS野生型(WT)序列(SEQ ID NO 1)的制剂的Sanger测序结果。没有KRAS G12A突变序列(SEQ ID NO 2)的证据，这表明富集反应是模板依赖性的，并且不是分离过程的伪像。碱基鉴定是自动化的，并由商业软件提供。

具体实施方式

以下描述包括可用于理解本发明的信息。不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，或明确或隐含引用的任何出版物为现有技术。

本发明的主题提供了组合物和方法，其中在溶液中以低频出现的分子种类(例如，表示溶液中小于约20％、小于约10％、小于8％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％和/或小于0.5％的相似类型的分子)可以从溶液中此类分子的混合物中分离。例如，感兴趣的分子种类可以是携带低频突变(例如，低频SNP或小的缺失或插入)的核酸，其相对于相应的野生型核酸以低频存在于溶液中。可选地，这种分子种类可以是具有具体构型或结合位点的蛋白质，该蛋白质以低频率存在于含有其他蛋白质的溶液中。与其他类似分子种类分离后，可以进一步分析感兴趣的分子，例如通过扩增。合适的扩增方法包括PCR、逆转录PCR、实时PCR和单链连接酶扩增。

吖啶

以下讨论提供了本发明主题的许多实例实施方式。尽管每个实施方式代表发明要素的单个组合，但是发明主题被认为包括所公开要素的所有可能的组合。因此，如果一个实施方式包括要素A、B和C，并且第二实施方式包括要素B和D，则即使没有明确地公开，本发明主题也被认为包括A、B、C或D的其他剩余组合。

在一些实施方式中，用于描述和要求保护本发明某些实施方式的表示成分数量、性质例如浓度、反应条件等等的数字应理解为在某些情况下被术语“约”修饰。因此，在一些实施方式中，在撰写的说明书和所附权利要求书中阐述的数字参数是近似值，其可以根据具体实施方式试图获得的期望性质而变化。在一些实施方式中，应该根据报告的有效数字的数目并通过应用普通的舍入技术来解释数字参数。尽管阐述本发明的一些实施方式的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实例中阐述的数值被尽可能精确地报告。在本发明的一些实施方式中呈现的数值可能包含由它们各自的测试测量中发现的标准偏差必然引起的某些误差。

除非上下文相反地指出，否则本文阐述的所有范围应解释为包括其端点，并且开放式范围应解释为仅包括商业上的实用价值。类似地，除非上下文相反地指出，否则所有值列表都应视为包括中间值。

本文中值范围的叙述仅旨在用作单独指代落在该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文另外指出，否则每个单独值与范围都被并入说明书中，就如同其在本文中被单独陈述一样。除非本文另外指出或另外与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序执行。相对于本文的某些实施方式提供的任何和所有实例或示例性语言(比如“例如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并且不对以其他方式要求保护的本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表示对实践本发明必不可少的任何未要求保护的要素。

如本文所用，并且除非上下文另有指示，否则术语“偶联(coupled to)”旨在包括直接偶联(其中彼此偶联的两个元件彼此接触)和间接偶联(其中至少一个附加元件位于两个元件之间)。因此，术语“偶联”和“与……偶联”同义地使用。如在本文的描述中以及在所附的整个权利要求书中所使用的，“一个”、“一种”和“该”的含义包括复数引用，除非上下文另外明确指出。同样，如本文的描述中所用，“在……中”的含义包括“在……中”和“在……上”，除非上下文另外明确指出。

本文中值范围的叙述仅旨在用作单独指代落在该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文另外指出，否则每个单独值都被并入说明书中，就如同其在本文中被单独陈述一样。除非本文另外指出或另外与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序执行。相对于本文的某些实施方式提供的任何和所有实例或示例性语言(比如“例如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并且不对以其他方式要求保护的本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表示对实践本发明必不可少的任何未要求保护的要素。

本文公开的本发明的可选要素或实施方式的分组不应解释为限制。每个组成员可以单独地或与组中的其他成员或本文发现的其他要素任意组合来被提及或要求保护。出于方便和/或可专利性的原因，组中的一个或多个成员可以包含在组中或从组中删除。当发生任何这样的包含或删除时，说明书在本文中被认为包含经修改的组，从而满足所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。

在本发明构思的实施方式中，使用分离探针完成分离。如图1所示，这种分离探针包括靶向部分组分、可裂解位点组分、保护区组分和捕获半抗原组分。可以布置这样的分离探针，使得可裂解位点和保护区插入靶向部分组分和捕获半抗原组分之间。在本发明构思的实施方式中，靶向部分组分提供了与感兴趣的分子种类的特异性识别和亲和定向结合(例如，经由杂交)。应当理解，这种靶向部分组分也可以结合与感兴趣的分子种类有关的分子种类，但是可以以明显不同的方式结合(例如，通过包括一个或多个碱基对错配)。在与感兴趣的分子形成复合物时，布置分离探针，使得保护区可以在裂解事件开始时防止或减慢可裂解位点的断裂。然而，在与非靶标分子种类形成复合物时，布置分离探针，使得保护区在裂解事件开始时不会防止或减慢可裂解位点的断裂。

如图1所示，分离探针的靶向部分通过包括裂解位点的间插部分与分离探针的捕获半抗原部分分开。这样的裂解位点与保护区相关。根据它们的目的和/或预期的感兴趣的靶标分子，裂解位点和保护区之间的空间关系可以在不同的分离探针之间变化。在一些实施方式中，保护区在裂解位点近端，并且可以定位在靶向部分和裂解位点之间，或者可选地，在裂解位点和捕获半抗原部分之间。在一些实施方式中，保护区可以是单个、连续的保护基团。在其他实施方式中，保护区可以包括两个或更多个不邻接的子区域。在这种分布的保护区中，保护区的部分可以分布在分离构造的不同部分中。应当理解，可以通过分离探针的组分与靶标种类之间的相互作用来形成保护区，该相互作用与靶标种类和靶向部分之间的相互作用独立并且不同。在一些实施方式中，这样的保护区可以基本上完全由分离探针的组分提供。

尽管示意性地描绘为共价键，但是应当理解，分离探针的不同功能部分的键和/或连接分离探针的不同功能部分的键可以是共价的、非共价的或两者的混合物。例如，本发明构思的分离探针可以具有通过共价键、电荷：电荷相互作用、核苷酸碱基对相互作用、亲和相互作用(例如抗原：抗体、碳水化合物：凝集素、生物素：抗生物素蛋白等)和/或拟亲和相互作用(例如多组氨酸：镍)连接的功能部分。

如上所述，裂解事件的开始提供了溶液中存在的感兴趣的分子与非靶标但相似的分子之间的区分。图2A示意性地描绘了与溶液中的非靶标分子的这种反应。尽管非靶标分子可能足够相似(例如，具有足够的序列同一性)以支持一定程度的与分离探针的靶向部分组分亲和定向的复合物形成，但所得复合物并没有为可裂解位点提供保护。结果，裂解的开始导致分离探针的断裂和捕获半抗原部分从非靶标分子的释放。因此，后续的处理步骤(例如，针对分离探针的捕获半抗原部分的亲和定向分离技术)不会导致非靶标分子与分离种类的分离。

图2B示意性地描绘了本发明构思的分离探针与它所针对的稀有靶标分子的反应。与靶标分子的亲和定向复合物的形成导致如此构型，其中在裂解事件开始时，保护区防止或减慢可裂解位点的断裂。因此，在这种开始之后，分离探针的捕获半抗原部分保留在靶标分子上。后续处理步骤导致靶标分子与溶液中存在的其他种类分离。

利用这种分离探针分离稀有分子种类的方法的实例示于图3A至3D。在图3A中，将包含许多非靶标种类(300)和稀有靶标种类(305)的溶液与本发明构思的分离探针(310)组合。分离探针包括靶向部分(315)、易断裂或可裂解部分(320)、保护部分(325，例如吖啶

在将分离探针与稀有靶标和非靶标种类二者结合之后，将混合物暴露于裂解分离探针的不稳定裂解位点(320)的条件，如图3B所示。在与靶标种类结合的分离探针中，保护部分(325)被布置成防止或减慢裂解位点的断裂。例如，这样的保护部分可以以这样的方式与结合的靶标种类相互作用，以将裂解位点定位在靶标种类/分离探针复合物的受保护的袋中，该靶标种类/分离探针复合物是在溶液中不易接近诱导断裂的种类。因此，在裂解步骤之后，靶标种类/分离探针复合物(335)保持完整。相反，在结合至非靶标种类的分离探针中，裂解位点是可接近的，并且发生了分离探针的断裂。这种断裂导致从裂解的分离探针片段(345)中的非靶标种类释放分离探针的捕获半抗原部分(330)。

图3C描绘了在裂解后发生的分离步骤。暴露于分离探针的捕获半抗原部分的亲和伴侣(350)导致亲和复合物(355)的形成，所述亲和复合物使稀有靶标种类与亲和伴侣缔合。在优选实施方式中，将这样的亲和伴侣提供在固体基质(例如珠、颗粒或微板表面)上，该基质有利于将含有复合物(355)的靶标种类与本体溶液分开。洗涤步骤可用于去除留在溶液中的包含分离探针片段的非靶标种类，从而导致稀有靶标种类(305)从非靶标种类中分离。此时可以对稀有靶标种类进行分析，或者可以将其与亲和伴侣分开以在溶液中产生靶标种类。这在图3D中示出。

应当理解，用分离探针处理大体积的样品并将靶标种类释放到小体积中有效地提供靶标种类的分离和浓缩。应当理解，尽管在图3D中示出了靶标种类的释放为通过从靶向部分释放来完成，但是在一些实施方式中，可以通过破坏分离探针的捕获半抗原部分与亲和伴侣之间的缔合，从亲和伴侣中释放靶标种类。

还应当理解，靶标种类可以是与更大的部分或主体(例如，细胞表面上的蛋白质)缔合的分子。在后一种情况下，靶标种类的分离也可以提供缔合的较大主体的分离。例如，本发明构思的分离探针可以用于从含有大大过量的相应的携带野生型序列的核苷酸的群体中分离携带低频发生的SNP或小的(即少于或等于20个核苷酸)插入或缺失的靶标多核苷酸。可选地，可以使用针对稀有细胞表面标志物的分离探针从包含大大过量的不携带该稀有表面标志物的相似细胞的群体中分离携带该稀有表面标志物的细胞。

在本发明构思的一些实施方式中，稀有种类的分离没有进行到完成或接近完成(即，存在的种类的90％以上是稀有靶标种类)。然而，应当理解，在本发明构思的其他实施方式中，稀有种类的分离可以出于富集目的而进行。例如，在一些实施方式中，稀有靶标种类可以被富集以表示存在种类的1％、2％、3％、4％、5％、7％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％和/或多至50％。这对于核酸应用尤为有意义，因为当种类以总群体的一些百分比或更多存在时，可以以有用的准确性实施扩增技术。

应当理解，尽管以上说明的本发明构思的实施方式利用了正选择(即，靶标稀有种类的捕获和分离)，但是发明人考虑本发明构思的组合物和方法可以用于负选择(即，非靶标、普通或野生型种类的捕获和分离)。例如，可以利用如此分离探针，该分离探针选择性提供用于非直接感兴趣的普通或野生型种类的可分离“标签”。该普通种类的分离和随后的去除与稀有或靶标种类的释放结合留下了富含该靶标或稀有种类的群体。如果需要的话，可以对残留样品进行反复轮次的这样的负选择，以便进一步富集具有靶标或稀有种类的残留种类。当缺乏有关稀有或靶标种类性质的信息时，可以利用这种负选择方法。

在本发明构思的一些实施方式中，靶向部分可以是与靶标核酸序列互补或至少部分互补的核酸或核酸类似物序列。合适的核酸和/或核酸类似物包括DNA、RNA、PNA、锁定核酸和其他修饰的核酸/核酸类似物，并且长度范围可以是约10至约200个核酸或核酸类似物单体单元长度。核酸类似物是与天然存在的RNA和DNA类似(结构相似)的化合物。核酸是核苷酸链，由三部分组成：磷酸骨架、戊糖、核糖或脱氧核糖二者之一以及四种核酸碱基之一。核酸类似物可以具有任何这些改变。通常，核酸类似物赋予不同的碱基配对和碱基堆积性质等。实例包括可以与所有四种规范碱基配对的通用碱基，以及磷酸糖主链类似物(例如PNA)。

人工核酸包括肽核酸(PNA)、吗啉代和锁定核酸(LNA)，以及乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。这些中的每一种都通过改变分子骨架来区别于天然存在的DNA或RNA。这样的基于核酸或类似物的靶向部分可以是线性或支化的，并且可以包括环状和/或发夹结构。

在本发明构思的其他实施方式中，靶向部分可以是对蛋白质或其他大分子的靶标位点具有亲和力的肽或肽类似物。这样的靶标位点可以包括较小的结构修饰，该修饰不足以通过常规的(例如免疫化学)手段与天然构型区分开，但是为本发明构思的组合物和方法中的脱保护提供了足够的区分。此类肽可包括免疫球蛋白和/或免疫球蛋白片段(例如F(ab)

在本发明构思的仍其他实施方式中，靶向部分可以是小分子(即，分子量小于1,000D的分子)。合适的小分子的实例包括糖类(例如单、二、三和更高阶糖类)、脂质、药物化合物和染料。

分离探针的捕获半抗原提供了将与靶向部分复合的种类与周围环境分离的手段。在优选的实施方式中，捕获部分对与亲和伴侣偶联或另外共定位的捕获种类具有亲和力。这样的亲和伴侣可以提供容易与包含靶标和非靶标种类的溶液分开的相分离。例如，合适的亲和伴侣可以是包括捕获种类的颗粒、微粒、珠、纤维、细丝、网孔或其他固体表面(例如，微孔板的孔或移液管尖端的内部)。在本发明构思的一些实施方式中，亲和伴侣可以是磁性响应的。合适的捕获半抗原包括小分子，例如生物素和/或生物素类似物(例如亚氨基生物素)、半抗原基团(例如，洋地黄毒苷或二硝基苯基)、糖、肽(例如多组氨酸)和核酸。相应的捕获种类包括抗生物素蛋白、修饰的抗生物素蛋白、链霉亲和素、半抗原特异性抗体或抗体片段、凝集素、金属(例如镍)和互补核酸。在一些实施方式中，可以选择捕获半抗原以在保持正捕获的稀有种类的活性和/或结构的条件下容易地从亲和伴侣上释放。例如，捕获半抗原可以是亚氨基生物素(通过与生物素竞争而易于从抗生物素蛋白和链霉亲和素释放)、易于通过与游离糖竞争而从捕获凝集素中位移出的糖、或易于通过温度和/或盐浓度的变化从互补多核苷酸释放的多核苷酸。

可以选择分离探针的可裂解基团以在保持所需稀有种类的结构和/或活性的条件下进行断裂。在本申请的上下文中，此类可裂解或易断裂基团应理解为包括在分离探针结构的其余键(共价的或非共价的)保持完整时可破裂的易断裂键(共价的或非共价的)。合适的可裂解基团的实例包括有机可裂解基团(例如羧酸酯、磺基酯等)、肽(例如用作蛋白酶底物的肽)和核酸序列(例如用作限制酶底物的序列)。此类可裂解基团与保护基团一起选择，从而在与稀有靶标种类形成复合物时减少或防止断裂。

例如，有机可裂解基团可以选择为包括酯键的化学键，当暴露于保护基团之外时，该酯键可在弱碱性条件下发生断裂。其他有机可裂解基团可在酸性条件下、在氧化剂存在下、在还原剂存在下和/或当暴露于保护基团之外时经受电磁辐射时发生断裂。在本发明构思的优选实施方式中，可裂解基团是酯，并且可以在吖啶

如上所述，与可裂解基团一起并考虑靶标种类的性质来选择保护基团。在本发明构思的一些实施方式中，保护基团与靶标种类的结构相互作用，使得当分离探针与稀有靶标种类复合时，使保护基团插入可裂解基团和外部环境之间，而当分离探针与相似的非靶标种类复合时，保护基团并未被插入。例如，吖啶

在本发明构思的一些实施方式中，靶标种类是包括肿瘤细胞特征性的单核苷酸多态性(SNP)的核酸。包含特征性SNP的肿瘤细胞可能以低频存在于组织或血液样本中，该组织或血液样本含有大量携带野生基因型的细胞(即缺乏靶标SNP的细胞)。类似地，携带此类SNP的核酸(例如DNA、RNA)可以以游离形式与不携带靶标SNP的野生型核酸的许多拷贝一起存在于循环中。在本发明构思的一些实施方式中，这种分离探针的保护基团可包括与形成靶标种类：分离探针复合物(例如，DNA的小沟；DNA双链体)的一部分的具体结构复合的有机部分。这类有机部分和基于它们的分离探针的示例性实施方式如下。

本发明构思的一些实施方式涉及碱基敏感性接头及其使用方法，例如在分子诊断和/或体外诊断中，使用分离探针增强含有单核苷酸多态性的稀有核酸。在图4中示出示例性实施方式。反应开始于温和碱性硼酸钠阴离子对靶标分离探针化合物的攻击。在碱性条件下，形成醇中间体，然后快速转化为激发的X-酮化合物。该反应裂解未结合的靶标分离探针，仅留下靶标分离探针和被杂交的靶标分离探针保护的稀有核酸的结合的双链体。

本发明构思涵盖用于从具有少量稀有核酸和过量野生型基因(其可以从生物系统获得)的混合物中靶标分离、隔离、分开和/或纯化稀有核酸的化合物及其反应机理方法。在样品制备步骤之后，可以通过常规技术任选地扩增和/或分析已隔离的稀有核酸。

本发明构思的一些实施方式采用位于双链核酸螺旋的小沟中的化合物，例如吖啶

在本发明构思的一些实施方式中，分离探针可包括易断裂部分，其包括吖啶

在另一类合适的吖啶

本发明构思的一些方法和组合物涉及“三元环”化合物，例如染料或在键中产生不稳定性的任何有机基团(例如羧酸酯或氨磺酰酯)，其又将化合物连接至作为离去基团的酚基团(或任何合适的基团)。

在本发明构思的一些实施方式中，在检测和/或鉴定稀有核酸(例如通过使用常规的扩增、杂交和/或测序技术)之前，此类组合物可用于选择性地富集测试混合物的稀有核酸的含量。在图4中示出了用于此目的的示例性化合物。分离探针上的组分X(例如染料化合物)和组分Z(例如酚基团)保持对插入组分X和Z之间的Y键(例如羧酸酯键或氨磺酰酯键)的电子贡献的平衡。反直觉地，这些键必须是不稳定的，例如如图4所示的通过温和水解反应可裂解的。染料化合物(例如吖啶

合适的染料化合物可以是例如图5所示的那些发光化合物，尽管发光对于分离功能不是必需的。在图6中示出了具有类似于上述染料的裂解反应的发光化合物，其中L1为H或脂肪族胺，L2为磺酰基丙酸酯-接头。图7描绘了包括三元环的相关化合物，该三元环具有抗衡离子盐以促进酯键的不稳定性，并且具有包含胺反应性NHS-酯的苯基离去基团。

可用作分离探针或分离探针中间体的通用化学基团

如图8所示，示例性分离探针中间体的通用结构描述为X、Y和Z，其中R1、R2、R3是接头，n是接头的构造块的数量，m是该结构中包含的碳的数量。X和Z是分离探针中间体的化学基团，其通过例如羧酸酯或羰基氨磺酰酯的键连接。L2连接至丙基磺酰基，其包括接头和结合部分，例如生物素。Z部分提供适合于将这种中间化合物偶联至合适的靶向部分的反应性基团。在图9中示出了分离探针中间体的示例性X、Y和Z化学基团。

裂解反应机理

发明人考虑可以通过多种手段来完成并入一种或多种X化合物例如染料酯的分离探针的裂解。寿命短的中间体被认为是导致脱羧的过程的一部分，并且导致酯键断裂。对于X酯提出的导致酯裂解的过程可以通过不同途径进行。例如，使用碱性过氧化氢缓冲液的快速反应可以提供完全的裂解。可选地，使用温和碱性硼酸钠缓冲液的温和反应可以在酯键处提供选择性裂解。这种水解反应在图10中示意性地示出。还可以使用碱性缓冲液裂解酯。显示了两种水解途径的机理。使用过氧化氢的快速非选择性反应裂解所有酯，而使用大约pH 8的硼酸钠缓冲液的温和反应选择性地裂解酯。

在使用H

可选地，在使用大约pH 8的温和碱性缓冲液(例如硼酸盐)的第二水解途径中，反应开始于温和碱性硼酸钠阴离子对分离探针化合物的攻击。在碱性条件下，形成醇中间体，然后快速转化为激发的X-酮化合物。该反应仅选择性地裂解未结合的分离探针，以仅留下分离探针和受杂交保护的稀有核酸的结合的双链体。本发明构思的方法可以使用这种选择性水解来裂解未结合靶标的酯键。

如图10所示，裂解反应取决于离去基团Z的性质。用于靶标捕获应用的X化合物的基本特征是酯官能团已被取代以提供合适的离去基团Z。设计合适的离去基团以提供(尽可能地)两个基本要求：稳定性和高量子产率。一方面，X酯的离去基团必须尽可能的有活性，即在测量条件下非常容易离去，以允许灵敏的捕获和高产率。然而，另一方面，这种高活性是以对水解的不稳定性为代价的。如果将此类靶标捕获物用来与生物分子缀合，则此类不稳定性甚至更为关键。目标是实现高产率以及标记试剂的高稳定性在产率和稳定性之间的平衡。为了至少部分减少所遇到的问题，已经考虑并设计了新颖且不同的离去基团。

用于捕获核酸的分离探针分子的一个实施方式包括取代基和具有特定电子平衡的键，包括：

1)捕获部分或半抗原(例如生物素或亚氨基生物素)，其提供与特定捕获部分(例如抗体、抗体衍生物或片段、抗生物素蛋白和/或链霉亲和素)的强结合。潜在的捕获部分包括生物素、亚氨基生物素、洋地黄毒苷、多组氨酸、抗原半抗原、核苷酸序列等。

2)电子供体基团，例如季有机化合物的三元环，其影响酯键或其他可裂解键的裂解。

3)可裂解键，例如羧酸酯(R-CO-OR)或氨磺酰酯(R-CO-N-SO

4)任选地，分离探针的合成中的中间体可以包括敏感的离去基团，例如丙酰基酚基，其可以含有用于标记靶向部分的反应性基团(例如NHS-酯、醛、马来酰亚胺、环氧化物等)，该靶向部分例如与稀有序列互补的抗体/抗体片段或核酸探针序列。

在优选实施方式中，本发明构思的分离探针和方法用于从含有大量单碱基差异的相关多核苷酸的环境中分离稀有多核苷酸，如图11中所示。可以合成包括上述部分的分离探针中间体，并将其偶联至与稀有多核苷酸互补的核酸，该核酸含有与分离探针中间体的反应性基团反应的氨基接头。然后，可以将过量提供以便改善反应动力学的分离探针在杂交缓冲液(例如，pH为6至10的缓冲液)中与稀有多核苷酸杂交。随后，未结合的分离探针和与错配多核苷酸(例如，野生型)杂交的分离探针(其中探针的可裂解部分未被保护)在易断裂键(例如酯或氨磺酰键)处被裂解。可以通过小沟结合保护的匹配的多核苷酸/分离探针杂合体保持完整。在隔离步骤中使用磁珠(例如链霉亲和素包被的磁珠)对捕获化合物(例如生物素)进行捕获。可以洗涤(例如通过用磁体提取，然后进行缓冲液交换)未结合的多核苷酸和过量裂解的分离探针以去除或减少非靶标(例如野生型)多核苷酸的量。在图11中示意性地描绘了这种方法的示例。该图的左侧显示了分离探针与靶标多核苷酸的杂交。杂交的分离探针包括四个功能块：L1或L2、X、Y和Z，它们在裂解反应后保持完整。图11的右侧描绘了与野生型多核苷酸杂交的相同的分离探针，其在裂解时丢失三个功能块(L1或L2、X、Y)。结合部分(例如生物素)丢失，并且仅离去基团和接头保留在这种双链体中。

在本发明构思的一些实施方式中，结合部分(例如生物素)可以附接至有助于保护在L1和L2中在碳C2位置或季氮N-10处的可裂解或易断裂键(例如吖啶)的化学基团，它们又连接到反应性基团，例如NHS-酯。在本申请的上下文中，易断裂键可以理解为是分离探针内的键(共价的或非共价的二者之一)，其可以被选择性地破裂，而使分离探针(或通过此类裂解产生的其片段)内的剩余的键(共价的或非共价的二者之一)完整。这样的结合部分可以在L2处附接至氨磺酰键氨磺酰NHS-酯的氮。这种分子的可能结构的实例在图12中描绘，其显示了两个示例性分离探针中间体(生物素基染料NHS-酯和生物素基染料氨磺酰NHS-酯)的化学结构。此类化合物可包括1)抗衡离子A-、2)三元环吖啶

示例性分离探针的结构以及杂交保护功能

分离探针和分离探针中间体的通用结构可以具有以下特征：

A)使用三个化学构造基团设计分离探针中间体的结构：1)结合或捕获部分，例如接头-生物素；2)裂解接近部分(cleavage access moiety)，例如染料；和3)离去基团，例如苯基-对丙酸酯-NHS酯。在分离探针中，这样的离去基团将已经与靶向部分，例如与稀有靶序列互补的多核苷酸反应。

B)可以使用氨基甲酸酯(-CO-NH-)键、醚(-O-)键或硫醚(-S-)键将结合基团(例如生物素)在单个位置偶联至裂解接近基团，例如在1、2、3、4或10位置处的吖啶的三元环(绿色框)。使用氨基甲酰基-酰胺(-CO-NH-)键的取代(参见图13的1301)，或通过季氮在位置N-10处附接(参见图13的1302)。

C)多个结合基团(例如生物素)可以使用B)中所述的上述相同键在多个位置(例如位置1、2、3、4、5、6、7、8)处取代，以制造多生物素基染料。

D)生物素基染料基团可以通过不稳定的键(例如酯)与对苯基丙酸酯NHS酯基连接，该键可以通过用温和碱性硼酸钠缓冲液处理而裂解。

E)甲基、磺酰基烷基和/或卤素原子(例如氟化物、氯化物或溴化物)可被取代至对苯基丙酸酯NHS酯基团，以在邻位或间位形成单取代，或在苯环上所有可用的位置形成多取代。

图13显示了基于生物素基染料NHS酯的两种分离探针中间体的结构，其包括三个化学构造块。其每个基于使用此类分离探针中间体产生的分离探针，在样品制备过程中均具有特定功能。当与靶标稀有多核苷酸杂交时，此类分子的酯键在pH 8的温和硼酸钠缓冲液的裂解下可以是稳定的。

用于样品制备和检测多核苷酸的示例性方法可以包括以下步骤：

A)通过氨基甲酸酯键、醚键、硫醚键在C-2位置的三元环或在季氮位置N-10，将结合基团(例如生物素)与部分的分离探针中间体(例如探针中间体的染料-NHS酯)相连。结合化合物，例如生物素基染料-NHS酯，可以例如与互补于具体靶标稀有多核苷酸的DNA序列的接头上的游离氨基偶联。

B)探针杂交：将含有与靶标多核苷酸杂交的适当互补核酸序列的生物素-染料-酯-接头探针添加到被认为杂交缓冲液中含有稀有多核苷酸的样本(例如血液、血清、血浆、浸渍组织和其他体液)中并温育(例如，在60℃下10分钟)。

C)未结合/错配的探针去除：将温和碱性硼酸盐缓冲液(例如，pH 8的硼酸锂)添加到混合物中并混合。在合适的温育(例如，在60℃下20分钟)后，未结合的和/或形成的错配双链体的生物素-染料-接头-探针被硼酸盐缓冲液选择性地裂解。只有与稀有多核苷酸完美结合的匹配的生物素-染料-接头-探针在缓冲溶液中保持完整。

D)样品制备完成：将链霉亲和素修饰的磁珠添加到溶液中，以形成链霉亲和素-生物素-接头-探针结合的靶标核酸。结合后所得的磁珠然后使用适当的缓冲溶液洗涤以去除未结合的物质，并可以干燥。可以使用自动化系统进行样品制备。

E)可以例如通过常规的扩增、杂交和/或测序技术来分析纯化的稀有靶标多核苷酸。在一些实施方式中，该步骤可以直接对携带靶标核酸的磁珠进行。在其他实施方式中，可以在分析之前将靶标核酸从磁珠释放(例如通过升高的温度、降低的盐浓度和/或蛋白酶处理)。

应当理解，分离探针的部分，例如连接功能部分的接头区(例如，靶向部分、捕获部分、保护区和/或可裂解/易断裂位点)可包括间隔部分。这样的间隔部分不直接参与分离探针的上述功能，而是提供允许或增强其功能的间隔、定位和/或几何形状。因此，间隔部分可以是柔性的或刚性的。间隔部分可以具有任何合适的长度，例如长度为3至4个碳至48个碳(或更多个)。可以在合成期间(例如，在下面概述的合成路线中)通过选择合适的起始化合物和/或通过在间隔部分的合成期间重复添加合成步骤(例如，连续添加氨基己酸)来提供间隔部分。

实施例

2-生物素基染料NHS酯的合成：

如图14所示，设计和合成化合物9。化合物9可以用作探针中间体，用于偶联至胺-接头的游离氨基，其可以并入核酸序列或其他靶向部分中。所得探针准备用于杂交和隔离稀有靶标分子，例如稀有基因靶标。化合物

4'-丙酰基羧苯基-10-N-磺丙基(sulfopronyl)-染料-9-羧酸酯-N-琥珀酰亚胺酯的合成：

a)羟苯基-4-苄基丙酸酯的合成

将3-(4-羟基苯基)丙酸(10g，60毫摩尔)溶解在60mL 1M氢氧化钾溶液中。真空去除水，将干燥的残余物溶于42.5mL的乙醇、2.5mL的甲醇、2.5mL的2-丙醇和2.5mL的水中。将7.2mL的苄基溴(60毫摩尔)逐滴添加至溶液中，之后将该溶液加热至回流，持续3小时。将该溶液真空干燥，并将浆状物溶解在100mL醚和100mL饱和碳酸氢钠溶液的混合物中。将混合物转移至分液漏斗，并将100mL的醚和100mL的饱和碳酸氢钠溶液的第二混合物添加至反应烧瓶。合并混合物，并添加另外的100mL乙酸乙酯。去除水相，并用单独的200mL饱和碳酸氢钠溶液将乙酸乙酯层洗涤两次。有机相经无水硫酸镁干燥、过滤，并真空去除溶剂。通过TLC(7：3己烷/EtOAc)在通过UV可视化的氧化铝二氧化硅板上确定反应的程度。收集产物为浅黄色油。产率：12.79g(49.9毫摩尔，83.17％)，H

b)4'-丙酰基羧苯基染料-9-羧酸酯的合成

在氮气气氛下在冰浴中冷却在吡啶(30mL)中的染料9-羧酸(如美国专利号5,521,103中所述)(1.43g，6.4毫摩尔)，并用甲苯磺酰氯(2.64g，12.8毫摩尔，2当量)处理，搅拌10分钟后，接着加入羟苯基-4-苄基丙酸酯(1.64g，6.4毫摩尔，1当量)。将反应混合物温热至室温。将得到的混合物在室温、氮气气氛下继续搅拌。1小时后，加入另外的2当量的甲苯磺酰氯，以及0.5当量的羟苯基-4-苄基丙酸酯和15mL吡啶。将混合物在室温搅拌24小时。加入另外部分的羟苯基-4-苄基丙酸酯和15mL的吡啶，并继续搅拌24小时。然后在减压下去除溶剂，并将残余物溶于100mL二氯甲烷中，并用饱和氯化钠水溶液100mL×2和饱和碳酸氢钠水溶液100mL×2洗涤。然后将溶剂萃取物通过硫酸镁干燥、过滤并蒸发至干燥。将所得残余物通过急骤色谱在700mL干燥的硅胶上使用5％乙酸乙酯、25％氯仿、70％己烷进行纯化。分析H

c)4'-丙酰基羧苯基-10-N-磺丙基染料-9-羧酸酯的合成

将上面的染料酯(20mg，38.4毫摩尔)、1,3-丙烷砜(0.28g，2.29毫摩尔)和碳酸氢钠(32mg，384微摩尔)在10mL圆底烧瓶中混合，并在油浴中在120℃、氮气气氛下加热。4小时后，将反应冷却至室温，并用乙酸乙酯(10mL)稀释。对悬浮液进行超声处理，直到胶状(gummy)固体分散到溶剂中，以得到红黄色沉淀。通过过滤收集该沉淀物，并用乙酸乙酯冲洗。然后将其溶于甲醇中并过滤。使用C

4'-丙酰基羧苯基-2-氨基羧基生物素基-10-N-磺丙基-染料-9-羧酸酯-N-琥珀酰亚胺酯的合成：

a)溴苯-4-生物素基羧酰胺的合成。

将4-溴苯胺(2g，11.6毫摩尔)、生物素(2.83g，11.6毫摩尔)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU，743g，23.2毫摩尔，2当量)、1-羟基苯并三唑水合物(HOBt，3.12g，23.2毫摩尔，2当量)在60mL无水DMF中混合。向混合物中加入N-乙基吗啉(2.96mL，23.2毫摩尔，2当量)，并在室温、氮气气氛下搅拌4小时。随后将反应溶液进行TLC(溶剂CH

4'-丙酰基羧苯基-2-氨基羧己基氨基羧基-生物素基-10-N-磺丙基-染料-9-羧酸酯-N-琥珀酰亚胺酯的合成：

a)溴苯-4-羧酰氨基己胺的合成。

将4-溴苯胺(2g，11.6毫摩尔)、6-氨基-己酸(1.52g，11.6毫摩尔)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU，743g，23.2毫摩尔，2当量)、1-羟基苯并三唑水合物(HOBt，3.12g，23.2毫摩尔，2当量)在40mL无水DMF中混合。向混合物中加入N-乙基吗啉(2.96mL，23.2毫摩尔，2当量)，并在室温、氮气气氛下搅拌4小时。随后将反应溶液进行TLC(溶剂CH

图17中示出了具有化合物25的结构的分离探针中间体的一般合成方案，中间体包括适合与亲核基团(例如，胺修饰的多核苷酸的胺、赖氨酸ε-胺、多肽的N-末端胺等)偶联的N-羟基琥珀酰亚胺基团和点击化学相容基团。HPLC-MS分析在Waters

化合物18的合成：根据公开的程序(参见EP0322926A2)制备化合物1(4g，产率：32％)。

化合物19的合成：将化合物18(4g)与100ml 10％的NaHCO

化合物20的合成：将化合物19(1g)溶于15ml DMF中，并加入K

化合物21的合成：将化合物20(330mg)与5ml 1N NaOH水溶液和5ml二

化合物22的合成：向化合物21(220mg)在5ml干燥吡啶中的混合物加入对甲苯磺酰氯(1.37g)，然后搅拌2小时。加入3-(4-羟苯基)丙酸苄酯(204mg)，并将混合物在室温下搅拌过夜。使用旋转蒸发仪去除溶剂，并将残余物溶于100ml EtOAc中，用1N HCl水溶液和盐水洗涤，通过Na

化合物23的合成：将化合物22(240mg)与3mL的乙酸和3mL的30％HBR水溶液混合。将混合物在室温下搅拌过夜。加入水，并用DCM萃取混合物。使用旋转蒸发仪去除溶剂，并将剩余溶液在真空下干燥，以得到棕色固体(200mg，产率～100)。MS：454.60(M+H)。

化合物24的合成：将化合物23(110mg)与5mL二氯甲烷混合。加入N-羟基琥珀酰亚胺(30mg)和EDC(110mg)，并将混合物在室温下搅拌过夜。加入水，用EtOAc萃取所得混合物，然后使用己烷和EtOAc作为洗脱溶剂在硅胶上通过柱色谱法纯化。得到黄色固体(55mg，产率41％)。MS：551.52(M+H)。

化合物25的合成：将化合物24(55mg)溶于2mL干燥DCM中。加入三氟甲磺酸甲酯(1ml)，并将混合物在室温、氩气下搅拌过夜。使用旋转蒸发仪去除溶剂，并使用二氯甲烷和乙腈作为洗脱溶剂，在硅胶上通过柱色谱法纯化粗产物。得到为黄色固体的12mg最终产物(产率：17％)。MS：565.99(M-CF

通过使在1μl pH 8.0的TE缓冲液中重构的1纳摩尔包括与KRAS G12A突变(SEQ IDNO 2)互补的序列的氨基修饰的多核苷酸与2μl无核酸酶的水、1M HEPES(pH 8.0)、4μlDMSO和2μl化合物25(其浓度足以提供摩尔过量)混合，在加盖的小瓶中以10μl的最终标记反应体积进行反应，来制备分离探针。轻微涡旋并短暂旋转以沉降液体后，将反应混合物在37℃加热块中温育20分钟。为了提高标记效率，将另外3μl的化合物25溶液添加到反应混合物中，再添加另外的1.5μl无核酸酶的水和0.5μl pH 8.0的1M HEPES缓冲液，在加盖的小瓶中总反应体积为15μl。轻微涡旋并短暂旋转以沉降液体后，将标记的反应混合物在37℃的加热块中进一步温育20分钟。

通过在具有50％DMSO的1M HEPES(pH 7.5至8.5)中加入5μl 0.125M赖氨酸(含游离伯胺)猝灭来终止NHS-酯/胺多核苷酸标记反应。将20μl混合物轻微涡旋并短暂旋转，然后在室温下温育5分钟。然后通过加入30μl 3M NaOAc(ph 5.0)、245μl无核酸酶的水和5μl分子生物学级糖原沉淀所得的吖啶

吖啶

如上所述，示例性的分离探针被设计为在过量的KRAS野生型(WT)序列(TACGCCACCAGC，SEQ ID NO 1)存在下选择性地富集KRAS G12A突变(TACGCCAGCAGC，SEQ IDNO 2)。为了设计用于扩增KRAS外显子2的PCR引物，参考序列从NCBI获得(NCBI登录号NG_007524)，并输入Geneious

从工程化的SW48人细胞系中提取的突变的人KRAS基因组DNA得自HorizonDiscovery

如下使用PCR扩增KRAS外显子2。使用Power SYBR Green Master Mix

如下进行使用本发明构思的分离探针富集来自第一PCR步骤(如上所述)的突变扩增子。将设计用于12mm管的摇动加热块预热至95℃。在具有100μl退火缓冲液的12mm×75mm圆底聚丙烯管中，加入1μl分离探针工作溶液。然后添加来自第一PCR的扩增子(20μl)，混合，然后将该管转移到预热的加热块中。在95℃下温育1分钟后，将重置的加热块重置为60℃。当加热块达到60℃时，将反应混合物在60℃下温育另外的10分钟。将300μl裂解试剂(参见上文)添加到反应混合物中，混合，并在60℃下温育60分钟。然后从加热块中移出该管，并向每个管中加入10μl Dynabeads

使用POP-7

来自含有KRAS WT序列(SEQ ID NO 1)并且还含有5％携带KRAS G12A突变(SEQ IDNO.2)的基因组DNA的未处理的基因组DNA制剂的示例性Sanger反应结果在图18A中示出。在未处理的样品中，KRAS G12A序列(SEQ ID NO 2)的存在不明显。图18B示出了用本发明构思的设计用于富集KRAS G12A突变(SEQ ID NO 2)含量的分离探针(即与SEQ ID NO 2互补)富集后，来自图18A中所示的相同混合物的示例性Sanger反应结果。在使用本发明构思的分离探针富集之后，KRAS G12A突变序列(SEQ ID NO 2)的高度富集是明显的。

对于含有20％的基因组DNA的制剂，发现了相似的结果，所述基因组DNA包括KRASG12A突变(SEQ ID NO.2)，其示例性结果在图19A中示出。可观察到KRAS G12A序列(SEQ IDNO 2)的存在为非常小的峰。图19B显示了在用本发明构思的设计用于富集KRAS G12A突变(SEQ ID NO 2)含量的分离探针富集后，来自图19A中所示的相同混合物的示例性Sanger测序反应结果。在使用本发明构思的分离探针富集之后，足以提供对突变序列的直接鉴定的KRAS G12A突变序列(SEQ ID NO 2)的高度富集是明显的。

在图20A中显示了仅包含携带KRAS WT序列(SEQ ID NO 1)的基因组DNA的未处理制剂的Sanger测序的示例性结果。图20B显示了在用本发明构思的设计用于富集KRAS G12A突变(SEQ ID NO 2)含量的分离探针富集后，来自图20A中所示相同混合物的示例性Sanger测序反应结果。没有存在KRAS G12A突变(SEQ ID NO 2)的证据，这表明该序列的富集是模板依赖性的，并且不是分离探针方法的伪像。

尽管在这些实施例中使用了Sanger测序，但是应当理解，可以利用多种核酸检测和表征技术。合适的技术包括基于扩增的技术(例如PCR、RT-PCR、滚环扩增、线性扩增等)和/或基于杂交的技术(例如印迹、与珠阵列杂交、与微阵列杂交等)。显示的结果是示例性的，并且发明人相信，通过优化探针设计、方法(例如，对使用分离探针的富集样品进行另外处理)和/或表征方法，将实现进一步的改进。

实施例中提供的错配敏感性可裂解键的实施例基于单碱基错配，但可以设想对多种突变类型(遗传或表观遗传的)进行操作，包括甲基化的DNA、反向碱基、小的和大的插入、小的和大的缺失以及融合基因连接。此外，预计可裂解的探针在多种核酸探针组合物中工作，包括RNA探针、具有合成核苷酸变体的探针或具有改变的主链(LNA、PNA、XNA)的探针，并且在结构上与多种探针设计相容，其包括分子信标、Scorpion、Taqman探针、Fret探针，其中标记可置于碱基之间、核酸碱基之外或核酸探针的5'和3'端。

尽管控制酯键的错配敏感性碱基裂解的示例性分子基于吖啶

尽管实验的实施例证明了当用生物素接头标记时错配敏感性可裂解接头的效用，但发明人设想了基于不同标记的匹配/错配使用的附加效用，其赋予在裂解后保留标记的核酸种类许多性质。实例包括荧光标记、猝灭剂、附接部分、酶、酶抑制剂、酶阻滞剂、非靶标核酸聚合物、小沟和大沟结合剂、带电标记、质量改变标记、介电泳标记(dielectrohoreticlabel)、可光裂解标记、电响应标记或在空间上阻碍蛋白质或抗体识别核酸复合物的标记。

尽管上述实施例针对核酸，但是应当理解，分离探针可以通过适当的选择靶向部分和表征方法针对其他分子(例如蛋白质、碳水化合物、脂质、小分子等)、分子复合物和/或感兴趣的细胞。例如，稀有蛋白的富集可以通过使用特定的单链抗体作为靶向基团来实现，而稀有碳水化合物的富集可以通过使用特定的凝集素作为靶向基团来实现。在这样的实施方式中，合适的检测技术可以包括印迹、免疫测定和/或质谱。类似地，可以通过选择细胞表面受体的特定结合伴侣作为靶向基团来富集特定的细胞群体。在这样的实施方式中，合适的检测技术包括显微镜检查和/或荧光激活的细胞分选。

对于本领域技术人员显而易见的是，在不背离本文的发明构思的情况下，除了已经描述的修改之外，许多更多的修改是可能的。因此，除了所附权利要求的精神，本发明的主题不受限制。此外，在解释说明书和权利要求书二者时，应以与上下文一致的尽可能广泛的方式解释所有术语。具体地，术语“包括”和“包含”应被解释为以非排他性的方式指代元件、部件或步骤，指示所引用的元件、部件或步骤可以存在、利用或与其他未明确引用的元件、部件或步骤或组合。当本说明书的权利要求涉及选自A、B、C……和N的一些中的至少一种时，则该文本应解释为仅需要组中的一个要素，而不是A加N或B加N等。