制备口服剂型的方法

本发明涉及制备口服剂型的方法、口服剂型和使用口服剂型的方法。

口服剂型在本领域中是已知的。它们包含例如片剂、丸剂、胶囊、液体、凝胶、悬浮液、泡腾制剂、靶丸、口香糖、锭剂、颗粒剂、薄膜、喷雾剂和粉剂。口服药物剂型非常方便，并且提高疗法依从性。

根据欧洲药典(Ph.Eur.)等规定，口服剂型必须具有一定均匀性的剂量单位。要求“一批口服剂型中的每个单位必须在标签要求的狭窄范围内具有活性物质含量(Ph.Eur.,2.9.40)。“活性物质含量”是指该物质以所需的量存在于剂量单位中，并且化学上未发生变化，例如未降解、未衍生化或未共价结合到其它分子上。为了实现剂量单位的这种均匀性，制备口服剂型的方法必须考虑可能影响最终剂量单位中活性物质的量和化学完整性的任何因素。随着制备口服剂型的方法的总体复杂性增加，确保最终产品中活性物质的均匀性将变得更困难。包含化学反应、反应性赋形剂的存在或使用具有反应性官能团的活性物质的制备口服剂型的方法将增加这种复杂性，并且使制造商更难以保证最终产品的均匀性和抑制化学副反应。

口服剂型可以含有活性药物成分(API)。最相关和商业上最成功的API是肽和蛋白质，包含例如抗体和酶。这些API由形成肽链的多个氨基酸组成。许多氨基酸在其侧链中具有反应性官能团。例如，半胱氨酸具有硫醇基团，或赖氨酸在其侧链中携带氨基基团。其它氨基酸在其侧链中具有进一步的反应性官能团。由于肽和蛋白质API中侧链反应基团的多样性，可能会发生多种副反应。用这些种类的API制备口服剂型尤其困难，因为它们容易发生不想要的副反应，该不想要的副反应减少剂型中未改变的API的量并影响产品的均匀性。已经发生不想要的副反应的肽和蛋白质可能形成免疫原性产物，其可能导致受试者中潜在的致命过敏反应。

在另一方面，肽和蛋白质需要复杂的剂型来确保口服生物利用度。对于具有显著分子大小的肽，诸如多肽和蛋白质，尤其如此。复杂的剂型需要复杂的生产方法，这再次使得很难排除不想要的副反应并确保它们的稳定性直到给药。这同样适用于具有相同特征(即反应基团和低固有生物利用度)的其它API。在复杂的方法中，很难以不发生相关副反应的方式控制中间阶段。因此，将优选的是具有使用不发生任何副反应或其它不想要的过程的中间体的方法。本发明的一个目的是提出一种制备口服剂型的方法，该方法克服了现有技术方法中提到的问题。另外的目的是提供具有优异均匀性的剂型。

发明内容

在一个方面中，本发明包含一种制备口服剂型的方法，包括以下步骤：

a、使至少一种CPP(细胞穿透肽)与至少一种第一脂质反应以获得CPP-脂质缀合物，

b、纯化CPP-脂质缀合物以获得纯化的CPP-脂质缀合物组合物，

c、制备脂质批料，其至少包括

c1、限定量的所述CPP-脂质缀合物，和

c2、限定量的至少一种非CPP缀合的第二脂质，

d、加工所述脂质批料以获得ζ电势大于2mV且小于10mV的CPP修饰的脂质体，

e、冻干所述CPP修饰的脂质体以获得脂质体冻干物，

f、将脂质体冻干物掺入到口服剂型中，

其中相对于所述组合物中的CPP-脂质缀合物的总摩尔量，纯化的CPP-脂质缀合物中非缀合的第一脂质的量小于5mol％。

本发明人发现，该方法允许生产口服剂型，该口服剂型在生产期间和在生产之后特别耐副反应，并且提供具有优异的均匀性和高再现性的产品。令人惊讶的是，通过该方法获得的口服剂型具有优异的产品均匀性。

在另一方面，本发明包含一种口服剂型，特别是可通过本发明的工艺获得的口服剂型，其包括CPP修饰的脂质体，所述脂质体具有

-与第一脂质缀合的至少一种CPP，

-至少一种非CPP缀合的第二脂质，和

-至少一种药物活性成分(API)，

其中所述CPP修饰的脂质体具有在50nm至250nm范围内的Z-平均直径和正ζ电势，优选地在>2mV至<10mV的范围内。

发现这些剂型具有优异的均匀性，特别是当使用肽和蛋白质作为活性物质时。除了API含量的均匀性之外，均匀性还通过脂质体ζ电势和大小的低批次间变化来确定。

根据本发明，“肽”具有至少一个肽键，将至少两个氨基酸连接在一起。“多肽”至少具有八个氨基酸。“蛋白质”至少具有30个氨基酸。本发明对于作为API的“多肽”和“蛋白质”特别有用。

术语“脂质体”是指由脂质双层组成的人工制备的囊泡。脂质体可以用于递送API，因为它们具有将部分水溶液包封在亲脂性双层膜内的独特性质。亲脂性化合物可以溶解在脂质双层中，并且通过这种方式脂质体可以携带亲脂性化合物和亲水性化合物。为了将分子递送至作用位点，脂质双层可以与其它双层诸如细胞膜融合，从而递送脂质体内容物。

ζ电势可以通过本领域中已知的方法来测定。ζ电势可以在使用pH为7.4的50mM磷酸盐缓冲液将脂质体稀释至0.95mg/ml的脂质浓度后测定。来自Malvern

具体实施方式

本发明中使用的CPP可以选自穿膜肽、TAT(转录的反式激活子)、MAP(模型两亲肽)、聚精氨酸(包含R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12)、pVEC、转运蛋白、MPG及其组合。本发明中使用的CPP可以是环化的或线性的、二聚化的或未二聚化的。CPP可能由以下序列组成，或包括以下序列。穿膜肽可以包含SEQ ID NO:1；TAT可以包含SEQ ID NO:2；MAP可以包含SEQ ID NO:3；R9可以包含SEQ ID NO:4；pVEC可以包含SEQ ID NO:5；转运蛋白可以包含SEQ ID NO:6；和/或MPG可以包含SEQ ID NO:7。所列的CPP包含上述序列的功能性衍生物。功能性衍生物包含CPP，该CPP由上述序列或与其具有至少90％或至少95％序列同一性的序列组成或包括所述序列。任选地，所述功能性衍生物可以包含另外的氨基酸。

在一个实施例中，本发明中使用的CPP是带正电荷的和/或环化的。环化的CPP具有比线性CPP更低反应性和更稳定的优点，这在本发明的概念内是有利的。环肽甚至可以在没有肠溶衣的情况下通过胃通道存活，因为它们比线性CPP对酶裂解更稳定。如本文所使用的，术语“环化的”不应被解释为仅涉及具有一个环系统的肽，即，本发明不限于单环肽。因此，本发明包含环肽，其中两个或更多个环系统彼此共价连接。此外，环肽还可以包括不属于环系统的一部分的氨基酸，即本发明包含支链环肽。优选地，环肽是单环肽，并且更优选地是无支链的单环肽。此外，CPP可以由L-氨基酸、D-氨基酸或其混合物组成，其中对于线性CPP，D-氨基酸是优选的。

在一个实施例中，CPP包括大多数赖氨酸和/或精氨酸部分，其分别具有约9.5和11的等电点。由于其额外的氨基基团或胍基团，这两个氨基酸在中性条件下并且甚至在弱碱性条件下均带正电荷。因此，在中性条件和弱碱性条件下，主要包括所述两种特定氨基酸的部分的CPP也带正电荷。在本文中，术语“大多数”是指形成CPP分子的氨基酸的至少50％，优选地至少60％，更优选地至少70％，并且特别优选地至少80％是赖氨酸和/或精氨酸部分。因此，确保了CPP在中性条件和弱碱性条件下具有正电荷，即具有大于7的等电点。因此，在本发明的一个具体实施例中，CPP具有大于7.0，优选地大于7.5，更优选地大于8.0，并且特别优选地大于8.5的等电点。在本上下文中，CPP的等电点是形成CPP的氨基酸的等电点的算术平均值。

在本发明的一个具体实施例中，CPP包括2至19个，优选地3至16个，更优选地4至14个，并且特别优选地6至12个精氨酸部分以及一或多个选自由酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和半胱氨酸组成的组的部分。例如，CPP可以在环系统中包括九个精氨酸部分和一个半胱氨酸部分，并且被称为环状半胱氨酸R9衍生物(诸如SEQ ID NO:8；RRRRRRRRRC)。另一个优选的示例是在环系统中包括九个精氨酸部分和一个赖氨酸部分的环肽，其被称为环状R9K衍生物(SEQ ID NO:9；RRRRRRRRRK)。

本发明的CPP包含二聚化的CPP，其中同型二聚体和异型二聚体在本公开的范围内。CPP的二聚化可以通过本领域中已知的任何手段来实现。在一个特定的实施例中，CPP通过三肽KAK被二聚化。

形成环肽的氨基酸不限于蛋白原性氨基酸。在本文中，氨基酸可以选自本领域中已知的任何氨基酸，并且可以包含相应的D-对映异构体、L-对映异构体或其任何混合物。

相对于脂质体中脂质(即第一脂质加上第二脂质)的总量，CPP可以以至少0.05mol％、至少0.1mol％或至少0.2mol％的量存在于CPP修饰的脂质体中。认为需要最小量的CPP以提高膜渗透性。然而，如果超过CPP的最大量，则可能会发生不想要的副反应，含量均匀性、同质性和脂质体稳定性会下降。因此，相对于脂质体中脂质(即第一脂质加上第二脂质)的总量，最大量可以被限制为4mol％、2.5mol％或1.5mol％。

根据本发明，将CPP与至少一种第一脂质缀合以获得CPP-脂质缀合物。第一脂质可以选自由类固醇(包含胆固醇及其衍生物)、脂肪酸、脂肪醇、脂肪胺、具有至少八个碳原子的碳链长度的烃、磷脂、鞘脂、神经酰胺、糖脂、醚脂质、类胡萝卜素、甘油酯及其组合组成的组。缀合可以包含形成共价键。烃优选地包括至少一个用于化学偶联的活化基团，诸如马来酰亚胺活性酯、胺醇、卤化物、硫醇、酮或醛、碳三键和/或碳双键。

在一个实施例中，脂肪酸、脂肪胺、脂肪醇和/或烃可以具有8至24个碳原子，优选地14至20个碳原子，或16至20个碳原子的碳链长度。脂肪酸、脂肪胺、脂肪醇和/或烃可以是饱和的或不饱和的。饱和化合物的优点是化学上比不饱和化合物更稳定。

在一个实施例中，磷脂可以是合成的磷脂、半合成的磷脂或天然的磷脂，或其组合。优选的磷脂包含磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、脑磷脂、磷脂酰甘油、溶血磷脂及其组合。优选的第一脂质可以选自Tfp-PEG13-DSPE[(2R)-3-((((4,46-二氧代-46-(2,3,5,6-四氟苯氧基)-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43-十三烷氧杂-3-氮杂四十六烷基)氧基)(羟基)磷酰基)氧基)丙烷-1,2-二基二硬脂酸酯(PEG(13)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-四氟苯基酯)]；Mal-PEG12-DSPE[(2R)-3-((((46-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4,44-二氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-十二烷氧杂-3,43-二氮杂四十六烷基)氧基)(羟基)磷酰基)氧基)丙烷-1,2-二基二硬脂酸酯]；1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[4-(对-马来酰亚胺甲基)环己烷-甲酰胺](钠盐)；1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷硫乙醇(钠盐)；1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(琥珀酰)(钠盐)；1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[马来酰亚胺(聚乙二醇)-2000](铵盐)；以及它们的组合。

在一个实施例中，第一脂质被活化。在CPP-脂质缀合物形成期间，第一脂质的活化可以促进CPP与第一脂质的反应。活化的第一脂质包含包括活化基团的脂质。活化基团可以是比没有活化基团的脂质对CPP具有更大反应性的基团。合适的活化基团包含活化的聚合基团(分子量超过1,000g/mol)和小分子活化基团(分子量高达1,000g/mol)。

活化的聚合基团可以包含与一或多个选自以下的基团共价连接的聚乙二醇(PEG)：马来酰亚胺基团(Mal)、活性酯，诸如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、四氟苯酚(Tfp)和对硝基苯酚酯；胺、醇、酮、醛、硫醇、卤化物、碳三键和碳双键以及它们的组合。因此，活化基团可以包括彼此共价偶联的聚合物部分和反应性基团，使得聚合物部分将反应性基团连接至脂质。示例性的活化聚合基团包含SM(PEG)

优选的活化的第一脂质包含Tfp-PEG

第二脂质可以选自由类固醇(包含胆固醇及其衍生物)、脂肪酸、脂肪醇、脂肪胺、具有至少八个碳原子的碳链长度的烃、鞘脂、神经酰胺、糖脂、醚脂、类胡萝卜素、甘油酯、磷脂及其组合组成的组。

在一个实施例中，脂肪酸、脂肪胺、脂肪醇和/或烃可以具有8至24个碳原子，优选地14至22个碳原子，或16至20个碳原子的碳链长度。脂肪酸、脂肪胺、脂肪醇和/或烃可以是饱和的或不饱和的。饱和化合物的优点是化学上比不饱和化合物更稳定。

在一个实施例中，磷脂可以是合成的磷脂、半合成的磷脂或天然的磷脂，或其组合。优选的磷脂包含磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、脑磷脂、磷脂酰甘油、溶血磷脂及其组合。

第二脂质可以与第一脂质相同或不同。在优选的实施例中，第二脂质不同于第一脂质。差异可以包含至少一种或所有第二脂质不具有任何活化基团，即第二脂质可以是未活化的。这有助于实现本发明的目的之一，即抑制在方法期间可能原本发生的任何副反应。

第二脂质的优选组合包含至少50mol％、至少60mol％或至少70mol％(相对于第二脂质的总量)的至少一种磷脂。相对于第二脂质的总量，这些脂质的量可以被限制为最大值99mol％，或97mol％或95mol％。可替代地或另外地，第二脂质可以包含一定量的类固醇，诸如胆固醇，其相对于第二脂质的总量可以为1mol％至20mol％，或4mol％至12mol％。

本发明的CPP-脂质缀合物可以具有以下一般结构：

FL-AG-CPP (式I)

在此式中，FL代表第一脂质，AG代表任选的活化基团，并且CPP代表细胞穿透肽。连字符代表共价键。换句话说，CPP-脂质缀合物包括共价连接到CPP的第一脂质，其中共价键可以任选地通过活化基团获得，或者直接获得，其间没有任何活化基团或其它中间基团。

优选的CPP-脂质缀合物具有在1,000至10,000g/mol，优选地1,200至5,000g/mol，或1,500至3,500g/mol范围内的分子量。相对于CPP修饰的脂质体的总重量，CPP修饰的脂质体中CPP-脂质缀合物的相对重量可以在1至25重量％的范围内。优选的下限包含2重量％、3重量％和5重量％。优选的上限包含20重量％、15重量％和10重量％。

使至少一种CPP与至少一种第一脂质反应以获得CPP-脂质缀合物的步骤可以包含在反应容器中制备至少一种CPP与至少一种第一脂质的混合物。混合物可以包含液体介质。

反应混合物可以包含相对于第一脂质摩尔过量的CPP。在实施例中，CPP的摩尔比例超过反应混合物中第一脂质的摩尔比例至少1.5倍，优选地至少2倍，或至少2.5倍。使用相对于第一脂质过量的CPP减少了反应后反应混合物中未反应的第一脂质的量。这具有某些益处。一个益处是纯化CPP-脂质缀合物以获得纯化的CPP-脂质缀合物组合物的后续步骤需要较少的努力。这是因为CPP与CPP-脂质缀合物之间的物理化学差异大于第一脂质与CPP-脂质缀合物之间的物理化学差异。因此，与从CPP-脂质缀合物分离未反应的第一脂质相比，从CPP-脂质缀合物分离未反应的CPP更容易。此外，未反应的第一脂质具有与氨基酸反应的倾向，特别是如果第一脂质携带至少一个活化基团以进一步促进第一脂质与CPP的反应。在产品中具有相关量的未反应的第一脂质后，API与第一脂质发生不想要的反应的风险将增加。肽和蛋白质API尤其如此。

已经发现，在单独的反应中，即在脂质体形成之前，使CPP和第一脂质反应，导致更均匀的口服剂型，其精确地含有预定量的CPP。此外，该方法在经济上更有效，因为使用更少的CPP和第一脂质。在现有技术中，CPP修饰的脂质体通过使CPP与脂质体反应来制备，即CPP与脂质的反应在脂质体已经被制备之后进行。在本发明中，首先产生CPP-脂质缀合物，并且然后形成含有预先产生的CPP-脂质缀合物的脂质体。这确保了脂质体中存在的CPP-脂质缀合物的量可以根据预期目的的需要进行精确调节。如上所述，脂质体中的CPP(和CPP-脂质缀合物)的量应该很好地平衡，使得对API的膜渗透的积极作用，特别是对肽和蛋白质的积极作用最大化，而脂质体的稳定性和均匀性不会由于超过最大量的CPP而处于危险中。已经发现，通过在形成脂质体之前在单独的反应中使CPP和第一脂质反应，可以在脂质体中使用更高量的CPP，而没有超过相应的脂质体所允许的最大量的风险。因此，这种特定的方法步骤顺序增加了CPP对口服生物利用度的积极影响，而不会对脂质体的均匀性和稳定性产生负面影响。特别地，对于本发明的脂质体，在冷冻干燥/冻干期间的脂质体稳定性非常高。

优选地，使至少一种CPP与至少一种第一脂质反应以获得CPP-脂质缀合物的步骤包括在第一液体介质中形成CPP和第一脂质的溶液。合适的第一液体介质包含有机溶剂，诸如选自芳族醇和脂族醇、卤代烷烃或非卤代烷烃、羧酸酯和酰胺及其组合的有机溶剂。

本发明的方法包含纯化CPP-脂质缀合物以便获得纯化的CPP-脂质缀合物组合物的步骤。该步骤对于实现本发明的目标之一(即增加口服剂型的均匀性和避免副反应，特别是脂质与API的反应)是重要的。如前所述，口服剂型的均匀性包含API在生产和储存期间不会发生化学变化。该方法包含使CPP与第一脂质反应的步骤。因此，第一脂质对肽具有一定的反应性。已经发现，如果在形成CPP-脂质缀合物之后对其进行纯化，则可以减少不想要的副反应。优选地，在纯化后，相对于所述组合物中CPP-脂质缀合物的总摩尔量，CPP-脂质缀合物组合物中非缀合的第一脂质的量小于5mol％。在优选的实施例中，所述组合物中非缀合的第一脂质的量小于3mol％，小于1mol％，或甚至小于0.5mol％。通过减少非缀合的第一脂质的量，并且从而固有地减少反应性第一脂质的量，不想要的副反应的量被减少。在优选的实施例中，不仅纯化的CPP-脂质缀合物组合物具有这些有限量的非缀合的第一脂质，而且最终的CPP修饰的脂质体可以用于口服剂型。

CPP-脂质缀合物的纯化可以通过例如HPLC、尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法或本领域技术人员已知的其它合适方法进行。通常，为了将非缀合的第一脂质与CPP缀合的第一脂质分离，必须非常仔细地纯化缀合物，因为这两种物质具有非常相似的物理化学性质。在纯化CPP-脂质缀合物期间，还应除去任何未反应的CPP，这很容易实现，因为在CPP与脂质之间存在物理化学差异。

在优选的实施例中，纯化CPP-脂质缀合物以获得纯化的CPP-脂质缀合物组合物包含以下步骤：

b1、将CPP-脂质缀合物与非缀合的第一脂质分离，和

b2、任选地将CPP-脂质缀合物与携带多于一种CPP的非缀合的CPP和/或缀合物分离。

步骤b1和b2不需要在单独的步骤中进行，但可以与适当的方法(诸如HPLC)一起进行。

本发明的方法包含制备脂质批料的步骤，所述脂质批料包括：

c1、限定量的所述CPP-脂质缀合物，和

c2、限定量的至少一种非CPP缀合的第二脂质。

在纯化后，使用纯化的CPP-脂质缀合物组合物与第二脂质一起来制备脂质批料。第二脂质可能保持未缀合。本发明的一个优点是可以使用限定量的CPP-脂质缀合物来制备脂质批料。在现有技术中，由于缀合物是在脂质体制备之后形成的，因此最终产物中CPP-脂质缀合物的确切量仍然未限定。在优选的实施例中，非CPP-缀合的第二脂质与CPP-脂质缀合物的重量比为至少7:1，更优选至少15:1，并且最优选至少20:1。在脂质批料中使用限定量的CPP-脂质缀合物的益处在于，所述方法可以使用非常接近最大有用量的CPP量，而不存在添加太多CPP的风险，这可能增加剂型的不想要的副反应的风险。选择上述比率已显示出产生用于在本发明的方法期间进一步加工的稳定脂质体。

在某些实施例中，制备脂质批料的步骤包括在第二液体介质中形成CPP-脂质缀合物和非CPP-缀合的第二脂质的混合物(例如溶液)。优选的第二液体介质选自芳族醇和脂族醇、卤代烷烃或非卤代烷烃、羧酸酯和酰胺及其组合。第一液体介质和第二液体介质可以相同或不同。

作为下一步骤，该方法包含加工脂质批料以获得ζ电势大于2mV且小于10mV的CPP修饰的脂质体。一般而言，较高的ζ电势有助于增加脂质体的性质，以促进API的膜渗透。然而，如果ζ电势太高，则脂质体将不稳定并且不太均匀。本发明的益处之一是ζ电势可以被调节到接近最大极限，而没有稳定性的风险。根据用于脂质体的脂质和CPP的确切类型，ζ电势的确切值可以变化。在某些实施例中，ζ电势高达8mV，或高达6mV。本发明的方法具有的优点是不同批次的脂质体之间的ζ电势的变化非常小。

在优选的实施例中，加工脂质批料以获得CPP修饰的脂质体包含高压均质化、挤出、乙醇注射和/或双不对称离心(DAC)。这些工艺在本领域中是已知的。

在一个实施例中，加工脂质批料以获得CPP修饰的脂质体的步骤包含：

d1、将至少一种药物活性成分掺入到CPP修饰的脂质体中。

本发明特别可用于蛋白质和肽，诸如具有至少八个氨基酸的多肽。本发明的方法允许甚至更大分子的良好掺入效率。不希望受该理论的束缚，基于膜的组成及其生产方法，脂质体具有良好的膜流动性。膜流动性被认为与API的掺入、冻干和API跨膜递送相关。因此，应避免任何可能对膜流动性具有负面影响的组分。这些组分包含四醚脂质。相对于脂质体中脂质的总量，脂质体中四醚脂质的量优选地被限制为小于1mol％的量。优选地，该量被限制为小于0.1mol％或甚至小于0.01mol％。

本发明的一个重要方面是，当掺入API时，脂质体已经被CPP修饰。在后期用CPP修饰脂质体的现有技术方法中，需要升高的温度，这会对API稳定性产生负面影响。此外，在现有技术方法中，活化的脂质可能共价地修饰API。因此，本发明的方法避免了对肽和蛋白质非常有用的API劣化。

可用于本发明的API包含蛋白质和肽，特别是多肽。优选的API具有在1,000至150,000g/mol，优选地10,000至100,000g/mol，或30,000至80,000g/mol的范围内的分子量。优选的API可以选自抗癌药剂(例如利妥昔单抗、曲妥单抗、纳武单抗)；免疫调节剂(例如阿达木单抗、依坦西普、细胞因子、干扰素、醋酸格拉替雷)；激素，诸如胰岛素、GLP-1类似物、生长抑素及其类似物、hGh和奥曲肽；糖肽抗生素，例如万古霉素和达托霉素；用于肝炎治疗的肽药物，诸如Myrcludex B；以及作用于细胞受体诸如胰高血糖素、亮丙瑞林、奥曲肽、血管加压素和西妥昔单抗的肽和抗体。

合适的API包含但不限于万古霉素、醋酸格拉替雷、Myrcludex B、奥曲肽、胰岛素和利拉鲁肽，以及其它GLP(胰高血糖素样肽)类似物，诸如艾塞那肽、利西那肽、阿必鲁肽、杜拉鲁肽、他司鲁泰和索马鲁肽，以及抗体(例如依那西普；培非格司亭；阿达木单抗、英夫利昔单抗、利妥昔单抗、促红细胞生成素α、曲妥珠单抗、雷珠单抗、β-干扰素、奥马珠单抗)。其它示例包含选自由激素诸如人生长激素、生长激素释放激素、生长激素释放肽、干扰素、集落刺激因子、白细胞介素、巨噬细胞激活因子、巨噬细胞肽、B细胞因子、T细胞因子、蛋白A、过敏抑制剂、细胞坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、肿瘤抑制因子、转移生长因子、α-1抗胰蛋白酶、白蛋白及其片段多肽、载脂蛋白E、促红细胞生成素、因子VII、因子VIII、因子IX、纤溶酶原激活因子、尿激酶、链激酶、蛋白C、C反应蛋白、肾素抑制剂、胶原酶抑制剂、超氧化物歧化酶、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、成骨生长因子、骨刺激蛋白、胰岛素、心房肽、软骨诱导因子、结缔组织激活因子、卵泡刺激激素、黄体化激素、黄体化激素释放激素、神经生长因子、甲状旁腺激素、松弛素、分泌素、生长介素、胰岛素样生长因子、肾上腺皮质激素、胰高血糖素、胆囊收缩素、胰腺多肽、胃泌素释放肽、促肾上腺皮质激素释放因子、促甲状腺激素、抗各种病毒、细菌或毒素的单克隆或多克隆抗体、病毒衍生的疫苗抗原、环孢菌素、利福霉素、洛匹那韦、利托那韦、特拉万星、奥利万星、达巴万星、双膦酸盐、伊曲康唑、达那唑、紫杉醇、萘普生、辣椒素、硫酸沙丁胺醇、硫酸特布他林、盐酸苯海拉明、马来酸氯苯那敏、盐酸氯雷替丁、盐酸非索非那定、保泰松、硝苯地平、卡马西平、倍他米松、地塞米松、泼尼松、氢化可的松、17β-雌二醇、酮康唑、甲芬那酸、倍氯米松、阿普唑仑、咪达唑仑、咪康唑、布洛芬、酮洛芬、泼尼松龙、甲基强的松龙、苯妥英钠、睾丸素、氟尼缩松、二氟尼柳、布地奈德、氟替卡松、胰高血糖素样肽、C肽、降钙素、黄体化激素、催乳素、促肾上腺皮质激素、亮丙瑞林、干扰素α-2b、干扰素β-la、沙格司亭、阿地白介素、干扰素α-2a、干扰素α-n3α蛋白酶抑制剂、依替膦酸盐、那法瑞林、绒毛膜促性腺激素、前列腺素E2、依前列醇、阿卡波糖、二甲双胍、去氨加压素、环糊精、抗生素、抗真菌药物、类固醇、抗癌药物、镇痛药、抗炎剂、驱肠虫剂、抗心律失常剂、青霉素类、抗凝血剂、抗抑郁剂、抗糖尿病剂、抗癫痫剂、抗组胺剂、抗高血压剂、抗毒蕈碱剂、抗分枝杆菌剂、抗肿瘤剂、CNS-活性剂、免疫抑制剂、抗甲状腺剂、抗病毒剂、抗焦虑镇静剂、催眠药、安定药、收敛剂、β-肾上腺素受体阻断剂、血液产品和替代物、心肌收缩药、造影剂、皮质类固醇、镇咳剂、祛痰剂、粘液溶解剂、利尿剂、多巴胺能药、抗帕金森药、止血剂、免疫剂、脂质调节剂、肌肉松弛剂、副交感神经模拟剂、甲状旁腺降钙素、前列腺素、放射性药物、性激素、抗过敏剂、兴奋剂、厌食剂、拟交感神经药、甲状腺剂、血管舒张剂、黄嘌呤、肝素、治疗性寡核苷酸、生长抑素及其类似物组成的组的药物活性剂，以及药理学上可接受的有机盐和无机盐或其金属复合物。

本发明的方法包含冻干CPP修饰的脂质体以获得冻干物的步骤。优选的冻干物具有有限的含水量，优选地不超过5重量％，或小于3重量％。含水量可以通过卡尔-费歇尔滴定法或诸如含水量分析仪等自动系统测定。与CPP修饰的脂质体的液体制剂相比，冷冻干燥的/冻干的脂质体具有更好的长期稳定性。本发明的脂质体的一个重要性质是脂质体的均匀性在冻干期间没有显著变化。一方面，该性质受到如上所述的本发明的方法的影响。另一方面，冻干保护剂的选择并且尤其是用量对于实现该性质很重要。

冻干CPP修饰的脂质体以获得脂质体冻干物的步骤可以包含：

e1、制备所述CPP修饰的脂质体和至少一种冻干保护剂的混合物。

已经表明，与混合物中的脂质的量相关，存在最佳的冻干保护剂用量范围。优选地，冻干保护剂的量的范围为每克脂质0.01至2g冻干保护剂，优选地每克脂质0.02至1g，或每克脂质0.03至0.5g。在优选的实施例中，最小值为每1g脂质至少0.03g。最大值可以是每克脂质0.3、0.2或0.1g冻干保护剂。在本文中，“脂质”是指组合物中缀合的或未缀合的第一脂质和第二脂质的总量。发现较低量的冻干保护剂将使脂质体不稳定，降低Z-平均值，并且从而影响产品的均匀性。较高量的冻干保护剂量是不期望的，因为较高的量不会进一步增加积极效应，并且许多冻干保护剂不适合于糖尿病患者，使得应限制该量。因此，冻干保护剂的量应优选地不超过每1g脂质0.5g。在实施例中，关于冻干保护剂的量相对于脂质的量的这些限制也适用于口服剂型和脂质体。

冻干保护剂可以选自糖类，优选地单糖或二糖，包含糖和糖醇。冻干保护剂可以选自蔗糖、甘露醇、葡萄糖、海藻糖、乳糖、帕拉金糖及其组合。

在优选的实施例中，在脂质体冻干物在水中重构后，CPP修饰的脂质体的ζ电势和/或Z-平均值没有显著变化。特别地，与冻干前的相应值相比，ζ电势和/或其Z-平均值的变化不超过5％，优选地不超过3％。这表明通过本发明的方法获得的脂质体特别稳定，并且具有优异的膜流动性。

可以在溶剂中制备CPP修饰的脂质体和冻干保护剂的混合物。溶剂可以是水性的，诸如包括至少50重量％水或至少75重量％或至少95重量％水的溶剂。可以将溶剂缓冲至2至12、4至10或5.5至8.5的pH值。在优选的实施例中，溶剂是PBS(磷酸盐缓冲盐水)。

最后，冻干包含本领域中已知的CPP修饰的脂质体和冻干保护剂的混合物的冷冻干燥。

掺入脂质体冻干物的步骤可以包含但不限于制备片剂、丸剂、胶囊、药丸、液体(包含悬浮液)、粉剂、薄膜、泡腾制剂、糊剂、菱形锭剂、口香糖、凝胶、喷雾剂或颗粒剂。

根据本发明，固体口服剂型可以进一步包括至少一种药学上可接受的赋形剂，和/或至少一种蛋白酶抑制剂，和/或至少一种脂肪酶抑制剂。可以将这些物质掺入到剂型中。所述物质可以存在于脂质体的内腔中、脂质体的脂质双层中(例如通过共价或非共价连接形成双层的一部分)或脂质体的外部(例如在剂型的其它部分中)。优选地，所述至少一种药学上可接受的赋形剂选自由脱水山梨醇单硬脂酸酯、三棕榈酸甘油酯、棕榈酸十六烷基酯、藻酸盐、油酸乙酯、C8甘油三酯、C10甘油三酯、纤维素、二糖、单糖、低聚糖、硬脂酸镁、玉米淀粉、柠檬酸、酒石酸、氨基酸的酸式盐及其组合组成的群组。此外，所述至少一种蛋白酶抑制剂优选地选自由抑肽酶、大豆胰蛋白酶抑制剂、杆菌肽、甘氨胆酸钠、苯丁抑制素、亮肽素、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、甲磺酸卡莫司他及其组合组成的群组。此外，所述至少一种脂肪酶抑制剂优选地选自由奥利司他、利普司他汀、几丁质、壳聚糖、皂苷、黄酮苷、多酚、厄比内酯A和B、抑酯酶素、缬基内酯、盘克立辛、原花青素、韧革菌素及其组合组成的群组。

CPP修饰的脂质体具有非常稳定和均匀的优点。优选地，它们具有在50nm至250nm的范围内的Z平均直径。Z平均直径的术语和确定是本领域技术人员已知的。此值在ISO22412:2008中定义。在优选的实施例中，CPP修饰的脂质体具有75nm的最小Z-平均直径，或更优选地100nm。最大Z平均直径可以被限制为225nm。CPP修饰的脂质体的PDI可以小于0.5、小于0.45、小于0.4或小于0.3。

在优选的实施例中，在脂质体冻干物在水中重构后，CPP修饰的脂质体的ζ电势和/或Z-平均值没有显著变化。特别是，与冻干前的相应量相比，ζ电势的变化和/或Z-平均值的变化不超过5％，优选地不超过3％。这表明如通过本发明的方法获得的脂质体特别稳定。

可以将API包埋在CPP修饰的脂质体中。根据其亲水性，API将主要存在于脂质体内(其中环境可能是水性的)，或存在于脂质体的双层内(其中环境更亲脂性)。对于蛋白质和多肽，API可能主要存在于脂质体中。在脂质体中，第二脂质将形成双层的一部分。

相对于脂质体中脂质(即第一脂质加上第二脂质)的总量，CPP可以以至少0.05mol％、至少0.1mol％或至少0.2mol％的量存在于CPP修饰的脂质体中。认为有必要使用最低量的CPP以提高API的膜渗透性。然而，如果超过了CPP的最大量，则可能会发生不想要的副反应，含量均匀性和脂质体稳定性将下降。因此，相对于脂质体中脂质(即第一脂质加上第二脂质)的总量，最大量可以被限制为4mol％、2.5mol％或1.5mol％。

口服剂型中的CPP修饰的脂质体可以具有正ζ电势，优选地在>2mV至<10mV的范围内。在实施例中，ζ电势高达8mV或高达6mV。具有该ζ电势的脂质体已被证明是稳定的；它们甚至在冷冻干燥和随后的重构之后仍保持其ζ电势。

优选地，相对于所述脂质体中CPP-脂质缀合物的总摩尔量，CPP修饰的脂质体中非缀合的第一脂质的量小于5mol％。在优选的实施例中，所述脂质体中非缀合的第一脂质的量小于3mol％，小于1mol％，或甚至小于0.5mol％。通过减少非缀合的第一脂质的量，并由此固有地减少反应性第一脂质的量，不想要的副反应的量被减少，使得脂质体对降解更稳定。

本发明还涉及一种包括本文所述的CPP修饰的脂质体的口服剂型，其具有

-与第一脂质缀合的至少一种CPP，

-至少一种非CPP缀合的第二脂质，和

-至少一种药物活性成分(API)，

其中所述CPP修饰的脂质体具有在50nm至250nm范围内的Z-平均直径和正ζ电势，优选地在>2mV至<10mV的范围内。口服剂型可以通过本文所述的方法获得。

本发明包含口服剂型，其中相对于CPP修饰的脂质体中CPP-脂质缀合物的总摩尔量，CPP修饰的脂质体中非缀合的第一脂质的量小于5mol％，优选地小于3mol％。

口服剂型并不特别限于其特定种类。固体口服剂型是优选的。在一些实施例中，口服剂型是抗胃剂型，诸如肠溶衣剂型，其可以在口服摄入之后保护API免受胃液的影响。剂型可以是片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、靶丸或其组合。

根据本发明的治疗方法包含向需要其的受试者施用含有有效量的API的本发明的口服剂型的步骤。受试者可以是人类。在实施例中，本发明的口服剂型是用于治疗或诊断方法的组合物。

附图说明

图1根据本发明制备的CPP修饰的脂质体与通过将CPP直接偶联到脂质体上获得的CPP修饰的脂质体的比较。

图2根据本发明制备的相同批次的脂质体之间ζ电势的低变化。

图3根据本发明制备的不同批次的脂质体之间ζ电势的低变化。

图4不同脂质体制备方法的温度对脂质体特征的影响。

图5对于不同量的作为冻干保护剂的蔗糖在冻干过程之前和之后的Z-平均值的比较。

图6在使用不同量的蔗糖作为冻干保护剂的冻干过程之前和之后脂质体特征的比较(大小；PDI)。

图7在冻干过程之前和之后CPP脂质体的ζ电势的比较。

图8在使用不同量的蔗糖作为冻干保护剂冻干后CPP-脂质体的Z-平均值和PDI。

图9用活化的第一脂质制备脂质体用于CPP的回顾性偶联后修饰的API(万古霉素)的鉴定。

图10 API(万古霉素)与活化的第一脂质的缀合物的结构。

图11不同缓冲液中脂质体大小的比较。

图12不同缓冲液中PCI的比较。

图13不同缓冲液中ζ电势的比较。

图14在不同API的情况下脂质体大小的比较。

图15在不同API的情况下PCI的比较。

图16在不同API的情况下ζ电势的比较。

图17A包括活化的脂质Tfp-PEG

图17B包括活化的脂质Mal-PEG

图18A Tfp-PEG

图18B Mal-PEG

环状R9肽(R9C和R9K)的合成

在容量为0.89mmol/g的氯-(2'-氯)三苯甲基聚苯乙烯树脂上进行肽合成。加载是在DCM中用每克树脂0.8mmol的Fmoc-Lys(Boc)-OH或Fmoc-Cys(Trt)-OH以及3当量的DIPEA进行2h。通过用17:2:1的DCM/MeOH/DIPEA的混合物加载MeOH来猝灭过量的2-氯三苯甲基官能团。在移除Fmoc保护基团后，连续进行了九个步骤，使在DMF中的Fmoc-Arg(Pbf)-OH与过量的7当量的fmoc-氨基酸、6.6当量的HBTU和4当量的DIPEA偶联，随后通过在DMF中用20％哌啶处理移除Fmoc基团。在中间步骤中，用DMF严格洗涤树脂。通过7:2:1的DCM/三氟乙醇/乙酸的混合物实现侧链保护肽的裂解。裂解液与甲苯在旋转蒸发器上共蒸发三次。将侧链保护肽溶解在浓度为3mg/ml的DMF中。使用4当量的PyAOP和DIPEA在室温下进行环化反应过夜。

在用水(3％v/v)终止反应后，将溶液浓缩至起始体积的五十分之一至百分之一，并且通过倒入冷的叔丁基甲基醚中沉淀出侧链保护的环肽。将沉淀的受保护的环肽干燥，并且然后用在TFA中的5％二硫代乙醇混合物脱保护。用二乙醚沉淀后，使用

CPP-脂质缀合物的合成

向溶解在DMF中的浓度为5mg/ml的马来酰亚胺-PEG(12)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(Iris Biotech)或PEG(13)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-四氟苯基酯(Iris Biotech)中加入3当量的CPP(环状R9肽)和10当量的DIPEA。反应混合物在室温下搅拌过夜。用1:2的ACN/H

脂质体的制备：

首先，将相应的脂质(EPC、胆固醇、马来酰亚胺-PEG(12)-二硬脂酰磷脂酰-乙醇胺、PEG(13)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-四氟苯基酯)溶解在甲醇或氯仿中，以便获得贮备溶液(7-10mg/ml)。CPP-脂质-缀合物也以7mg/ml的浓度溶解在甲醇中。以相应的比率混合所需量的每种贮备溶液，并通过加热至40℃的氮气流蒸发有机溶剂。

将所得到的脂质混合物在冷冻干燥器(AdVantage Plus XL-70,SP Scientific)中干燥1h。

使用SpeedMixer

通过zetasizer测量来确定脂质体特征。通过大小排阻色谱法(NAP5柱)来纯化脂质体，并再次测定脂质体特征。

脂质体制备后CPP的偶联(比较)

制备了含有1％的马来酰亚胺-PEG(12)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(Iris Biotech)或PEG(13)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-四氟苯基酯(Iris Biotech)的脂质体。将所需的环状-CPP(cycR9C或cycR9K)溶解在PBS(0.5至2mg)中，加入到脂质体混悬液中并孵育过夜(室温至50℃)。通过zetasizer测量来确定脂质体特征。通过大小排阻色谱法(NAP5柱)去除游离CPP，并再次测定脂质体特征。

Zetasizer测量

使用来自Malvern

冷冻干燥：

为了获得固体脂质体制剂，将脂质体在Virtis Advantage Plus XL-70冷冻干燥器中冷冻干燥。主干燥在-20℃下进行2天，然后在0℃下进行二次干燥持续至少6h。使用不同量的蔗糖作为冷冻保护剂。简言之，脂质体按上述制备，并加入所需量的蔗糖。将脂质体悬浮液分成50μl等分试样并冻干。为了评估冻干的产品的质量，使用50μl的PBS对脂质体进行再水合，并测定大小、z-平均值和PDI。

ζ电势缀合物与偶联后脂质体产生的比较(图1)

最高的ζ电势可以通过我们的缀合和合成策略获得。制备脂质体后的CPP偶联不会导致相同的高ζ电势值，即使使用高过量的CPP。结果在图1中示出。可以看出，本发明的方法与称重用于脂质体制备的预合成的缀合物一起，在3.5mV的区域内产生非常高的ζ电势值。使用常规制备技术(其中缀合物在脂质体制备后合成)，使用不同量(eq＝相对于第一脂质的当量)的CPP无法达到如此高的ζ电势值。值得注意的是，使用八当量的R9C只能获得轻微的正ζ电势。

ζ电势的批内变化(图2)

图2显示，根据本发明制备的同一批脂质体的样品之间的ζ电势的变化非常小。下表显示了基础数据：

ζ电势的批次间变化(图3)

图3显示根据本发明制备的不同批次的脂质体之间ζ电势的变化非常小。

显示了两种不同脂质体生产工艺(批次1和2)的ζ电势的比较。该图强烈地强调了通过我们的生产方法得到的ζ电势的高再现性。

脂质体的生产与温度无关(图4)

在脂质体生产后，CPP-脂质体和偶联CPP的脂质体的ζ电势的比较。不完全的偶联通过较低的ζ电势清楚地示出。因此，该图显示了通过我们的方法生产的脂质体的高再现性，ζ电势高且恒定，与生产期间的温度无关。

冻干前和冻干后的Z-平均值(图5)

用0.039mg和0.39mg蔗糖/1mg脂质作为冻干保护剂进行冷冻干燥的CPP脂质体的Z-平均值比较。通过在冻干过程之前和之后恒定的Z-平均值来证明成功的冻干。

冻干前和冻干后的大小和PDI(图6)

使用0.39mg蔗糖/1mg脂质作为冻干保护剂进行冷冻干燥的CPP脂质体的大小和PDI的比较。通过在冷冻干燥过程之前和之后的恒定大小和PDI来证明成功的冻干。

冻干前和冻干后的ζ电势(图7)

使用0.39mg蔗糖/1mg脂质作为冻干保护剂进行冷冻干燥的CPP脂质体的ζ电势的比较。通过在冷冻干燥之前和之后的恒定的ζ电势来证明成功的冻干。

使用不同量的蔗糖作为冻干保护剂冷冻干燥的CPP-脂质体的Z-平均值和PDI(图8)

使用不同量的蔗糖作为冻干保护剂(0.0039mg-0.39mg蔗糖/1mg脂质)冻干的CPP脂质体的Z-平均值和PDI的比较。冻干的极限通过用过低量的蔗糖(0.0078mg和0.0039mg蔗糖/1mg脂质)冻干的制剂的脂质体Z-平均值和PDI的大幅增加来证明。

在用活化的第一脂质制备脂质体后修饰的API(万古霉素)的鉴定(图9)

在制备含有API的CPP脂质体后和在制备包括活化的第一脂质(PEG(13)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-四氟苯基酯)的含API的脂质体后的API(万古霉素)质谱的比较，用于CPP的回顾性偶联。

脂质体用MeOH/ACN/水3/1/1+0.1％甲酸溶解。通过直接注入在Waters Xevo G2-XS QTof质谱仪上记录高分辨率质谱。

A)含API的CPP脂质体的质谱。编号的峰对应于：1：Tfp-PEG

B)含有API的脂质体的质谱，该脂质体包括用于CPP的回顾性偶联的活化的第一脂质。编号的峰对应于：1：对应于Tfp-PEG

C)在m/z 966.57处信号的碰撞诱导的分解(CID)后的质谱(子谱)，其对应于Tfp-PEG

通过活化的第一脂质修饰的API的结构(图10)

在制备含有活化的第一脂质的脂质体后鉴定的Tfp-PEG

脂质体对缓冲液和API变化的稳健性(图11至16)

本发明的脂质体具有很大的均匀性。这包含即使使用不同的缓冲液或活性成分，重要的脂质体性质也保持不变。

将如上制备的脂质体悬浮在不同的缓冲液中，并测量其大小、PDI和ζ电势。图11、12和13证实，尽管pH值从5.4至7.2急剧变化，但这些脂质体参数基本上保持不变。

在另一个实验中，使用不同的活性剂(即奥曲肽和万古霉素)制备脂质体。在这两种情况下，均使用了20mg/ml的API。图14、15和16显示，重要的脂质体参数大小、PDI和ζ电势几乎不受影响。

数据证实，本发明的脂质体是非常稳健的，并且允许在各种不同的组合物和环境中具有基本上恒定的脂质体性质。

含胰岛素的脂质体的质谱(图17A至18B)

图17A和B显示了在准备随后的脂质体表面修饰期间，在Waters Xevo GS-2-XSQTof上获得的包括活化脂质的胰岛素的脂质体制剂的高分辨率质谱。

图17A涉及含有Tfp-PEG

图17B显示了含有Mal-PEG

图17A和17B显示了本发明的制备方法的高益处，其可以通过在脂质体制备之前除去游离的、活化的第一脂质来避免API修饰。

序列表

<110> 海德堡大学（Universität Heidelberg）

<120> 制备口服剂型的方法

<130> UH0002P-EP

<160> 9

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 黑腹果蝇

<400> 1

Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys

1 5 10 15

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 人类免疫缺陷病毒1型

<400> 2

Cys Gly Arg Lys Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Cys

1 5 10 15

<210> 3

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工设计的细胞穿透肽

<400> 3

Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly

1 5 10 15

Ala Trp Ser Gln Pro Lys Ser Lys Arg Lys Val

20 25

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工设计的细胞穿透肽

<400> 4

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

<210> 5

<211> 18

<212> PRT

<213> 小家鼠

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (18)..(18)

<223> K-酰胺

<400> 5

Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His

1 5 10 15

Ser Lys

<210> 6

<211> 28

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (28)..(28)

<223> L-酰胺

<400> 6

Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu

1 5 10 15

Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Ile Ser Ile Leu

20 25

<210> 7

<211> 27

<212> PRT

<213> 人类免疫缺陷病毒

<400> 7

Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly

1 5 10 15

Ala Trp Ser Gln Pro Lys Ser Lys Arg Lys Val

20 25

<210> 8

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工设计的细胞穿透肽

<400> 8

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Cys

1 5 10

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工设计的细胞穿透肽

<400> 9

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys

1 5 10