检测NG淋病奈瑟菌的引物和试剂盒
文献发布时间:2023-06-19 10:49:34
技术领域
本发明属于生命科学和生物技术领域,特别涉及检测NG淋病奈瑟菌的引物和试剂盒。
背景技术
淋病奈瑟菌(Niesseria gonorrhoese,NG)1879年由Neisser发现,简称为淋球菌,是引起淋病的病原体,属奈瑟菌属。淋病奈瑟菌为革兰阴性双球菌,无鞭毛或芽孢,有菌毛和荚膜,需氧,具有氧化酶和触酶。致病因素有菌毛、荚膜、外膜蛋白、IgA蛋白酶和脂多糖等。传统的病原体检测方法包括涂片法、细菌培养、免疫学技术等普遍存在检出率低、周期长、特异性差等缺点,给临床诊断带来困难。NG主要通过直接涂片镜检和培养的方法进行鉴定。但目前一些患者存在着不规则用药等现象,而且临床还出现少量对于培养基中万古霉素敏感的菌株,因此作为“金标准”的培养方法也可能出现假阴性。
淋病奈瑟菌基因组长2.154Mb,一般基因检测的靶基因可为其隐蔽性质粒,染色体基因,抗淋球菌胞嘧啶DNA甲基转移酶基因,透明蛋白基因,菌毛DNA,rRNA和porA假基因。
通过一代测序法检测,可以对奈瑟菌高度保守区域进行特异性片段扩增,对扩增产物进行测序,测序数据与标准序列比对,以鉴定是否为淋病奈瑟菌,以及其变型情况进行鉴定。
发明内容
鉴于核酸检测是直接检测病原体核酸,具有高敏感,高特异和短检测窗口期等优点,同时一代测序相对荧光定量PCR法,可以鉴定细菌变异情况,同时避免因细菌变异导致的漏检发生。本发明提供了一种一代测序检测NG淋病奈瑟菌的引物和试剂盒,用于检测淋病奈瑟菌核酸。
一种检测NG淋病奈瑟菌的引物,其特征在于所述引物包括:扩增NG淋病奈瑟菌的扩增引物和测序引物,测序引物与扩增引物相同;其碱基序列为:
NG F1:GATGACTTACCTGCCGCTGTT
NG R1:TTGCCTTACTTACTCCGCCATT。
供检测NG淋病奈瑟菌的方法,包括以下步骤:
(1)用PCR扩增已提取的DNA;
(2)对步骤1中的扩增产物进行测序;
(3)对测序结果进行判断,鉴定NG淋病奈瑟菌;
本发明的第二个目的是提供一种检测NG淋病奈瑟菌的试剂盒,所述试剂盒包括检测体系PCR扩增反应液、测序体系反应液,其特征在于,所述检测体系PCR扩增反应液包括一对扩增引物NG F1、NG R1,所述测序体系反应液包括一对测序引物NG F1、NG R1,其序列均为:
NG F1:GATGACTTACCTGCCGCTGTT
NG R1:TTGCCTTACTTACTCCGCCATT。。
进一步地,所述检测体系PCR扩增反应液还包括10×PCR Buffer;2mM dNTPs;KODFX DNA Polymerase(1U/μl)。
进一步地,所述测序体系反应液还包括测序纯化液、EDTA、无水乙醇、75%乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)。
进一步地,所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品;阳性对照品含NG阳性质粒,序列如下:
aacattatggatgacggccgccgcaagatgacttacctgccgctgttcgatgcgtccgaactgaaggcgggggacgaaacgggcggcacggtgcggatacttttgggttcgcccgacaaagagatgaaggaaatttcggaaaaggcggcaaaaaatttcaacatacaatatgtcgcgccgcatccccgccagacctacgggctttccggcgtaaccgcgttaaattcgccctatgtcatcgaagactatattttgcgcgaaattaagaaaaacccgcatacgaggtatgaaatttatacctttttcagcggtgcggcgttgacgatgaaggattttcccaatgtgcacgtttacgcattgaaaccggcttcccttccggaagattattggctcaagcccgtttatgcgctgttccgtcaggccgacattccgattttggcatttgacgataaaaatcaatcgcatggtaaatcaaaatagaaaatggcggagtaagtaaggcaaaaatcaggatatggcgtattttttgaattgaagataatttccgatt;
阴性对照品为去离子水。
有益效果:本发明设计了NG淋病奈瑟菌的引物,采用PCR技术,构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件,可使扩增效率达到最佳。
附图说明
图1是已知阴性样本N1S1、N1S2、N1S4、N1S5、N1S7,已知阳性样本N1S3、N1S8、N1S9电泳图。Mark从下往上依次为100、250、500、750、1000、2000、3000、5000bp、其中最亮的为750bp
图2是样本N1S3、N1S8、N1S9一代测序检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图,进一步阐述本发明。应当注意的是,实施例中未说明的常规条件和方法,通常按照所属领域实验人员常规采用方法:譬如,奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版,或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
检测NG淋病奈瑟菌的试剂盒,包括
(1)检测体系PCR扩增反应液。包括:10×PCR Buffer;2mM dNTPs;KOD FX DNAPolymerase(1U/μl);检测NG上、下游引物NG F1/R1(10μm)。
(2)测序体系反应液,包括测序纯化液(ExoI:0.6U,CIP:1.2U)、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75%乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物:检测NG的上、下游引物分别为NGF1/R1(3.2μm)。
(3)阳性对照品和阴性对照品。
NG上、下游引物序列为:
NG F1:GATGACTTACCTGCCGCTGTT
NG R1:TTGCCTTACTTACTCCGCCATT。
阳性对照品含NG阳性质粒,序列如下:
aacattatggatgacggccgccgcaagatgacttacctgccgctgttcgatgcgtccgaactgaaggcgggggacgaaacgggcggcacggtgcggatacttttgggttcgcccgacaaagagatgaaggaaatttcggaaaaggcggcaaaaaatttcaacatacaatatgtcgcgccgcatccccgccagacctacgggctttccggcgtaaccgcgttaaattcgccctatgtcatcgaagactatattttgcgcgaaattaagaaaaacccgcatacgaggtatgaaatttatacctttttcagcggtgcggcgttgacgatgaaggattttcccaatgtgcacgtttacgcattgaaaccggcttcccttccggaagattattggctcaagcccgtttatgcgctgttccgtcaggccgacattccgattttggcatttgacgataaaaatcaatcgcatggtaaatcaaaatagaaaatggcggagtaagtaaggcaaaaatcaggatatggcgtattttttgaattgaagataatttccgatt;
阴性对照品为去离子水。
实施例2
试剂配置:配制10个配检测体系PCR反应液,每份16μl分装。
加样:加入检测体系PCR反应液中4μl DNA;阳性对照和阴性对照直接加4μl阳性对照品和阴性对照品;空白对照加4μl生理盐水或不加任何物质。
1、PCR体系如下所示:体系20ul
2、PCR扩增程序
其中,引物序列为:
NG F1 GATGACTTACCTGCCGCTGTT
NG R1 TTGCCTTACTTACTCCGCCATT
Sanger测序:
取9μl PCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化:
将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合:
测序反应程序:
沉淀环节:
向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA,静置5min;加入15ml无水乙醇,漩涡混匀;3700rpm离心30min;倒置离心15sec,加入50ml70%乙醇,漩涡混匀;3700rpm离心15min;倒置离心15sec,置于95℃金属浴上;加入10μl HIDI后进行变性试验。变性程序:
变性程序结束后,上测序仪(ABI3730)测序。
结果判断:分别将测序结果与NG参考序列(GenBank:AY953447.1)进行比对,根据实际对结果进行报告。
图1是已知阴性样本N1S1、N1S2、N1S4、N1S5、N1S7,已知阳性样本N1S3、N1S8、N1S9电泳图。Mark从下往上依次为100、250、500、750、1000、2000、3000、5000bp、其中最亮的为750bp
图2是样本N1S3、N1S8、N1S9一代测序检测结果。
序列表
<110> 武汉艾迪康医学检验所有限公司
<120> 检测NG淋病奈瑟菌的引物和试剂盒
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
gatgacttac ctgccgctgt t 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
ttgccttact tactccgcca tt 22
<210> 3
<211> 550
<212> DNA
<213> Niesseria gonorrhoese
<400> 3
aacattatgg atgacggccg ccgcaagatg acttacctgc cgctgttcga tgcgtccgaa 60
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atttccgatt 550
- 检测NG淋病奈瑟菌的引物和试剂盒
- 一种快速检测淋病奈瑟菌的RDA方法及试剂盒